柠檬酸发酵机制
柠檬酸发酵的原理
柠檬酸发酵的原理柠檬酸是一种有机酸，化学式为C6H8O7。
它常见于柠檬、橙、柚子等柑橘类水果中，具有酸味和鲜味。
柠檬酸的发酵是指通过微生物在适宜环境条件下对柠檬酸底物进行代谢分解，产生新的化合物、气体或能量的过程。
柠檬酸发酵的过程可以分为两个阶段：引入柠檬酸菌和发酵反应。
首先，柠檬酸发酵的关键是引入柠檬酸菌。
柠檬酸菌是一类嗜酸性细菌，它们广泛存在于自然界中，常见于各种水果、土壤、植物等环境中。
这些细菌具有代谢柠檬酸的能力，并能分解柠檬酸为其他代谢产物。
在适宜的生长条件下，柠檬酸菌会在培养基中生长和繁殖。
柠檬酸菌需要一定的温度、pH值以及营养物质供应，如碳源、氮源、矿物盐等。
这些条件对于维持菌体生长和代谢活性都非常重要。
当柠檬酸菌引入培养基后，它们会开始与柠檬酸底物进行代谢，进而引发柠檬酸的发酵。
柠檬酸发酵可产生以下代谢产物。
首先，柠檬酸菌代谢柠檬酸的初始酶是柠檬酸酶，将柠檬酸分解为顺式-脱氢异柠檬酸。
柠檬酸酶存在于柠檬酸菌的细胞内。
随后，顺式-脱氢异柠檬酸经过酶促反应被还原为'顺式'脱氢酶异柠檬酸，再被脱氢酶反应转化为柠檬酸。
接下来，由于柠檬酸发酵过程中柠檬酸的分解和合成是相互竞争的，此时代谢产物多取决于柠檬酸菌生长条件的调节。
在有氧条件下（即有足够的氧气供应），柠檬酸将被完全代谢为二氧化碳和水，释放能量。
此时发酵的产物主要是气体，如二氧化碳。
这种情况下，柠檬酸发酵可以在其它微生物中应用。
然而，当在缺氧条件下进行柠檬酸发酵时（如在发酵罐中），由于氧气供应不足，柠檬酸菌会进一步代谢柠檬酸。
在此情况下，发酵的产物主要是有机酸，如乳酸、丙酸等。
这种发酵过程称为无氧呼吸。
结合柠檬酸菌自身特点和提供的环境条件，可以选择调控发酵过程中柠檬酸的转化路径，实现不同发酵产品的生产。
总结起来，柠檬酸发酵的原理是通过引入柠檬酸菌并在适宜条件下提供营养物质，利用柠檬酸菌的代谢能力，将柠檬酸转化为新的化合物。
有机酸工艺学-柠檬酸发酵微生物与发酵机制2
1-扇形划线法 2-分区划线法 3-方格划线法 4-连续划线法
■ 该法简单、快速、易行、理想的单菌落获得率较低。
（2）稀释平板分离纯化培养
■ 取已经灭菌的装有9mL无菌水试管数支，做好标 号，另用无菌吸管吸取上述玻璃珠振荡而制得的悬 浮液少许，注入1号试管内，充分的摇匀，吸取此 悬浮液1mL注入第二支试管中，以此类推，直至最 后一支试管，每稀释一管，必须更换一支无菌吸管。 再从最后2-3支无菌试管中吸取1mL倒入融化冷却 至42-45℃的麦芽汁培养基中，充分摇匀，静置凝 结成平板。倒置于恒温箱中，于35～37 ℃下培养 40～48h，挑取单个菌落，移接到斜面试管培养基 中，待检。
■ 在柠檬酸产酸期，也存在HMP途径的酶，其比率为 EMP/HMP=4:1，即80%的葡萄糖由酵解途径代谢的。 HMP途径主要存在于孢子形成阶段，因为它提供合成核酸 所需的前体物质。
五、黑曲霉积累柠檬酸基本条件： 耐受高浓度柠檬酸（20%以上） 耐受高浓度葡萄糖，粉浆浓度18%-20% 对磷、锰、铁、锌等无机盐耐受
（2）发酵过程pH值的变化
■ 在发酵过程中，随着菌种对培养基种碳、氮源的利用，随着有机酸和氨基 酸的积累，会使pH值产生一定的变化。
■ ①生长阶段：菌体产生蛋白酶水解培养基中的蛋白质，生成铵 离子，使pH上升至碱性；随着菌体量增多，铵离子的消耗也增 多，另外糖利用过程中有机酸的积累使pH值下降。
■ ②生产阶段：这个阶段pH值趋于稳定。 ■ ③自溶阶段：随着养分的耗尽，菌体蛋白酶的活跃，培养液中
浓度范围
u2+
高浓度Mn2+将刺激乙酰辅酶A，造成草酰乙酸浓度下降，不利 于合成柠檬酸。
高浓度Zn2+抑制柠檬酸合成酶，不利于合成柠檬酸。当培养基 中 Zn2+浓度低时, 黑曲霉的生长受到抑制从而进入柠檬酸积累 阶段。
第二章 柠檬酸
柠檬酸→顺乌头酸→异柠檬酸的反应，是因为黑曲霉 的线粒体上存在顺乌头酸水合酶,它能催化建立以下平 衡: 2. Fe2+ 柠檬酸:顺乌头酸:异柠檬酸=90:3:7， 该酶需要Fe2+参与，应控制Fe2+浓度。 3.pH 而NAD-异柠檬酸脱氢酶活性低,虽然细胞质中NADP-异 柠檬酸脱氢酶不受柠檬酸抑制,但在线粒体上的NADP异柠檬酸脱氢酶受柠檬酸抑制; 所以当柠檬酸达到一定浓度时，能够抑制自身的进一 步分解,导致积累柠檬酸; 当pH到2时,已经能使这三种 酶失活而进一步积累柠檬酸.
目录
柠檬酸生产发展史
1919年，比利时成功地进行了浅盘发酵法的工 业生产。 1923年，美国辉瑞(Pfizer)公司研 制成功以废糖蜜为原料的浅盘法柠檬酸发酵。 1952年，美国Miles公司，首先成功采用深层 发酵法工业化规模生产柠檬酸。 目前主要以淀粉质或糖质原料深层发酵法生产 柠檬酸，生产过程由糖化发酵、柠檬酸粗提和 精制三大工序组成。
目录
(3)异柠檬酸脱氢酶的调节
黑曲霉中的异柠檬酸脱氢酶有三种：一种依赖于NAD异 柠檬酸脱氢酶（存在于细胞质中）,两种依赖于NADP异 柠檬酸脱氢酶（分别存在于细胞质和线粒体中）。 NAD异柠檬酸脱氢酶的活性很低，起主要作用的是NADP 异柠檬酸脱氢酶。 虽然细胞质中NADP-异柠檬酸脱氢酶不受柠檬酸抑制, 但在线粒体上的NADP-异柠檬酸脱氢酶受柠檬酸抑制， 还受α-酮戊二酸的抑制。 所以当柠檬酸达到一定浓度时，能够抑制自身的进一 步分解,导致积累柠檬酸; 当pH到2时,已经能使这三种 酶失活而进一步积累柠檬酸.
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3.pH
pH值在3.0以上容易产生草酸，
柠檬酸发酵机制
柠檬酸发酵机制柠檬酸生产分发酵和提取两部分。
发酵有固态发酵、液态浅盘发酵和深层发酵3种方法。
固态发酵是以薯干粉、淀粉粕以及含淀粉的农副产品为原料，配好培养基后，在常压下蒸煮，冷却至接种温度，接入种曲，装入曲盘，在一定温度和湿度条件下发酵。
采用固态发酵生产柠檬酸，设备简单，操作容易。
液态浅盘发酵多以糖蜜为原料，其生产方法是将灭菌的培养液通过管道转入一个个发酵盘中，接入菌种，待菌体繁殖形成菌膜后添加糖液发酵。
发酵时要求在发酵室内通入无菌空气。
深层发酵生产柠檬酸的主体设备是发酵罐。
微生物在这个密闭容器内繁殖与发酵。
现多采用通用发酵罐。
它的主要部件包括罐体、搅拌器、冷却装置、空气分布装置、消泡器，轴封及其他附属装置。
发酵罐径高比例一般是1:2.5，应能承受一定的压力，并有良好的密封性。
除通用式发酵罐外，还可采用带升式发酵罐、塔式发酵罐和喷射自吸式发酵罐等。
为了得到产柠檬酸的优良菌种，通常是从不同地区采集的土壤或从腐烂的水果中分离筛选，然后通过物理和化学方法进行菌种选育。
例如薯干粉深层发酵柠檬酸的菌种就是通过不断变异和选育得到的。
菌种适合在高浓度下发酵，产酸水平较高。
柠檬酸的发酵因菌种、工艺、原料而异，但在发酵过程中还需要掌握一定的温度、通风量及pH值等条件。
一般认为，黑曲霉适合在28～30℃时产酸。
温度过高会导致菌体大量繁殖，糖被大量消耗以致产酸降低，同时还生成较多的草酸和葡萄糖酸；温度过低则发酵时间延长。
微生物生成柠檬酸要求低pH，最适pH为2～4，这不仅有利于生成柠檬酸，减少草酸等杂酸的形成，同时可避免杂菌的污染。
柠檬酸发酵要求较强的通风条件，有利于在发酵液中维持一定的溶解氧量。
通风和搅拌是增加培养基内溶解氧的主要方法。
随着菌体生成，发酵液中的溶解氧会逐渐降低，从而抑制了柠檬酸的合成。
采用增加空气流速及搅拌速度的方法，使培养液中溶解氧达到60%饱和度对产酸有利。
柠檬酸生成和菌体形态有密切关系，若发酵后期形成正常的菌球体，有利于降低发酵液粘度而增加溶解氧，因而产酸就高；若出现异状菌丝体，而且菌体大量繁殖，造成溶解氧降低，使产酸迅速下降。
柠檬酸
柠檬酸发酵讲义第一节柠檬酸发酵简史柠檬酸又名枸橼酸，英文名citric acid，它来自拉丁名citrus，原义是存在于柠檬等水果中的一种有机酸。
柠檬酸学名为3—羟基—3—羧基戊二酸。
柠檬酸是生物体主要代谢产物之一，在自然界中分布很广，主要存在于柠檬、柑枯、菠萝、梅、李、梨、桃、无花果等果实中，尤其以未成熟者合酸量铰多。
植物叶子中(如烟叶、棉叶、菜豆叶等)也合有柠檬酸。
柠檬酸在植物体内常与苹果酸、草酸及酒石酸等共同存在。
在动物中，柠檬酸存在于骨镕、肌肉、血液、乳计、唾液、汗和尿中，或者以游离状态或金属盐类的形式存在。
早在1784年，瑞典化学家Scheel就首次从柠檬汁中提取出了柠檬酸，并制成了结晶。
后来，德国科学家在1891年发现了微生物产生柠檬酸的能力，他指出，“柠檬酸是青霉两极毛霉属霉菌的糖代谢产物之一”。
但直到本世纪初，这种有机酸仍然绝大部分是从柠檬汁中提取的。
主要产地以意大利的西西里岛最为著名。
其次，美国加尼福尼亚、夏威夷群岛以及西印度群岛的产量也较高。
1891年，Wehmef从腐败的柑桔上分离出一种丝状菌，它能使含CaCO3的糖液变酸，从酸液中可以分离出柠檬酸和草酸。
因此，他将该菌命名为“柠酸檬霉菌”，即桔青霉。
1897年，他又发现淡黄青霉与梨形毛霉也有柠檬酸产地能力。
1913年，zahorsk5首先利用黑曲霉生产柠檬酸。
1916年，Thop J和curr5e对曲霉属的许多菌株进行过普查，发现很多菌种能产柠檬酸。
经过curr5e(1917年)的深入研究，初步奠定了发酵法生产柠檬酸的科学基础，1919年，比利时一家工厂成功地进行了浅盘发酵法的工业生产。
1923年，美国ch公司也开始用浅盘发酵法大规模生产柠檬酸。
利用糖蜜生产柠檬酸以比利时一家糖厂历史最早，规模最大，技术也校先进。
直到1950年，世界各国一直采用浅盘发酵法生产柠檬酸。
1952年，美国Mzes实验室公司首先采用深层发酵法大规模生产柠檬酸以后，深层发酵法逐渐流行起来。
柠檬酸发酵及产物提取
综合实验：柠檬酸发酵及产物提取（一）柠檬酸发酵一、实验原理柠檬酸发酵为典型的有机酸发酵，淀粉质原料经淀粉酶作用水解为葡萄糖，葡萄糖经EMP途径氧化为丙酮酸，丙酮酸进一步被氧化脱羟生成乙酰CoA，就一般能量代谢过程而言，生成的乙酰CoA与草酰乙酸缩合成柠檬酸后进入三羟酸循环，通过三羟酸循环进行有氧呼吸的能量代谢。
但就柠檬酸产生菌而言，由于其乌头酸流水作业事酶和异柠檬酸脱氢酶活性很低，而柠檬酸合成酶的活性很高，因而大量积累柠檬酸，草酰乙酸的提供则仍通过丙酮酸羧化而成，柠檬酸的生成途径如下式：2 C6H12O6 +3 O2→2 C6H8O7 +4 H2O国内目前柠檬酸发酵所采用的原料主要是山芋干及废糖蜜。
二、实验器材（一）材料1．菌种：黑曲霉2．蔗糖、硫酸铵等（二）主要仪器设备1．旋转式摇床、超净工作台、15L发酵罐等三、操作步骤1．种子培养基制备：马铃薯培养基配方:(1000ml)马铃薯（去皮）200g葡萄糖（或蔗糖）20g琼脂15~25g水1000ml自然pH2．种子液培养：将已灭菌的种子培养基接入一环斜面孢子于35℃±1℃、250r.p.m条件下培养24~36h。
3．种子培养液质量要求：镜检菌丝生长健壮，结成菊花形小球，球直径不超过100μm，每毫升含菌球数在1~2万之间，无异味、无杂菌污染；pH2~2.5；酸度1.5~2.0%。
4．发酵培养基制备：蔗糖15%，硫酸铵0.4%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁7水0.025%。
5. 上罐灭菌（操作同实验一）5．发酵：将培养好的种子液按发酵培养液体积的5%接入到已灭菌的发酵培养基中，于35℃±1℃、500转条件下发酵4天。
6.分别在0,24,48,72,96小时测定一下参数。
四、实验结果1．对种子液进行镜检，画下菌丝形态，并测定菌球直径及粗略估算每ml种子液中的菌球数。
2．测定成熟发酵液的酸度，并就发酵结束后的菌体形态作出描述。
3．计算柠檬酸发酵的转化率，即每100克葡萄糖经转化所能生成的柠檬酸克数，柠檬酸酵的理论转化率按下列反应计算应为106.7%。
柠檬酸发酵原理
谢 谢！
JUST DO IT！
人手洗手消毒前后手部卫生状况对比
• 洗手前：1300个/cm2 • 清水洗手后：1000个/cm2 • 肥皂洗手后：80个/ cm2 • 消毒后：0个/ cm2
未洗的手
未打皂液洗过的手
洗净的手（用洗剂）
洁净的手（消毒后）
进 入 工 作 岗 位 以 后 环境卫生是实验室、发酵工 人、消毒人员及厂区工作人 员必须时刻铭记的基本常识。
黑曲霉如何积累柠檬酸
黑曲霉耐酸，耐低PH。 黑曲霉发酵柠檬过程中，在发酵初期， 发酵液中萄葡糖含量较高，而高浓度的萄 葡糖正是黑曲霉α-酮戊二酸脱氢酶合成的 抑制物，这样一来TCA循环就中断了，酸 度得到积累（注意此时积累的是酸度而不 仅是柠檬酸），但是当酸度积累到PH≤2.0 时，催化柠檬酸<>顺乌头酸<>异柠檬酸正 逆反应的顺乌头酸水合酶，不表现出活力 ，这样TCA循环在合成柠檬酸之后就不会 向后继续反应，从而达到柠檬的积累。
传播污染的四大媒介－人
第四个帮凶可能是大家都不会想 到的，它就是我们自己，人体是一个 永不休止的污染媒介。当您每天来工 厂上班时，您也许随身将几百万细菌
带入工厂。
人员污染的途径和方式
人的头发和皮肤：每分钟从人类皮肤中要散发出约10,000个微
生物
嘴巴和鼻子——水滴：呼吸、咳嗽和喷嚏将产生出大量水滴，
黑 曲 霉 生 长 周 期
发酵常见染菌及区别
一、酵母菌是一些单细胞真菌，体积较细 菌较大 ，1~5微米*5~30微米，而细菌直 径或宽度不超过1微米，长不超过5微米， 有氧无氧均可生存，低PH也可生存。
二、细菌主要由细胞膜、 细胞质、核质体等部分构 成 ，球菌、杆菌和螺形 菌 ，低PH难以存活，易 自溶。
柠檬酸发酵机制
上国际市场竞争激烈，已出现严重的供大于求的局面，设 备利用率不到60%，行业经济效益呈滑坡态势。
第二节 柠檬酸合成途径与代谢调控
一、柠檬酸合成途径的发现
1940年，Krebs: TCA； 1953年，Jagnnathan证实黑曲霉中存在EMP途 径所有酶； 1954年，Shu提出葡萄糖80%经EMP途径代谢； 1954-1955年，Ramakrishman等发现黑曲霉中 存在TCA循环。
2、通过 CO2固定反应提供C4二羧酸
四、柠檬酸发酵过程的控制要点
（1）控制Mn2+、NH4+浓度，解除柠檬酸对PFK的 抑制，使EMP畅通无阻。
（2） 控制溶氧，防止侧系呼吸链失活。
（3）控制培养基中的Fe2+ 的浓度，使顺乌头酸水 合酶失活。
五、柠檬酸产生菌育种的传统方法：
1. 透明圈大的菌株 平板：10%甘薯 + 2 %的琼脂 + 0.5% CaCO3 诱变后，涂布，透明圈大的则好
顺乌头酸水合酶、NAD和NADP-异柠檬酸脱氢酶在柠檬 酸产生与不产生时，这3种酶均存在，而当铜离子0.3mg/L， 铁离子2mg/L和pH2.0情况下，这3种酶均不出现活力，发酵 中柠檬酸正是在这个pH条件下积累的。
3、α-酮戊二酸脱氢酶的调节
在黑曲霉柠檬酸产生菌中，TCA循环的一个显著特点 是，α-酮戊二酸脱氢酶的合成受葡萄糖和铵离子的阻遏。 因此当以葡萄糖为碳源时，在柠檬酸生成期，菌体内不存 在α-酮戊二酸脱氢酶或活力很低。
第一节 概述
一、柠檬酸简介
❖ 柠檬酸又名枸橼酸，学名α-羟基丙烷三羧酸，是 生物体主要代谢产物之一。化学名称2-羟基丙三 羧酸，英文文献俗名citric acid，分子式C6H8O7。 无色或白色晶体，无臭，味极酸，易溶于水和乙 醇、微溶于乙醚、水溶液呈酸性反应。