基因多型性定型定量分析实验.ppt
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《基因药物分析》PPT课件
一. 理化分析法 光谱分析法： 比色法，紫外、荧光分光 光度法等
色谱分析法： 高效液相，灌注色谱等
精品医学
14
➢ 化学分析法：重量法、滴定分析、电化学分析
❖ 重量法：根据样品中分离出的单质或化合物的重量测定 所含成分的含量。
1．提取法：用适宜的溶剂提取出样品中的某种成分，再蒸 去溶剂进行测定。
2．挥发法：利用被测组分具有挥发性，或将它转化为挥发 性物质来进行含量测定的方法。
多糖类：检查低聚糖、核酸、蛋白质等；
•原料药的检查
（生化药物）
酶类：酶催化反应基本产物分析，相关酶 的检查；
精品医学
8
•生产过程中杂质的检查（尤其是基因工程药物）
基因工程药物的生产涉及到生物材料和生物学过程，因 此可能会存在很多传统生产方法不可能存在的有害杂质。
如：原核细胞中表达的产品 如：动物细胞中表达的产品 可能含有内毒素、致敏原 可能含有DNA杂质或病毒
3
❖ 什么是基因工程药物（Genetic engineering drugs）？
发现
功能蛋白
预防、治疗某种疾病
基
因
的 调控基因的分离、纯化或人工合成
控制蛋白合成
繁
殖
DNA重组技术
表
导
达
入
可大量生产的受体细胞
细菌、酵母菌、 动植物及其细胞
精品医学
4
➢ 生化药物和基因工程药物的种类
生化药物
氨基酸、多肽、蛋白质 酶类与辅酶类 多糖类
应用：基因工程药物和其它大分子药物的分离纯化和分析
精品医学
23
二、 生化测定法
➢ 电泳法
❖ 定义：在电解质溶液中，带电粒子或离子在电场作用下， 以不同的速度向其所带电荷相反方向迁移的现象叫电泳。 ❖ 原理：基于溶质在电场中的迁移速度不同而进行的分析方法
色谱分析法： 高效液相，灌注色谱等
精品医学
14
➢ 化学分析法：重量法、滴定分析、电化学分析
❖ 重量法：根据样品中分离出的单质或化合物的重量测定 所含成分的含量。
1．提取法：用适宜的溶剂提取出样品中的某种成分，再蒸 去溶剂进行测定。
2．挥发法：利用被测组分具有挥发性，或将它转化为挥发 性物质来进行含量测定的方法。
多糖类：检查低聚糖、核酸、蛋白质等；
•原料药的检查
（生化药物）
酶类：酶催化反应基本产物分析，相关酶 的检查；
精品医学
8
•生产过程中杂质的检查（尤其是基因工程药物）
基因工程药物的生产涉及到生物材料和生物学过程，因 此可能会存在很多传统生产方法不可能存在的有害杂质。
如：原核细胞中表达的产品 如：动物细胞中表达的产品 可能含有内毒素、致敏原 可能含有DNA杂质或病毒
3
❖ 什么是基因工程药物（Genetic engineering drugs）？
发现
功能蛋白
预防、治疗某种疾病
基
因
的 调控基因的分离、纯化或人工合成
控制蛋白合成
繁
殖
DNA重组技术
表
导
达
入
可大量生产的受体细胞
细菌、酵母菌、 动植物及其细胞
精品医学
4
➢ 生化药物和基因工程药物的种类
生化药物
氨基酸、多肽、蛋白质 酶类与辅酶类 多糖类
应用：基因工程药物和其它大分子药物的分离纯化和分析
精品医学
23
二、 生化测定法
➢ 电泳法
❖ 定义：在电解质溶液中，带电粒子或离子在电场作用下， 以不同的速度向其所带电荷相反方向迁移的现象叫电泳。 ❖ 原理：基于溶质在电场中的迁移速度不同而进行的分析方法
(完整)高中生物基因的表达基因对性状的控制课件新人教版必修精品PPT资料精品PPT资料
探究点一 探究点二 温故知新
问题导引 典例剖析 归纳提升 活学活练
(6)RNA病毒的遗传信息传递与表达的途径有(用类似题图中的 形式表述):
①
;
②
。
探究点一 探究点二 温故知新
问题导引 典例剖析 归纳提升 活学活练
下图甲、乙、丙表示细胞内正在进行的新陈代谢过程,据图分析 下列表述不恰当的是( )
编码血红蛋白的正常基因的碱基对发生替换→血红 蛋白结构异常→功能受损→红细胞呈镰刀型
一二
2.基因控制性状的两种途径 (1)基因可以通过控制酶的合成来控制代谢过程,进而控制生物体 的性状。 (2)基因可以通过控制蛋白质的结构直接控制生物体的性状。 总之,基因对性状的控制是通过指导蛋白质的合成来实现的。图 示如下:
1、4、6、8过程的产物为RNA,需要核糖核苷酸作为原料,但10过程表示DNA的复制,需要脱氧核糖核苷酸作为原料。
一二
2.下图为遗传信息在生物大分子之间传递的图解。正常情况下 在动植物细胞中都不可能发生的是( )
A.①②⑤ B.③④ C.③⑤ D.④⑤ 解析:RNA的复制和逆转录过程只能发生在被RNA病毒感染的 生物体细胞中,而DNA分子的复制、转录和翻译都可以发生在动植 物细胞中。 答案:B
第2节 基因对性状的控制
课标阐释
1.掌握中心法则的主 要内容。 2.说出基因控制性状 的两个途径。 3.举例说明基因、蛋 白质和性状的关系。
学传信息传递途径的差异,理解每个过程的发 生场所。 2.结合实例理解基因、性状与蛋白质的关系, 掌握基因控制性状的两种途径。
3.基因与性状的对应关系 (1)生物的一部分性状受单个基因控制。 (2)生物的有些性状是由多个基因决定的,如人的身高。 (3)生物的性状还受环境条件的影响,性状是生物的基因和环境条 件共同作用的结果。
《基因功能分析》课件
通过荧光染料或探针标记的特异引 物，对特定基因进行实时荧光检测 ，实现对基因表达的定量分析。
蛋白质组学分析
利用质谱等技术对蛋白质进行鉴定 和定量分析，了解蛋白质的表达情 况和功能。
基因突变分析
Sanger测序
通过对目标基因进行双脱氧终止法测序，检测基 因突变位点和类型。
高通量测序
对全基因组或目标区域进行深度测序，发现基因 突变和结构变异。
随着基因技术的进步，相关的伦理和法规 也将不断完善，以保障技术的安全和合理 应用。
THANKS
[ 感是生物多样性的基础。不同物种或同一物种不同种群间的基因变异导致了生物多 样性的产生和发展。了解基因变异对生物多样性的影响有助于保护和利用生物资源。
CHAPTER 04
基因功能研究的应用
医学诊断与治疗
基因诊断
利用基因检测技术，对遗传性疾病进行早期诊断，有助于制定个性 化的治疗方案。
基因与药物反应个体差异
不同个体对同一种药物的反应可能存在差异，这种差异部 分由基因变异引起。了解个体基因变异情况有助于预测患 者对特定药物的反应。
基因与进化
基因变异与物种形成
基因变异是生物进化的驱动力之一。通过自然选择和遗传漂变，基因变异在种群中积累并 最终导致新物种的形成。
基因与适应性进化
生物在适应环境过程中，某些基因变异有助于提高生存和繁殖能力，从而在自然选择作用 下得到保留和传播。这些变异可以影响生物的生理机能、行为和形态等方面。
03
基因与个性化医疗
了解基因变异对疾病的影响有助于实现个性化医疗，为患者提供更精准
的诊断和治疗方案。
基因与药物反应
基因与药物代谢
药物代谢酶的基因变异可以影响药物的代谢速率和效果。 有些变异可能导致药物代谢过快或过慢，从而影响治疗效 果。
蛋白质组学分析
利用质谱等技术对蛋白质进行鉴定 和定量分析，了解蛋白质的表达情 况和功能。
基因突变分析
Sanger测序
通过对目标基因进行双脱氧终止法测序，检测基 因突变位点和类型。
高通量测序
对全基因组或目标区域进行深度测序，发现基因 突变和结构变异。
随着基因技术的进步，相关的伦理和法规 也将不断完善，以保障技术的安全和合理 应用。
THANKS
[ 感是生物多样性的基础。不同物种或同一物种不同种群间的基因变异导致了生物多 样性的产生和发展。了解基因变异对生物多样性的影响有助于保护和利用生物资源。
CHAPTER 04
基因功能研究的应用
医学诊断与治疗
基因诊断
利用基因检测技术，对遗传性疾病进行早期诊断，有助于制定个性 化的治疗方案。
基因与药物反应个体差异
不同个体对同一种药物的反应可能存在差异，这种差异部 分由基因变异引起。了解个体基因变异情况有助于预测患 者对特定药物的反应。
基因与进化
基因变异与物种形成
基因变异是生物进化的驱动力之一。通过自然选择和遗传漂变，基因变异在种群中积累并 最终导致新物种的形成。
基因与适应性进化
生物在适应环境过程中，某些基因变异有助于提高生存和繁殖能力，从而在自然选择作用 下得到保留和传播。这些变异可以影响生物的生理机能、行为和形态等方面。
03
基因与个性化医疗
了解基因变异对疾病的影响有助于实现个性化医疗，为患者提供更精准
的诊断和治疗方案。
基因与药物反应
基因与药物代谢
药物代谢酶的基因变异可以影响药物的代谢速率和效果。 有些变异可能导致药物代谢过快或过慢，从而影响治疗效 果。
第三章 定性和定量分析
差就较大，因此采用峰高乘平均峰宽法。 A=1/2h（W0.15＋W0.85）
式中W0.15和 W0.85分别为峰高0．15倍和0．85倍处的峰宽。
35
（3）对于同系物-峰高乘保留时间法 在一定操作条件下，同系物之间存在半峰宽规律： W1/2=btR+a
对于难于测量半峰宽的窄峰、重叠峰（未完全重叠），
组分X
18
［例］图19-15为某组分在阿皮松L柱上的流出曲线 （柱温100℃）。测得调整保留时间以记录纸距离表 示为310.0mm。又测得正庚烷和正辛烷的调整保留时 间分别为174.0mm，373.4mm，求组分X的保留指数 并判断是什么组分。 解: 已知Z=7
lg 310.0 lg174.0 I x 100 [7 ] 775.6 lg 373.4 lg174.0
16
保留指数的测定
将被测组分与相邻两正构烷烃混合在 一起（或分别进行），在相同色谱条件下 进行分析，测出保留值，按上式计算出被 测组分保留指数Ix。将测定出的Ix值与文 献值对照定性。
17
［例］图19-15为某组分在阿皮松L柱上的流出曲线 （柱温100℃）。测得调整保留时间以记录纸距离 表示为310.0mm。又测得正庚烷和正辛烷的调整保 留时间分别为174.0mm，373.4mm，求组分X的保 留指数并判断是什么组分。
从文献上查得，在该色谱条件下，乙酸乙酯保留指数为 775.6，再用纯乙酸乙酯对照实验，可以确认该组分是乙酸乙酯。 在与文献值对照时，一定要重视文献值的实验条件，如 固定液、柱温等。而且要用几个已知组分进行验证。
19
保留指数的应用特点
保留指数仅与柱温和固定相性质有关，与色
谱操作条件无关。不同的实验室测定的保留指数 的重现性较好，精度可达±0.03个指数单位。所
式中W0.15和 W0.85分别为峰高0．15倍和0．85倍处的峰宽。
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（3）对于同系物-峰高乘保留时间法 在一定操作条件下，同系物之间存在半峰宽规律： W1/2=btR+a
对于难于测量半峰宽的窄峰、重叠峰（未完全重叠），
组分X
18
［例］图19-15为某组分在阿皮松L柱上的流出曲线 （柱温100℃）。测得调整保留时间以记录纸距离表 示为310.0mm。又测得正庚烷和正辛烷的调整保留时 间分别为174.0mm，373.4mm，求组分X的保留指数 并判断是什么组分。 解: 已知Z=7
lg 310.0 lg174.0 I x 100 [7 ] 775.6 lg 373.4 lg174.0
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保留指数的测定
将被测组分与相邻两正构烷烃混合在 一起（或分别进行），在相同色谱条件下 进行分析，测出保留值，按上式计算出被 测组分保留指数Ix。将测定出的Ix值与文 献值对照定性。
17
［例］图19-15为某组分在阿皮松L柱上的流出曲线 （柱温100℃）。测得调整保留时间以记录纸距离 表示为310.0mm。又测得正庚烷和正辛烷的调整保 留时间分别为174.0mm，373.4mm，求组分X的保 留指数并判断是什么组分。
从文献上查得，在该色谱条件下，乙酸乙酯保留指数为 775.6，再用纯乙酸乙酯对照实验，可以确认该组分是乙酸乙酯。 在与文献值对照时，一定要重视文献值的实验条件，如 固定液、柱温等。而且要用几个已知组分进行验证。
19
保留指数的应用特点
保留指数仅与柱温和固定相性质有关，与色
谱操作条件无关。不同的实验室测定的保留指数 的重现性较好，精度可达±0.03个指数单位。所
数量性状的遗传—数量性状基因定位(遗传学课件)
如果分子标记覆盖整个基因组，控制数量性状的 基因( Qi)两侧会有相连锁的分子标记( M i- 和 M i+ )，这 些与Qi紧密连锁的分子标记将表现不同程度的遗传效应。
利用分子标记定位QTL（Qi），实质就是分析分子 标记与数量性状基因座Qi的连锁关系，即利用已知座位 的分子标记来定位未知座位的Qi，通过分子标记与Qi之 间的重组率，来确定Qi的具体位置。
注意把QTL与具体的群体相联系。 QTL有统计学特征 统计分析确定的QTL的位置也并
非物理上的位置。所以QTL位置与效应均有概率上的 含意。
型3种带型，这3种带型即代表某一分子标记的3种基因 型。如果将含有P1带型的个体赋值为1，P2带型的赋值 为3，杂合体赋值为2，即可得到数据化的分子标记图。
三、QTL作图一般步骤
（三）检测分离世代群体中每一个体的标记基因型
21 113 22
三、QTL作图一般步骤
（四）测量数量性状 测定作图群体的每个个体（系）数量性状值。如： 株高 百粒重 蛋白质含量 ……
四、基于混合线性模型的复合区间作图法 （MCIM）
朱军提出了用随机效应的预测方法获得基因型效 应及基因型与环境互作效应，然后再用区间作图法进 行遗传主效应及基因型与环境互作效应的QTL分析。
四、基于混合线性模型的复合区间作图法 （MCIM）
该模型可以扩展到分析具有加×加、加×显、显× 显上位性的各项遗传主效应及其与环境互作效应的QTL。
缺点：无法检测上位性效应和基因型与环境的互作； 当相邻QTL相距较近时，QTL间相互干扰使QTL的
位置和效应估计出现偏差； 每次检验仅用两个标记，其他标记的信息未加利用。
三、复合区间定位法(CIM)
Kao 和Zeng等（1999）提出了多重区间作图法进 行基因定位，这种方法也是以极大似然法估算遗传参 数，突破了回归方法的局限性，可同时在多个区间上 检测多个QTL，使QTL作图的精确度和有效性得到了改 进。
利用分子标记定位QTL（Qi），实质就是分析分子 标记与数量性状基因座Qi的连锁关系，即利用已知座位 的分子标记来定位未知座位的Qi，通过分子标记与Qi之 间的重组率，来确定Qi的具体位置。
注意把QTL与具体的群体相联系。 QTL有统计学特征 统计分析确定的QTL的位置也并
非物理上的位置。所以QTL位置与效应均有概率上的 含意。
型3种带型，这3种带型即代表某一分子标记的3种基因 型。如果将含有P1带型的个体赋值为1，P2带型的赋值 为3，杂合体赋值为2，即可得到数据化的分子标记图。
三、QTL作图一般步骤
（三）检测分离世代群体中每一个体的标记基因型
21 113 22
三、QTL作图一般步骤
（四）测量数量性状 测定作图群体的每个个体（系）数量性状值。如： 株高 百粒重 蛋白质含量 ……
四、基于混合线性模型的复合区间作图法 （MCIM）
朱军提出了用随机效应的预测方法获得基因型效 应及基因型与环境互作效应，然后再用区间作图法进 行遗传主效应及基因型与环境互作效应的QTL分析。
四、基于混合线性模型的复合区间作图法 （MCIM）
该模型可以扩展到分析具有加×加、加×显、显× 显上位性的各项遗传主效应及其与环境互作效应的QTL。
缺点：无法检测上位性效应和基因型与环境的互作； 当相邻QTL相距较近时，QTL间相互干扰使QTL的
位置和效应估计出现偏差； 每次检验仅用两个标记，其他标记的信息未加利用。
三、复合区间定位法(CIM)
Kao 和Zeng等（1999）提出了多重区间作图法进 行基因定位，这种方法也是以极大似然法估算遗传参 数，突破了回归方法的局限性，可同时在多个区间上 检测多个QTL，使QTL作图的精确度和有效性得到了改 进。
基因分析ppt课件
原理：核酸杂交
应用：分析转录本含量/剪切情况，位点
有关Protein的分析技术
（十三）蛋白质浓度测定: BCA
原理：BCA与Cu+结合形成稳定 的紫蓝色复合物,562nm处吸收
应用：蛋白浓度测定
（十四）氨基酸序列分析 (protein sequencing)
原理：Edman降解法+HPLC
（四）DNA/RNA定量分析 (DNA/RNA quantification by spectrophotometry)
原理:在260nm处有吸收峰
应用：[dsDNA]=50x(OD260-OD310)xdilution factor
Spectrophotometer
（五） Southern Blot
应用：氨基酸序列分析（十五源自聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)
原理：分子量大小不同，用电泳法分离蛋白质
应用: 纯度分析、分子量测定、浓度测定、免 疫印迹第一步、免疫沉淀蛋白的鉴定
蛋白染色结果
（十六）双向聚丙烯酰胺凝胶电泳
（Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis, 2D-PAGE）
（二十）western-blot
原理：SDS-PAGE+抗原-抗体结合
应用：鉴定特异蛋白质
（二十一）蛋白质芯片(protein chip)
原理：蛋白质分子间相互作用
应用：检测蛋白表达量、差异、相互作用
（二十二）免疫组织化学技术
（Immunohistochemistry）
原理：抗原-抗体结合
加样
电泳结果
脉冲场凝胶电泳
(二) 聚丙烯酰胺凝胶电泳
(polyacrylamide gel electrophoresis)
应用：分析转录本含量/剪切情况，位点
有关Protein的分析技术
（十三）蛋白质浓度测定: BCA
原理：BCA与Cu+结合形成稳定 的紫蓝色复合物,562nm处吸收
应用：蛋白浓度测定
（十四）氨基酸序列分析 (protein sequencing)
原理：Edman降解法+HPLC
（四）DNA/RNA定量分析 (DNA/RNA quantification by spectrophotometry)
原理:在260nm处有吸收峰
应用：[dsDNA]=50x(OD260-OD310)xdilution factor
Spectrophotometer
（五） Southern Blot
应用：氨基酸序列分析（十五源自聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)
原理：分子量大小不同，用电泳法分离蛋白质
应用: 纯度分析、分子量测定、浓度测定、免 疫印迹第一步、免疫沉淀蛋白的鉴定
蛋白染色结果
（十六）双向聚丙烯酰胺凝胶电泳
（Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis, 2D-PAGE）
（二十）western-blot
原理：SDS-PAGE+抗原-抗体结合
应用：鉴定特异蛋白质
（二十一）蛋白质芯片(protein chip)
原理：蛋白质分子间相互作用
应用：检测蛋白表达量、差异、相互作用
（二十二）免疫组织化学技术
（Immunohistochemistry）
原理：抗原-抗体结合
加样
电泳结果
脉冲场凝胶电泳
(二) 聚丙烯酰胺凝胶电泳
(polyacrylamide gel electrophoresis)
基因分析的基本策略课件
，直接读出DNA序列。
路漫漫其修远兮, 吾将上下而求索
反应体系 碱基修饰 碱基修饰 主链断裂 断裂点
试剂
反应ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
试剂
G
硫酸二甲酯 鸟嘌呤甲基化 六氢吡啶 G
G+A 甲酸
脱嘌呤作用 六氢吡啶 G/A
C+T
肼
嘧啶开环 六氢吡啶 C/T
C
肼（加盐） 胞嘧啶开环 六氢吡啶 C
在化学修饰反应中，通过控制反应温度和反应时间，只有 一小部分碱基被修饰，随后进行断裂反应也是定量。
路漫漫其修远兮, 吾将上下而求索
5`-GATCACTACTG-3`
硫酸二甲酯
5`*-GATCACTACTG-3`
G
5`* GATCACTACTG 5`*G
路漫漫其修远兮, 吾将上下而求索
G+A 甲酸 C+T 肼
5`*GATCACTACTG
5`*GATCACTACT 5`*GATCACTAC
5`*GATCACTA 5`*GATCA 5`*GA 5`*G
基本步骤： 1、先将DNA的末端之一标记放射性同位素（32P、35S）
； 2、再将DNA样品分别进行多组具碱基特异性、随机的、
不完全的化学修饰； 3、采用修饰碱基敏感的特异化学试剂在修饰碱基位置断
开DNA链； 4、通过具有可分辨链长短仅一个核苷酸之差的聚丙烯胺
凝胶电泳，将DNA断裂片段按分子大小分离开； 5、根据放射自显影胶片上显示的末端标记片段分布情况
定DNA序列的末端中止法；
➢K.Mullis采纳他的方法，完善了PCR扩增DNA的方法
；
➢M.Smith发明了碱基定点突变技术。这三位科学家全
都获得了诺贝尔奖。
路漫漫其修远兮, 吾将上下而求索
反应体系 碱基修饰 碱基修饰 主链断裂 断裂点
试剂
反应ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
试剂
G
硫酸二甲酯 鸟嘌呤甲基化 六氢吡啶 G
G+A 甲酸
脱嘌呤作用 六氢吡啶 G/A
C+T
肼
嘧啶开环 六氢吡啶 C/T
C
肼（加盐） 胞嘧啶开环 六氢吡啶 C
在化学修饰反应中，通过控制反应温度和反应时间，只有 一小部分碱基被修饰，随后进行断裂反应也是定量。
路漫漫其修远兮, 吾将上下而求索
5`-GATCACTACTG-3`
硫酸二甲酯
5`*-GATCACTACTG-3`
G
5`* GATCACTACTG 5`*G
路漫漫其修远兮, 吾将上下而求索
G+A 甲酸 C+T 肼
5`*GATCACTACTG
5`*GATCACTACT 5`*GATCACTAC
5`*GATCACTA 5`*GATCA 5`*GA 5`*G
基本步骤： 1、先将DNA的末端之一标记放射性同位素（32P、35S）
； 2、再将DNA样品分别进行多组具碱基特异性、随机的、
不完全的化学修饰； 3、采用修饰碱基敏感的特异化学试剂在修饰碱基位置断
开DNA链； 4、通过具有可分辨链长短仅一个核苷酸之差的聚丙烯胺
凝胶电泳，将DNA断裂片段按分子大小分离开； 5、根据放射自显影胶片上显示的末端标记片段分布情况
定DNA序列的末端中止法；
➢K.Mullis采纳他的方法，完善了PCR扩增DNA的方法
；
➢M.Smith发明了碱基定点突变技术。这三位科学家全
都获得了诺贝尔奖。
基因表达的定量检测分析42页PPT
侈 。——CocoCha nel 62、少而好学，如日出之阳；壮而好学 ，如日 中之光 ；志而 好学， 如炳烛 之光。 ——刘 向 63、三军可夺帅也，匹夫不可夺志也。 ——孔 丘 64、人生就是学校。在那里，与其说好 的教师 是幸福 ，不如 说好的 教师是 不幸。 ——海 贝尔 65、接受挑战，就可以享受胜利的喜悦 。——杰纳勒 尔·乔治·S·巴顿
基因表达的定量检测分析
26、机遇对于有准备的头脑有特别的 亲和力 。 27、自信是人格的核心。
28、目标的坚定是性格中最必要的力 量泉源 之一， 也是成 功的利 器之一 。没有 它，天 才也会 在矛盾 无定的 迷径中 ，徒劳 无功。- -查士 德斐尔 爵士。 29、困难就是机遇。--温斯顿．丘吉 尔。 30、我奋斗，所以我快乐。--格林斯 潘。
基因表达的定量检测分析
26、机遇对于有准备的头脑有特别的 亲和力 。 27、自信是人格的核心。
28、目标的坚定是性格中最必要的力 量泉源 之一， 也是成 功的利 器之一 。没有 它，天 才也会 在矛盾 无定的 迷径中 ，徒劳 无功。- -查士 德斐尔 爵士。 29、困难就是机遇。--温斯顿．丘吉 尔。 30、我奋斗，所以我快乐。--格林斯 潘。