分子生物学第九章DNA重组技术
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DNA重组技术
5’---3‘外切酶活性
发挥生物学活性的条件
（1）DNA模板（可以是单链或双链） （2）带有3`-端游离羟基的引物链 （3）底物和激活剂 注：对双链DNA，当有dNTP存在时， 3`→5` 降解活性会被5`→3`方向的聚合活性所抑 制。 应用：缺口平移法制备DNA分子杂交探针
缺口
DNase I
限制性内切酶的切割方式
5‘侧切割 产生5’粘 端 3‘侧切割 产生3’粘 端 轴外切割 产生平端
II种类和活性
同功异源酶：来源不同但能识别和切 割同一位点的酶。又称同裂酶
同尾酶：识别序列不同，但产生相同粘性末 端的限制酶 酶的活性：酶对DNA水解程度单位： 指1μ g 纯的指定DNA在指定缓冲液中，于 37℃（最适温度更准确）酶解1 h完全酶解 DNA中所有同一限制性内切酶位点所需酶量
DNA聚合酶 I
DNA聚合酶 I
dNTP*
缺口
缺口平移法制备DNA分子探针
3b
Taq DNA聚合酶
显著特点：热稳定性。70℃反应2h残留活性 90 %； 93℃ 反应 2 h残留活性60% ； 94℃ 反应 2 h残留活性40%。
应用： （1）对DNA的特定片段进行体外扩增； （2） DNA序列测定。
二 工具酶1--限制性内切酶
指已被证明是限制修饰系统中的一个组成部 分，具有识别双链DNA分子中的某种特 定核酸序列并由此切割DNA双链结构的 酶 类型：I，III型：由于识别位点并非严 格专一很少被应用 II型是DNA重组技术最为常用的工具酶
II型限制性内切酶的特点
识别位点严格专一 识别序列的碱基数一般为4，6，8个bp 识别位点经常是一种回文序列的DNA 仅需 Mg2+ 作催化反应辅助因子，能识别 双链DNA特殊序列，并可特异切割DNA， 产生特异片段 种类繁多，应用广泛
分子生物学第九章DNA重组技术
四、限制性核酸内切酶的作用
大部分限制性核酸内切酶识别DNA序列具有 回文结构特征，切断的双链DNA都产生5’磷酸基 和3’羟基末端。不同限制性核酸内切酶识别和切 割的特异性不同，结果有三种不同的情况：
①产生3’突出粘性末端（cohesive end）:以 Eoor 为例：
5’…G↓AATT C…3’→5’…Gp OHTTAAC…3’ 3’…C ATAA↑G…5’EooP Ⅰ 3'… CTTAAOH pG…5'
非必需区，替换插入某些标志基因如上述的可供蓝 白筛选lacI-lacZ’序列，和多克隆位点等。由此可构 建出两类λ噬菌体作载体；一类是插入型载体，可 将外来序列插中段，常用的λgt系列载体，一般容 许插入5-7kb外来DNA；另一类是转换型载体，即 可用外来DNA替代中段，如IMBL系列载体。
三、动物病毒载体
Ⅱ类限制性核酸内切酶 与Ⅰ类酶相似，是多亚蛋白 质，既有内切酶活性，又有修饰酶活性，切断位点在识别 序列周围25-30bp范围内，酶促反应除Mg2+外，也需要 ATP供给能量。
Ⅲ类限制性核酸内切酶 只由一条肽链构成，仅需 Mg2+，切割DNA特异性最强，且就在识别位点范围内切 断DNA。是分子生物学中应用最广的限制性内切酶。通常 在重组DNA技术提到的限制性核酸内切酶主要指Ⅱ类酶而 言。
DNA连接酶
连接两个DNA分子或片段
多核苷酸激酶
催化多核苷酸5’羟基末端磷酸化，制备末端 标记探针
末端转移酶
在3’末端加入同质多聚物尾
SI核酸酶，绿豆核 降解单链DNA或RNA，使双链DNA突出端变
酸酶
为平端
DNA端酶Ⅰ
降解DNA，在双链DNA上产生随机切口
第二节 重组DNA载体
DNA重组技术
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② 工具酶
DNA重组技术中对DNA的“精雕细刻”主要用酶作 为工具。分子生物学研究过程中发现的酶，许多 都用作工具，所以称在核酸及有关研究中像基本 工具一样不可缺少的酶类为工具酶。这类酶包括 限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、末 端修饰酶、RNA聚合酶、逆转录酶等。
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限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）
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PCR 的特点及应用： PCR操作简便、省时、灵敏度高、对原始材料的质和 量要求低。因此，广泛应用于许多领域。 1. 基因克隆及定量、扩增特异性片段用于探针、体外 获得突变体、提供大量DNA用于测序等； 2. 遗传病的产前诊断； 3. 致病病原体的检测； 4. 癌基因的检测和诊断； 5. DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别及法医物证； 6. 动、植物检疫； 7. 在转基因动植物中检查植入基因的存在。
限制性核酸内切酶是从细菌中分离提纯的核酸内切酶， 可以识别并切开核酸序列特定位点——分子手术刀； 是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。 是体外剪切基因片段的重要工具，所以常常与核酸聚 合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶； 限制性核酸内切酶不仅是DNA重组中重要的工具，而且 与电泳技术相结合还可以用于基因组酶切图谱的鉴定 以及法医鉴定等。 Arber、Smith和Nathans因为在发现限制性内切酶方面开 创性工作而共同获得了1978年的诺贝尔奖。 13
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6 重组体的转化及鉴定
转化 转化过程是指将DNA重组体或质粒转到适宜的宿主细 胞中。通过这个过程，使目的基因片段得到大量扩 增、或产生需要的基因表达产物、或使宿主生物具 备所需的性状，同时目的基因还能在宿主细胞中稳 定遗传。 若需要让克隆的基因表达和产生大量编码蛋白，可对 转化的大肠杆菌进行扩大培养使目的基因大量表达 和积累。通过对表达产物分离纯化便可获得想要的 产品。
重组dna技术的基本过程
重组dna技术的基本过程
DNA重组技术是一种精密的科学技术，用于研究和设计生物体的基因，是分
子生物学研究的重要工具之一。
其基本过程包括把待改造基因从某族群中分离出来，结合另外一种特定的基因与之混合，使受体细胞能够接受和表达这些掺入的基因，最后进行检测验证，为改良后的生物体的表达提供了可靠的参照。
DNA重组技术的第一步就是选择和收集需要重组的基因。
一般选择一种有特
殊生物效用或表现的有用基因，另一种则是带有某种受体细胞表达机制的靶基因。
其中，靶基因负责携带和传输信息，而受体细胞负责把信息传递给其他细胞，激活基因表达。
然后，可以尝试使用不同的方法来将靶基因与有用基因进行混合，比如用酶联反应来重组基因，或者利用噬菌体法来进行DNA的交叉归并，经过这一步骤，不同的基因就可以完成混合合成组合。
最后，需要将重组的DNA带入到受体细胞中，这里需要使用到受精或体外转
化技术。
通常，科学家会将该细胞暴露于含有药物的生化培养基中，使其具有可接受外源DNA的能力，并继续将待重组的DNA和受体细胞混合，其中受体细胞只
接受含有重组激活基因的DNA，这样就可以把DNA重组合成植物或动物细胞。
最后，需要对新生成的重组体进行评价检测，以验证其中一些特殊性质，这也是DNA重组技术成功的根基。
总而言之，由于DNA重组技术的优势，如创造新的基因表达机理，修改基因
的功能，以及使用较少的原材料来实现重组，已经受到了广泛的应用，特别是在生物质料和医药研究领域。
而在生物制造和药物发现领域，它也是一个重要工具，可以解决很多实际问题。
DNA重组技术概述
至此，用重组DNA技术改变生物学性状的尝 试在1973年由Cohen等人完成。从此，这项技 术为生物学带来了一场深刻的革命，这类技术本 身也迅速地发展起来，并广泛地渗透到各个学科 的研究领域。
一、重组DNA技术相关概念
（一）DNA克隆 克隆（clone） 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。 获取同一拷贝的过程称为克隆化（cloning）,
DNA重组技术概述
路漫漫其悠远
少壮不努力，老大徒悲伤
第一节
DNA的重组
DNA Recombination
基因表达的分子生物学基础
原核细胞的基因是由成 百上千个核苷酸对组成 的。组成基因的核苷酸 序列可以分为不同区段。 在基因表达的过程中， 不同区段所起的作用并 不相同。有的区段能够 转录为相应的信使RNA， 进而指导蛋白质的合成， 也就是说能够编码蛋白 质的区段叫做编码区。 有的区段不能转录为信 使RNA，也就是说不能 编码蛋白质的区段叫做 一个典型的原核细胞基因结构示意图 非编码区。
顺序称为回文结构（palindrome）。
识别序列可以是四核苷酸、六核苷酸或 八核苷酸；产生的切口可以是粘性末端、 平头或钝性末端、配伍末端。 。
５’ ３’
５’ ３’
３’５’ ５’ ３’
３’ ５’ ５’ ３’
３’ ５’
３’ ５’
(三)目的基因
目的基因：用来扩增作研究或生产某一 种蛋白质的基因。就是在重组DNA时，人 们感兴趣的基因或DNA序列，又称目的 DNA(target DNA)。
1973年是基因工程诞生的元年。 1. 1944年Oswald T.Avery等的肺炎球菌转化证 明了DNA是遗传信息携带者。 2. 1953年James Watson和Francis Crick 两人 提出了DNA结构的双螺旋模型，揭示了遗传物质 自我复制的机制。 3. 1961-1965年,科学家破译了生物界全部64个遗 传密码,发表了划时代的遗传密码字典，提出了遗 传信息由DNA→RNA→蛋白质传递的中心法则。 4. 1970年发现了反转录酶，丰富了中心法则，为 cDNA的制备奠定了基础。
一、重组DNA技术相关概念
（一）DNA克隆 克隆（clone） 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。 获取同一拷贝的过程称为克隆化（cloning）,
DNA重组技术概述
路漫漫其悠远
少壮不努力，老大徒悲伤
第一节
DNA的重组
DNA Recombination
基因表达的分子生物学基础
原核细胞的基因是由成 百上千个核苷酸对组成 的。组成基因的核苷酸 序列可以分为不同区段。 在基因表达的过程中， 不同区段所起的作用并 不相同。有的区段能够 转录为相应的信使RNA， 进而指导蛋白质的合成， 也就是说能够编码蛋白 质的区段叫做编码区。 有的区段不能转录为信 使RNA，也就是说不能 编码蛋白质的区段叫做 一个典型的原核细胞基因结构示意图 非编码区。
顺序称为回文结构（palindrome）。
识别序列可以是四核苷酸、六核苷酸或 八核苷酸；产生的切口可以是粘性末端、 平头或钝性末端、配伍末端。 。
５’ ３’
５’ ３’
３’５’ ５’ ３’
３’ ５’ ５’ ３’
３’ ５’
３’ ５’
(三)目的基因
目的基因：用来扩增作研究或生产某一 种蛋白质的基因。就是在重组DNA时，人 们感兴趣的基因或DNA序列，又称目的 DNA(target DNA)。
1973年是基因工程诞生的元年。 1. 1944年Oswald T.Avery等的肺炎球菌转化证 明了DNA是遗传信息携带者。 2. 1953年James Watson和Francis Crick 两人 提出了DNA结构的双螺旋模型，揭示了遗传物质 自我复制的机制。 3. 1961-1965年,科学家破译了生物界全部64个遗 传密码,发表了划时代的遗传密码字典，提出了遗 传信息由DNA→RNA→蛋白质传递的中心法则。 4. 1970年发现了反转录酶，丰富了中心法则，为 cDNA的制备奠定了基础。
DNA重组技术PPT课件
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史密斯在研究流感嗜血杆菌从噬菌体 P22接受DNA的机制时，于1968年发现了一 类新的限制酶，它们分别在特定部位切断 DNA分子，因此可用以研究DNA分子中核 苷酸的顺序和用于DNA重组技术。
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基因载体（简称载体）
主要是质粒和温和噬菌体（见转导）两类。
➢ 1952年，英国微生物遗传学家W．海斯和美国微生物遗传学家 J．莱德伯格等在首先认识到大肠杆菌的F因子是染色体外的遗 传因子。
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基因工程
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DNA重组技术发展简史
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重组DNA技术来源于两个方面的基础理论研究 • 限制性核酸内切酶（简称限制酶） • 基因载体（简称载体）。
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限制性核酸内切酶的发现及其在分子遗传学中的应用
阿尔伯 Wemer Arber 瑞士生物学家 巴塞尔Biozentrum大学
DNA重组技术
徐纪茹
2011-03-01
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概述
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点击输入简要文字内容，文字内容需概括精炼，不用多余 的文字修饰，言简意赅的说明分项内容……
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转化
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接合
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转 导
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融源性转换
DNA重组技术ppt课件
加ＤＮＡse-free的BSA 可以起到稳定酶活性 的作用；
用硅化处理的器皿进行酶切可以提高酶活 性；
酶切所用器皿和ddH2O要经过高温灭菌方可 使用；
ＤＮＡ样品应不含重金属离子
ＤＮＡ片段的胶回收
电泳洗脱法 低熔点琼脂糖凝胶电泳挖块法 冻融回收法 玻璃奶回收法 柱回收法（按说明书进行）
２．于４２℃水浴９０秒。
３．冰浴２分钟。
４．加入８００μl LB液体培养基 ３７℃４５分钟。
５．取２００μl涂布于含Amp(５０μg/ml)琼脂糖平皿， ３７℃培养１２～１６小时，观察结果。
注意事项
-80℃冰箱储存的感受态细胞在5-6周后，转 化率很低。可用一已知标准闭环质粒鉴定 感受态细胞的转化能力。
实验方法
ＤＮＡ分子的体外连接
１．在无菌Eppendorf管中加入以下溶液：
a. 0.1μg质粒载体，２倍分子的外源ＤＮＡ。
b. 加无菌水至7.5μl，于４５℃加温５分钟使重新
退火的粘端解链， 将混合物冷却到０℃。
c. 加入：
１０×Ｔ４ＤＮＡ连接酶buffer Ｔ４ＤＮＡ连接酶
1μl 0. 1μl
并确定并确定??此重组子可转入相应的宿主菌中用于对目的11dna分子的体外连接dna分子的体外连接??dna分子的体外连接就是在一定条件下dna分子的体外连接就是在一定条件下由dna连接酶催化两个双链dna片段由dna连接酶催化两个双链dna片段组邻的5组邻的5端磷酸与3端磷酸与3端羟基之间形成组邻的组邻的端磷酸与端磷酸与磷酸酸脂键的生物化学过程dna分子磷酸酸脂键的生物化学过程dna分子的连接是在酶切反应获得同种酶互补序列的连接是在酶切反应获得同种酶互补序列基础上进行的
高连接效率。
用硅化处理的器皿进行酶切可以提高酶活 性；
酶切所用器皿和ddH2O要经过高温灭菌方可 使用；
ＤＮＡ样品应不含重金属离子
ＤＮＡ片段的胶回收
电泳洗脱法 低熔点琼脂糖凝胶电泳挖块法 冻融回收法 玻璃奶回收法 柱回收法（按说明书进行）
２．于４２℃水浴９０秒。
３．冰浴２分钟。
４．加入８００μl LB液体培养基 ３７℃４５分钟。
５．取２００μl涂布于含Amp(５０μg/ml)琼脂糖平皿， ３７℃培养１２～１６小时，观察结果。
注意事项
-80℃冰箱储存的感受态细胞在5-6周后，转 化率很低。可用一已知标准闭环质粒鉴定 感受态细胞的转化能力。
实验方法
ＤＮＡ分子的体外连接
１．在无菌Eppendorf管中加入以下溶液：
a. 0.1μg质粒载体，２倍分子的外源ＤＮＡ。
b. 加无菌水至7.5μl，于４５℃加温５分钟使重新
退火的粘端解链， 将混合物冷却到０℃。
c. 加入：
１０×Ｔ４ＤＮＡ连接酶buffer Ｔ４ＤＮＡ连接酶
1μl 0. 1μl
并确定并确定??此重组子可转入相应的宿主菌中用于对目的11dna分子的体外连接dna分子的体外连接??dna分子的体外连接就是在一定条件下dna分子的体外连接就是在一定条件下由dna连接酶催化两个双链dna片段由dna连接酶催化两个双链dna片段组邻的5组邻的5端磷酸与3端磷酸与3端羟基之间形成组邻的组邻的端磷酸与端磷酸与磷酸酸脂键的生物化学过程dna分子磷酸酸脂键的生物化学过程dna分子的连接是在酶切反应获得同种酶互补序列的连接是在酶切反应获得同种酶互补序列基础上进行的
高连接效率。
分子生物学技术之DNA重组技术
书山有路勤为径， 学海无涯苦作舟
•
书山有路勤为径， 学海无涯苦作舟
•
•大肠杆 菌 pSC101 质粒载体 示意图。
•
•是第一个真核基因克隆载体。缺点：它是一种 严紧型复制控制的低拷贝质粒，从带有该质粒 的寄主细胞中提取pSC101 DNA，产量很低。
书山有路勤为径， 学海无ห้องสมุดไป่ตู้苦作舟
•
• 2、ColE1质粒载体
•第一个核酸内切酶EcoRI是Boyer实验室在 1972年发现的，它能特异性识别GAATTC序 列，将双链DNA分子在这个位点切开并产生 具有粘性末端的小片段。
书山有路勤为径， 学海无涯苦作舟
•
•图5-1 几种主要DNA内切酶所识别的序列及
其酶切末端。
书山有路勤为径， 学海无涯苦作舟
•
书山有路勤为径， 学海无涯苦作舟
• 松弛型复制控制的多拷贝质粒。
• 一般情况下，当培养基中氨基酸被耗尽，或 是在细胞培养物中加入氯霉素以抑制蛋白质 的合成，寄主染色体DNA的复制便被抑制， 细胞的生长也随之停止。
• 而松弛型质粒DNA却继续复制数小时，使每
个寄主细胞中ColE1质粒的拷贝数达到
1000~3000个，占细胞总DNA的50%左右。
书山有路勤为径， 学海无涯苦作舟
•
•AmpR
书山有路勤为径， 学海无涯苦作舟
•
•优点是具有较小的分子量，其长度为4 363bp。 不仅易于纯化，而且即使携带上一段6-8kb的外 源DNA片段，操作起来仍较为便利。
•具有两种抗生素抗性基因以用作转化子的选择 记号。有较高的拷贝数，若经过氯霉素扩增， 每个细胞中可累积1000~3000个拷贝，为重组体 DNA的制备提供了极大的方便。
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在重组DNA技术提到的限制性核酸内切酶主要指Ⅱ类酶而
言。
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四、限制性核酸内切酶的作用
大部分限制性核酸内切酶识别DNA序列具有 回文结构特征，切断的双链DNA都产生5’磷酸基 和3’羟基末端。不同限制性核酸内切酶识别和切 割的特异性不同，结果有三种不同的情况：
DNA连接酶
连接两个DNA分子或片段
多核苷酸激酶
催化多核苷酸5’羟基末端磷酸化，制备末端 标记探针
末端转移酶
在3’末端加入同质多聚物尾
SI核酸酶，绿豆核 降解单链DNA或RNA，使双链DNA突出端变
酸酶
为平端
DNA端酶Ⅰ
降解DN完A整，版课在件双ppt 链DNA上产生随机切口23
第二节 重组DNA载体
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二、限制性核酸内切酶的命名
按酶的来源的属、种名而定，取属名 的第一个字母与种名的头两个字母组成的 三个斜体字母作略语表示；如有株名，再 加上一个字母，其后再按发现的先后写上 罗马数字。例如：从流感嗜血杆菌d株 （Haemophilus influenzae d）中先后分离 到3种限制酶，则分别命名为HindⅠ、 HindⅡ和HindⅢ。
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基因工程属于生物技术范畴，广义的生物技术指任 何利用活的生物体或其一部分生产产品或改良生物 品质的技术；狭义的生物技术是专指以DNA重组技 术和单克隆技术为标志发展起来的新技术。一般认 为这新的生物技术包括基因工程、细胞工程、酶工 程和发酵工程几方面的内容。基因工程是生物技术 的核心和关键，是主导技术；细胞技术是生物技术 的基础；酶工程是生物技术的条件；发酵工程是生 物技术获得最终产品的手段，四个方面相互联系的。 生物技术是一个综合技术体系，其中基因工程和细 胞融合技术最为突出。蛋白质工程则是在基因工程 基础上综合蛋白质化学、蛋白质晶体学、计算机学 辅助设计等知识和技术发展起来的研究新领域，开 创了按人类意愿设计和研制人类需要的蛋白质的新 时期，被称为第二代基因工程。
①产生3’突出粘性末端（cohesive end）:以 Eoor 为例：
5’…G↓AATT C…3’→5’…Gp OHTTAAC…3’
3’…C ATAA↑G…5’EooP Ⅰ 3'… CTTAAOH pG…5'
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②产生5’突出的粘性末端：以PstⅠ为例：
5’…CTGCA↓G…3’→5’…CTGCAp OHG…3’
Ⅱ类限制性核酸内切酶 与Ⅰ类酶相似，是多亚蛋白 质，既有内切酶活性，又有修饰酶活性，切断位点在识别
序列周围25-30bp范围内，酶促反应除Mg2+外，也需要 ATP供给能量。
Ⅲ类限制性核酸内切酶 只由一条肽链构成，仅需
Mg2+，切割DNA特异性最强，且就在识别位点范围内切
断DNA。是分子生物学中应用最广的限制性内切酶。通常
第九章 DNA重组技术
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对多数生物来说，基因本质是DNA，基 因工程就是要改建DNA，涉及DNA序列 的重新组合和建造，所以基因工程的核 心就是人工的DNA重组（
重组、建造的DNA分子只有纯化繁殖才 有意义。纯的无性繁殖系统称为克隆。 纯化繁殖DNA就称为DNA克隆或分子克 隆，基因的纯化繁殖就称为基因克隆。 所以DNA重组和分子克隆是与基因工程 密切不可分的，是基因工程技术的核心 和主要组成部分。重组DNA、分子克隆 甚至成了基因工程的代名词。
理想的基因工程载体一般至少有以下几点要求：
①能在宿主细胞中复制繁殖，而且最好要有较高的自 主复制能力。
②容易进入宿主细胞，而且进入效率越高越好。
③容易插入外来核酸片段，插入后不影响其进入宿主 细胞和在细胞中的复制。这就要求载体DNA上要有合适的 限制性核酸内切酶位点。
④容易从宿主细胞中分离纯化出来， 这才便于重组 操作。
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第一节 工具酶
一、限制性核酸内切酶的概念
核酸酶可分为两类：核酸外切酶是从核酸的一 端开始，一个接一个把核苷酸水解下来；核酸内切 酶则从核酸链中间水解3’，5’磷酸二酯键，将核酸 链切断。很多细菌和细胞中都能识别外来的核酸并 将其分解，1962年发现这是因为细菌中含有特异 的核酸内切酶,能识别特定的核酸序列而将核酸切 断;同时又伴随有特定的核酸修饰酶,最常见的是甲 基化酶,能使细胞自身核酸特定的序列上碱基甲基 化,从而避免受内切酶水解,外来核酸没有这种特异 的甲基化修饰,就会被细胞的核酸酶所水解.这样细 胞就构成了限制一修饰体系,其功能就是保护自身 的DNA,分解外来的DNA,以保护和维持自身遗传信 息的稳定。
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三、限制性核酸内切酶的分类
按限制酶的组成、与修饰酶活性关系，切断核酸的情 况不同，分为三类：
Ⅰ类限制性核酸内切酶 由3种不同亚基构成，兼具 有修饰酶活性和依赖于ATP的限制性内切酶活性，它能识 别和结合于特定的DNA序列位点，去随机切断在识别位点 以外的DNA序列，通常在识别位点周围400-700bp。这类 酶的作用需要Mg2+，S腺苷甲硫氨酸及ATP。
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DNA重组技术中最常用的工具酶
酶
主要用途
限制性核酸内切酶 识别DNA特定序列，切断DNA链
DNA聚合酶Ⅰ 或 其大片段 （Klenow）
①缺口平移制作标记DNA探针 ②合成cDNA 的第二链 ③填补双链DNA3’凹端 ④DNA 序列分析
耐热DNA聚合酶 聚合酶链反应（PCR） （Taq DNA聚合酶
3’…G↑ACGTC…5’PstⅠ 3’…GOH pACGTC…5
③产生平末端（blunt end）:Nru Ⅰ为例：
5’…TCG↓CGA…3’→5’…TCGp OHCGA…3’
3’…AGC↑GCT…5’Nru Ⅰ3’…AGCOh pGCT…5’
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⑤有容易被识别筛选的标志，当其进入宿主细胞、或 携带着外来的核酸序列进入宿主细胞都能容易被辨认和分 离出来。这才介于克隆操作。