高效液相色_PPT幻灯片
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液相色谱法ppt课件
二、液相色谱分离原理及分类 和气相色谱一样，液相色谱分离系统也由两相——固定
相和流动相组成。液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学键 合固定相（或在惰性载体表面涂上一层液膜）、离子交换树 脂或多孔性凝胶；流动相是各种溶剂。被分离混合物由流动 相液体推动进入色谱柱。根据各组分在固定相及流动相中的 吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异 进行分离。色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶
分子筛及聚酰胺等。非极性吸附剂最常见的是活性炭。 极性吸附剂可进一步分为酸性吸附剂和碱性吸附剂。酸性
吸附剂包括硅胶和硅酸镁等，碱性吸附剂有氧化铝、氧化
21
第四节 液—固色谱法
镁和聚酰胺等。酸性吸附剂适于分离碱，如脂肪胺和芳香胺。 碱性吸附剂则适于分离酸性溶质，如酚、羧和吡咯衍生物等。
各种吸附剂中，最常用的吸附剂是硅胶，其次是氧化铝。
5
第一节 概 述
等，作为分析时选择余地大；而气相色谱并不可 能的。
③ 液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般 有利于色谱分离条件的选择。 （3）由于液体的扩散性比气体的小105倍，因此，溶质 在液相中的传质速率慢，柱外效应就显得特别重要；而 在气相色谱中，柱外区域扩张可以忽略不计。 （4）液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易， 而且回收是定量的，适合于大量制备。但液相色谱尚缺 乏通用的检测器，仪器比较复杂，价格昂贵。在实际应 用中，这两种色谱技术是互相补充的。
所用的固定相柱效低，分析周期长。而现代液相色谱法引用 了气相色谱的理论，流动相改为高压输送（最高输送压力可 达4.9107Pa）;谱（每米塔板数可达几 万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流
1
第一节 概 述
出物进行连续检测。因此，高效液相色谱具有分析速度快、 分离效能高、自动化等特点。所以人们称它为高压、高速、 高效或现代液相色谱法。
相和流动相组成。液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学键 合固定相（或在惰性载体表面涂上一层液膜）、离子交换树 脂或多孔性凝胶；流动相是各种溶剂。被分离混合物由流动 相液体推动进入色谱柱。根据各组分在固定相及流动相中的 吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异 进行分离。色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶
分子筛及聚酰胺等。非极性吸附剂最常见的是活性炭。 极性吸附剂可进一步分为酸性吸附剂和碱性吸附剂。酸性
吸附剂包括硅胶和硅酸镁等，碱性吸附剂有氧化铝、氧化
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第四节 液—固色谱法
镁和聚酰胺等。酸性吸附剂适于分离碱，如脂肪胺和芳香胺。 碱性吸附剂则适于分离酸性溶质，如酚、羧和吡咯衍生物等。
各种吸附剂中，最常用的吸附剂是硅胶，其次是氧化铝。
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第一节 概 述
等，作为分析时选择余地大；而气相色谱并不可 能的。
③ 液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般 有利于色谱分离条件的选择。 （3）由于液体的扩散性比气体的小105倍，因此，溶质 在液相中的传质速率慢，柱外效应就显得特别重要；而 在气相色谱中，柱外区域扩张可以忽略不计。 （4）液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易， 而且回收是定量的，适合于大量制备。但液相色谱尚缺 乏通用的检测器，仪器比较复杂，价格昂贵。在实际应 用中，这两种色谱技术是互相补充的。
所用的固定相柱效低，分析周期长。而现代液相色谱法引用 了气相色谱的理论，流动相改为高压输送（最高输送压力可 达4.9107Pa）;谱（每米塔板数可达几 万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流
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第一节 概 述
出物进行连续检测。因此，高效液相色谱具有分析速度快、 分离效能高、自动化等特点。所以人们称它为高压、高速、 高效或现代液相色谱法。
高效液相色谱法培训PPT课件
chromatography）。
8
手性色谱(chiral chromatography) 用于分离手性药物对映体的一种有效技 术，可分为直接法和间接法两类： 直接法 手性固定相法（chiral stationary phase;CSP) 手性流动相法(chiral mobile phase additive;CMPA) 间接法—手性试剂衍生化法 chiral derivatization reagent,CDR)
离子对色谱（ion pair chromatography）— —将反离子加入流动相中，与呈解离状态的被 测物作用，生成脂溶性的中性离子对络合物， 从而增加了被测物在非极性固定相中的溶解度， 改善分离效果，达到分离目的。
常用反离子有：季铵盐 ——用于酸类 烷基磺酸盐——用于碱类
5
离子色谱法（ ion chromatography ） 离子色谱是由经典的离子交换色谱 发展起来的一种液相色谱技术，利 用物质在离子交换柱上迁移的差异 而达到分离，用于亲水性阴阳离子 的测定。根据是否采用抑制柱，可 分为抑制型离子色谱和非抑制型离 子色谱。
本法中流动相在检测前已蒸发，故梯度 洗脱基线稳定。
45
喷雾 蒸发 检测
色谱柱流出物
N2
组分的 气溶胶
溶剂 光 源
泵
水不注
、 醋 酸 。
能 含 缓 冲 盐 ， 若 调 节
意
： 流 动 相 必 须 是 挥
pH
发
可性
用的
氨，
46
质 谱 检 测 器
47
Flu
10%
Ms
1%
other 4%
Conduc 5%
1
第一节 概述
8
手性色谱(chiral chromatography) 用于分离手性药物对映体的一种有效技 术，可分为直接法和间接法两类： 直接法 手性固定相法（chiral stationary phase;CSP) 手性流动相法(chiral mobile phase additive;CMPA) 间接法—手性试剂衍生化法 chiral derivatization reagent,CDR)
离子对色谱（ion pair chromatography）— —将反离子加入流动相中，与呈解离状态的被 测物作用，生成脂溶性的中性离子对络合物， 从而增加了被测物在非极性固定相中的溶解度， 改善分离效果，达到分离目的。
常用反离子有：季铵盐 ——用于酸类 烷基磺酸盐——用于碱类
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离子色谱法（ ion chromatography ） 离子色谱是由经典的离子交换色谱 发展起来的一种液相色谱技术，利 用物质在离子交换柱上迁移的差异 而达到分离，用于亲水性阴阳离子 的测定。根据是否采用抑制柱，可 分为抑制型离子色谱和非抑制型离 子色谱。
本法中流动相在检测前已蒸发，故梯度 洗脱基线稳定。
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喷雾 蒸发 检测
色谱柱流出物
N2
组分的 气溶胶
溶剂 光 源
泵
水不注
、 醋 酸 。
能 含 缓 冲 盐 ， 若 调 节
意
： 流 动 相 必 须 是 挥
pH
发
可性
用的
氨，
46
质 谱 检 测 器
47
Flu
10%
Ms
1%
other 4%
Conduc 5%
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第一节 概述
高效液相色谱法案例.pptx
本品每1ml含黄芩以黄芩苷（C21H18O11）计，不得少于10.0mg。 【规格】每支装（1）10ml（每1ml相当于饮片1.5g） （2）20ml（每1ml相当于饮片1.5g） （3）10ml（每1ml相当于饮片3.0g） 讨论：1.如何配制流动相？
2.试写出其计算格式。
谢谢 ！
制作人 卓菊
• 讨论：1.测定方法的不同，是否会影响药品的质量？ 2.检测方法的变化是否会影响检测结果？ 3.先进的检测技术，在保障人民用药安全、有效方面，有何重要性？
• 《中国药典》规定，三黄片中盐酸小檗碱的测定方法是高效液相色谱 法，试分析其不符合规定的原因。
案例：双黄连口服液中黄芩苷的测定
【含量测定】黄芩 照高效液相色谱法（通则0512）测定。 色谱条件与系统适用性试验 ：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水-冰醋酸（50:50:1）为流动相； 检测波长为274nm。理论板数按黄芩苷峰计算应不低于1500。 对照品溶液的制备： 取黄芩苷对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得。 供试品溶液的制备： 精密量取本品1ml，置50ml量瓶中，加50%甲醇适量，超声处理20分钟，放置至室温， 加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。 测定法 ：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
《中药制剂分析》
高效液相色谱法-案例
含量测定方法
• 案例：随着方法学的进一步研究，同一种药物制剂的检测方法在不同版《中国 药典》可能存在变化，例如止咳宝片、》2005年版采用的是紫外-可见分光光度法，《中国药典》 2015年版采用的是高效液相色谱法。
2.试写出其计算格式。
谢谢 ！
制作人 卓菊
• 讨论：1.测定方法的不同，是否会影响药品的质量？ 2.检测方法的变化是否会影响检测结果？ 3.先进的检测技术，在保障人民用药安全、有效方面，有何重要性？
• 《中国药典》规定，三黄片中盐酸小檗碱的测定方法是高效液相色谱 法，试分析其不符合规定的原因。
案例：双黄连口服液中黄芩苷的测定
【含量测定】黄芩 照高效液相色谱法（通则0512）测定。 色谱条件与系统适用性试验 ：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水-冰醋酸（50:50:1）为流动相； 检测波长为274nm。理论板数按黄芩苷峰计算应不低于1500。 对照品溶液的制备： 取黄芩苷对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得。 供试品溶液的制备： 精密量取本品1ml，置50ml量瓶中，加50%甲醇适量，超声处理20分钟，放置至室温， 加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。 测定法 ：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
《中药制剂分析》
高效液相色谱法-案例
含量测定方法
• 案例：随着方法学的进一步研究，同一种药物制剂的检测方法在不同版《中国 药典》可能存在变化，例如止咳宝片、》2005年版采用的是紫外-可见分光光度法，《中国药典》 2015年版采用的是高效液相色谱法。
高效液相色谱分析ppt课件
选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性
2019/7/7
2019/7/7
影响色谱峰扩展及分离的因素
• 基本概念及基础理论同气相色谱：保留值、分 配系数、分配比、分离度、选择性因子(分离 因子)、塔板理论及速率理论。
• 由于流动相的差别，对色谱过程必然产生影响。
2019/7/7
2019/7/7
二、液-固吸附色谱
liquid-solid adsorption chromatography
固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使 用的是5～10μm的硅胶吸附剂；
流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸； 适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有 官能团的化合物和异构体有较高选择性； 缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；
sm
注：只考虑流动相和静态流动相的传质阻抗
忽略固定相传质阻抗
HPLC：H A Cm u Csm u
dp 2 Cm Csm Dm
dp 2 C
Dm
T Dm
dp C H ，n 柱效
Dm H ，n 柱效 T Dm C ，但易产生气泡 T Dm ， ，柱阻
3. 经常在室温条件下操作 气相色谱法一般在较高温度下进行
缺点：仪器设备费用昂贵，操作严格。
2019/7/7
与GC相比，流动相差别
GC：流动相为惰性气体 组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 HPLC：流动相为液体 流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、
改善分离度增加了因素，对分离起很大作用 流动相种类较多，选择余地广 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用
2019/7/7
2019/7/7
影响色谱峰扩展及分离的因素
• 基本概念及基础理论同气相色谱：保留值、分 配系数、分配比、分离度、选择性因子(分离 因子)、塔板理论及速率理论。
• 由于流动相的差别，对色谱过程必然产生影响。
2019/7/7
2019/7/7
二、液-固吸附色谱
liquid-solid adsorption chromatography
固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使 用的是5～10μm的硅胶吸附剂；
流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸； 适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有 官能团的化合物和异构体有较高选择性； 缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；
sm
注：只考虑流动相和静态流动相的传质阻抗
忽略固定相传质阻抗
HPLC：H A Cm u Csm u
dp 2 Cm Csm Dm
dp 2 C
Dm
T Dm
dp C H ，n 柱效
Dm H ，n 柱效 T Dm C ，但易产生气泡 T Dm ， ，柱阻
3. 经常在室温条件下操作 气相色谱法一般在较高温度下进行
缺点：仪器设备费用昂贵，操作严格。
2019/7/7
与GC相比，流动相差别
GC：流动相为惰性气体 组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 HPLC：流动相为液体 流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、
改善分离度增加了因素，对分离起很大作用 流动相种类较多，选择余地广 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用
高效液相色谱HPLC简介.ppt
种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不
同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。
2
操作过程图示
3
色谱分离的机理
分离是一个 物理的过程。
固定相(Stationary Phase) 流动相(Mobile Phase) 样品 (溶解于流动相中的溶质)
4
项目 进样方式 流动相 分离原理 检测器
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液-液分配色谱
固定相与流动相均为液体（互不相溶）； 基本原理：组分在固定相和流动相上的分配； 流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定 液的极性（正相 normal phase），反之，流动相的极性大于固定液的极性 （反相 reverse phase）。正相与反相的出峰顺序相反； 固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用； 化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的 游离羟基上。反相键合相色谱柱最常用的就是ODS柱，也就是C18柱。
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液相色谱类型
• 正相色谱：固定相为极性，流动相为非极性。 • 反相色谱：固定相为非极性，流动相为极性。用的最多，约占60～70％。
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色谱柱简介
• 正相柱------固定相通常为硅胶以及其他具有极性官能团胺基团，如（NH2） 和氰基团（CN）的键合相填料。 由于硅胶表面的硅羟基（SiOH）或其他极性基团极性较强，因此，分离 的次序是依据样品中各组分的极性大小，即极性较弱的组份最先被冲洗出色 谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如正已烷，氯仿，二氯 甲烷等。
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检测器简介（二）
◆ 电导检测器（ECD） 原理：监测溶液的电导率变化的检测器。 特点：选择性检测器、测量时要求恒温、对流动相的组成变化有明显响应、 灵敏度低（10-3g）。适用于离子型化合物。
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W：峰宽 ； σ：曲线拐点处峰宽的一半，即 峰高0.607处峰宽的一半。
保留时间（retention time,tR）：从进样开 始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时 间。
分离度（resolution,R）：相邻两峰的保留 时间之差与平均峰宽的比值。也叫分辨率， 表示相邻两峰的分离程度。
拖尾因子（tailing factor,T）：T=B/A,用以 衡量色谱峰的对称性。也称为对称因子 （symmetry factor）或不对称因子。
预柱与保护柱：
在体内药物分析中，为延长色谱柱的使用 寿命，不降低柱效，常在进样器前装一根 预柱，其作用是平衡流动相和吸附流动相 中的杂质，使其不污染分析柱。
为了防止分析柱被较脏的样品和流动相中 的杂质污染，常在进样器与分析柱之间， 装一根填料与分析柱完全相同的短柱作为 保护柱。
保护柱 （预柱）
(二) 进样器
进样阀（六通阀）、自动进样装置
六
通
进
样
进样针
阀
流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的 六通阀进样装置，其结构如图所示：
(三) 色谱柱
由柱管和固定相组成 分析柱、制备柱 性能评价
比如色谱柱的分离效率、对指定溶质的选择性、在不 同PH介质中的稳定性、重现性、色谱柱压力、柱子 的样品负载量、回收率等等。 通常，以指定的一组标准溶质为样品，测定他们在 柱子上的理论塔板数，作为柱效的衡量指标。
工作原理：复光通过流通池，再进入单色器，分 光后照射在二极管阵列装置上，同时获得各波长 的信号强度，即获得组分的吸收光谱。获得三维 光谱－色谱图。
用途：吸收光谱用于组分的定性，色谱峰面积用 于定量,判断峰纯度。
（三）荧光检测器(fluorescence detector；FD)
特点：
选择性好，专属型检测器； 灵敏度比紫外检测器高（检测限10-10 g/ml）。
专属型、浓度型检测器
紫外检测器举例：
1）固定波长检测器 ：254nm。 2）可变波长检测器：
光源：氘灯（和钨灯）， 200~400（800） nm，单色器，流通池（试样），光电管。
3）光电二极管阵列检测器 (PDAD)：
系列光电二极管，一个二极管对应接受光谱上
约1nm谱带宽的单色光。
光电二极管阵列 检测器：
检测原理：
朗伯－比尔 (Lambert-Beer) 定律，响应信号
（吸光度）与浓度成正比（A=εCl）
特点：
灵敏度较高（10-6—10-9 g/ml），噪音低，线性 范围宽，稳定性好，适于梯度，不破坏样品，应 用广（分析、制备）。
局限：
只能检测有紫外吸收的物质，流动相的截止波长 应小于检测波长。
tR t0(1KVSm) kK S Vm
死时间(dead time，t0)：不保留组分的保留时间。 即流动相（溶剂）通过色谱柱的时间。
保留时间(retention time，tR)：从进样开始到某 个组分在柱后出现浓度极大值的时间。
死体积(dead volume，V0)：由进样器进样口到检 测器流动池未被固定相所占据的空间。它包括4部 分：进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒 间隙（被流动相占据，Vm）、柱出口管路体积、 检测器流动池体积。其中只有Vm参与色谱平衡过 程，其它3部分只起峰扩展作用。
液相色谱分析工作站
一、概述
高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)是20世纪60年代末迅速 发展的一种新型分离、分析技术。它是以经典液 相色谱为基础，以微粒型填料作固定相，采用高 压送液泵和各种高灵敏度检测器。
HPLC法具有分离效能高、分析速度快、检测灵 敏度高等特点。
制备色谱柱
(ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ) 检测器
检测器连在色谱柱的出门端，被色谱柱分 离后的样品各组分随流动相流入检测器， 样品中的各组分在流动相中的浓度或物理 量的变化，由检测器连续地转换成电信号， 在记录器上迅速的给出直观信息。
理想情况是对所有流出组分都有高的灵敏 度，而且呈线性响应，才可以作定量分析。
1. 紫外检测器
对于无荧光的物质可进行衍生化处理。
（四）电化学检测器（ECD） （五）蒸发光检测器（ELSD）
三、色谱分离原理
（一）液固吸附色谱法（LSC） （二）液液分配色谱法（LLC） （三）离子色谱法（IC） （四）空间排阻色谱法（SEC）
（ 一）液固吸附色谱法（LSC）
1．分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附 活性中心能力的差异。
自HPLC问世以来，在医学、药学、环境卫生等 领域的应用日益普遍，其中对药物动力学、生物 药剂学、临床药学研究的重要性越来越突出。
（一）输液泵
输液泵的作用是产生高压输送流动相。目前多数HPLC仪采 用柱塞往复泵，柱塞向前运动流动相溶剂输出，流向色谱 柱；柱塞向后运动，将输液瓶中的溶剂吸人缸体；如此前 后往复运动，将流动相溶剂源源不断的输送到色谱柱。
理论塔板数（theoretical plate number,N）用 于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效）。
N取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径 分布等）、填充状况、柱长、流动相的种类 和流速及测定柱效所用物质的性质。
如果峰形对称并符合正态分布，N可近似表 示为： N=（tR/σ）2=16(tR)2/W =5.54(tR/W1/2)2。
紫外检测器(ultraviolet detector，UV)是在体 内药物分析中应用最广泛的检测器，是 HPLC仪上最常用的一种检测器，适用于被 测样品组分的分子结构中含有π-π共轭及n-π 共轭药物的检测。
这种检测器具有很高的灵敏度，对环境温 度及流速波动不太敏感，适用于梯度洗脱 操作。
紫外检测器(ultraviolet detector)
分配系数(distribution coefficient，K)：在一定温 度下，化合物在两相间达到分配平衡时，在固定 相与流动相中的浓度之比。
2．固定相
（1）硅胶 表孔硅胶（薄壳硅胶）
全多孔硅胶 无定形 YWG 球形 YQG
堆积硅珠 YQG 3~4 μm
原理：吸附 特点：峰易拖尾 适用：分离极性化合物
保留时间（retention time,tR）：从进样开 始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时 间。
分离度（resolution,R）：相邻两峰的保留 时间之差与平均峰宽的比值。也叫分辨率， 表示相邻两峰的分离程度。
拖尾因子（tailing factor,T）：T=B/A,用以 衡量色谱峰的对称性。也称为对称因子 （symmetry factor）或不对称因子。
预柱与保护柱：
在体内药物分析中，为延长色谱柱的使用 寿命，不降低柱效，常在进样器前装一根 预柱，其作用是平衡流动相和吸附流动相 中的杂质，使其不污染分析柱。
为了防止分析柱被较脏的样品和流动相中 的杂质污染，常在进样器与分析柱之间， 装一根填料与分析柱完全相同的短柱作为 保护柱。
保护柱 （预柱）
(二) 进样器
进样阀（六通阀）、自动进样装置
六
通
进
样
进样针
阀
流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的 六通阀进样装置，其结构如图所示：
(三) 色谱柱
由柱管和固定相组成 分析柱、制备柱 性能评价
比如色谱柱的分离效率、对指定溶质的选择性、在不 同PH介质中的稳定性、重现性、色谱柱压力、柱子 的样品负载量、回收率等等。 通常，以指定的一组标准溶质为样品，测定他们在 柱子上的理论塔板数，作为柱效的衡量指标。
工作原理：复光通过流通池，再进入单色器，分 光后照射在二极管阵列装置上，同时获得各波长 的信号强度，即获得组分的吸收光谱。获得三维 光谱－色谱图。
用途：吸收光谱用于组分的定性，色谱峰面积用 于定量,判断峰纯度。
（三）荧光检测器(fluorescence detector；FD)
特点：
选择性好，专属型检测器； 灵敏度比紫外检测器高（检测限10-10 g/ml）。
专属型、浓度型检测器
紫外检测器举例：
1）固定波长检测器 ：254nm。 2）可变波长检测器：
光源：氘灯（和钨灯）， 200~400（800） nm，单色器，流通池（试样），光电管。
3）光电二极管阵列检测器 (PDAD)：
系列光电二极管，一个二极管对应接受光谱上
约1nm谱带宽的单色光。
光电二极管阵列 检测器：
检测原理：
朗伯－比尔 (Lambert-Beer) 定律，响应信号
（吸光度）与浓度成正比（A=εCl）
特点：
灵敏度较高（10-6—10-9 g/ml），噪音低，线性 范围宽，稳定性好，适于梯度，不破坏样品，应 用广（分析、制备）。
局限：
只能检测有紫外吸收的物质，流动相的截止波长 应小于检测波长。
tR t0(1KVSm) kK S Vm
死时间(dead time，t0)：不保留组分的保留时间。 即流动相（溶剂）通过色谱柱的时间。
保留时间(retention time，tR)：从进样开始到某 个组分在柱后出现浓度极大值的时间。
死体积(dead volume，V0)：由进样器进样口到检 测器流动池未被固定相所占据的空间。它包括4部 分：进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒 间隙（被流动相占据，Vm）、柱出口管路体积、 检测器流动池体积。其中只有Vm参与色谱平衡过 程，其它3部分只起峰扩展作用。
液相色谱分析工作站
一、概述
高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)是20世纪60年代末迅速 发展的一种新型分离、分析技术。它是以经典液 相色谱为基础，以微粒型填料作固定相，采用高 压送液泵和各种高灵敏度检测器。
HPLC法具有分离效能高、分析速度快、检测灵 敏度高等特点。
制备色谱柱
(ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ) 检测器
检测器连在色谱柱的出门端，被色谱柱分 离后的样品各组分随流动相流入检测器， 样品中的各组分在流动相中的浓度或物理 量的变化，由检测器连续地转换成电信号， 在记录器上迅速的给出直观信息。
理想情况是对所有流出组分都有高的灵敏 度，而且呈线性响应，才可以作定量分析。
1. 紫外检测器
对于无荧光的物质可进行衍生化处理。
（四）电化学检测器（ECD） （五）蒸发光检测器（ELSD）
三、色谱分离原理
（一）液固吸附色谱法（LSC） （二）液液分配色谱法（LLC） （三）离子色谱法（IC） （四）空间排阻色谱法（SEC）
（ 一）液固吸附色谱法（LSC）
1．分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附 活性中心能力的差异。
自HPLC问世以来，在医学、药学、环境卫生等 领域的应用日益普遍，其中对药物动力学、生物 药剂学、临床药学研究的重要性越来越突出。
（一）输液泵
输液泵的作用是产生高压输送流动相。目前多数HPLC仪采 用柱塞往复泵，柱塞向前运动流动相溶剂输出，流向色谱 柱；柱塞向后运动，将输液瓶中的溶剂吸人缸体；如此前 后往复运动，将流动相溶剂源源不断的输送到色谱柱。
理论塔板数（theoretical plate number,N）用 于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效）。
N取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径 分布等）、填充状况、柱长、流动相的种类 和流速及测定柱效所用物质的性质。
如果峰形对称并符合正态分布，N可近似表 示为： N=（tR/σ）2=16(tR)2/W =5.54(tR/W1/2)2。
紫外检测器(ultraviolet detector，UV)是在体 内药物分析中应用最广泛的检测器，是 HPLC仪上最常用的一种检测器，适用于被 测样品组分的分子结构中含有π-π共轭及n-π 共轭药物的检测。
这种检测器具有很高的灵敏度，对环境温 度及流速波动不太敏感，适用于梯度洗脱 操作。
紫外检测器(ultraviolet detector)
分配系数(distribution coefficient，K)：在一定温 度下，化合物在两相间达到分配平衡时，在固定 相与流动相中的浓度之比。
2．固定相
（1）硅胶 表孔硅胶（薄壳硅胶）
全多孔硅胶 无定形 YWG 球形 YQG
堆积硅珠 YQG 3~4 μm
原理：吸附 特点：峰易拖尾 适用：分离极性化合物