大量制备单克隆抗体
单克隆抗体技术（文献综述）
文献综述—单克隆抗体技术的原理、发展与主要的实验步骤1. 单克隆抗体制备的基本原理经免疫的动物产生的致敏B淋巴细胞能分泌特异性的抗体，但这些细胞不能在体外长期存活；而骨髓瘤细胞则可以在体外大量地、无限地繁殖，但不能分泌特异性的抗体。
如果应用杂交瘤技术使骨髓瘤细胞与那些能分泌特异性抗体的细胞相融合，那么得到的杂交瘤细胞（hybridoma cell）将同时具有两种亲本细胞的特性：既能够象肿瘤细胞那样无限繁殖，又具有B淋巴细胞的不断分泌抗体的能力。
根据克隆选择学说，由于每个致敏的B淋巴细胞只能针对同一抗原决定簇产生同种的、完全一样的抗体，所以经过克隆化的杂交瘤细胞就能够分泌对某一抗原决定簇具有特异性的单克隆抗体。
这就是单克隆抗体制备的基本原理。
2. 单克隆抗体技术的诞生、发展和展望1975年，George Kohler 和 Cesar Milstein在Nature上发表了一篇文章，第一次描述了一种获得单克隆抗体的方法。
他们所创立单克隆抗体技术给免疫学乃至整个生物医学领域带来了一次巨大的革命。
Kohler 和Milstein 也因此而荣获1984年诺贝尔奖。
单克隆抗体技术诞生后，立即引起了许多研究者的注意，人们纷纷投入这一崭新领域的研究。
经过多年的发展，到二十世纪八十年代中期，单克隆抗体技术已日臻完善，单克隆抗体也开始广泛应用于生物医学研究和生物技术的各个领域，以及临床诊断和治疗的许多领域。
最初，单克隆抗体技术是以小鼠－小鼠杂交瘤为研究的中心而发展起来的。
由于小鼠源性的单克隆抗体在生产与应用中有其内在的缺点，八十年代后，小鼠－大鼠、大鼠－大鼠、小鼠－人以及人－人杂交瘤技术也被尝试并取得了不同程度的成功,有力地推动了单克隆抗体技术的发展和生物医学研究的深入。
尽管早有准备,单克隆抗体技术的影响之深远还是大大超出了人们的预想：在八十年代中到九十年代末的短短十多年中，为了满足临床诊断和治疗的需要，双特异性抗体技术及人－鼠嵌合抗体技术、人源化抗体技术、小分子抗体技术、植物基因工程抗体技术、抗体酶技术、抗体库(噬菌体显示）技术、外因鼠(XenoMouse)技术等基因工程抗体技术在经典单克隆抗体技术的基础上也被创立并得到了突飞猛进的发展。
单克隆抗体制备的主要技术
单克隆抗体制备的主要技术单克隆抗体制备的主要技术_______________________________单克隆抗体（Monoclonal Antibody，简称mAb）是一种特殊的抗体，它们可以特异性地识别抗原，并且具有极高的特异性和稳定性。
它们已经在临床治疗和诊断方面发挥了重要作用，因此单克隆抗体制备技术已成为生物医学研究的重要手段。
一、单克隆抗体制备的基本原理单克隆抗体制备的基本原理是将一种特定的抗原分子和一种抗原特异性的抗体分子连接起来，从而产生一种特定的单克隆抗体。
这种联合物可以由一种具有抗原特异性的单克隆抗体分子或多克隆抗体分子所表示。
单克隆抗体制备的基本过程可分为四个步骤：选择抗原；制备抗原；选择和培养单克隆抗体产生细胞；制备和纯化单克隆抗体。
1、选择抗原在进行单克隆抗体制备时，首先必须选择一种特定的抗原，以便于产生特异性的单克隆抗体。
常用的抗原来源有蛋白质、多肽、核酸、糖蛋白和合成化学物质。
2、制备抗原根据所选用的抗原，可采用不同的方法对其进行制备。
例如，蛋白质通常可以采用蛋白质表达或免疫原制备方法；多肽可以采用合成方法或者从天然蛋白质中分离出来；核酸可以采用合成方法或者从样品中分离出来；糖蛋白可以采用表达方法或者从天然蛋白质中分离出来；而合成化学物质可以直接合成。
3、选择和培养单克隆抗体产生细胞在单克隆抗体制备中，必须使用能够产生特异性单克隆抗体的产生细胞。
目前常用的单克隆抗体产生细胞包括B细胞、T细胞和流感株融合细胞。
在这些产生细胞中，B细胞是最常用的，因为它能够快速、有效地产生大量的特异性单克隆抗体。
4、制备和纯化单克隆抗体当B细胞产生了足够数量的单克隆抗体之后，就可以采用不同的方法将它们制备和纯化出来。
常用的方法包括浸出法、寡核苷酸酶切法、蛋白酶浸出法、杂交法和Ion-exchange chromatography。
这些方法可以帮助我们得到高度纯化的单克隆抗体。
二、单克隆抗体制备的优势单克隆抗体制备是一种高效、可靠的方法，它可以用来高通量地产生大量特异性的单克隆抗体。
通过小鼠腹水如何大量制备单克隆抗体
教学中产生的问题：单克隆抗体的制备过程中，大家都关注了筛选过程，往往没有关注制备的两条途径，其中之一，细胞培养的途径许多学生能理解，而腹水生产的途径就不熟悉，教材中也没有介绍，而这对内环境的知识也是有帮助的。
单克隆抗体（monoclonal
antibody，MAb），是针对专一的抗原决定簇产生的抗体。
单克隆技术又名杂交瘤技术起源于1975年，主要原理是利用产生抗体的B细胞与骨髓瘤细胞杂交融合成杂交瘤细胞，生产抗体。
两种方法生产单克隆抗体：
目前大量制备单抗的方法主要有两种方法，一种是动物体内生产法（腹水制备），在小鼠腹腔内接种杂交瘤细胞，杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体，约1-2周，可见小鼠腹部膨大，用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体；另一种是细胞体外培养法，将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养，在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体。
由于腹水中单克隆抗体的产生通常会导致内源性宿主蛋白的污染，因此细胞培养对于小规模和大规模单克隆抗体的生产至关重要。
重点问题解疑：如何通过腹水产生单克隆抗体？
杂交瘤细胞被注射到小鼠腹腔内，由于有组织液提供足够的营养，所以能够大量分裂。同时部分杂交瘤细胞分泌抗体，这些细胞和抗体导致腹腔组织液渗透压增高，血浆和淋巴就会渗出并潴留在腹腔内形成腹水。
腹水制备法的优点：
腹水制备法操作简单、制备成本低，是目前国内生产抗体的主要方式，但是，得到的腹水常混有小鼠的各种杂蛋白（包括免疫球蛋白Ig），而且还有污染动物病毒的危险。而体外培养法通过转代培养制备的细胞培养得到的抗体，不但不含小鼠杂蛋白和动物病毒，而且抗体易纯化，目前在国外抗体生产中非常流行。
多克隆抗体单克隆抗体的制备流程
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单克隆抗体制备流程
单抗制备流程1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫旳小鼠脾细胞进行融合，形成旳杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。
这一技术上旳突破不仅为医学与生物学基本研究开创了新纪元，也为临床疾病旳诊、防、治提供了新旳工具。
制备单克隆抗体涉及动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞旳克隆化、冻存以及单克隆抗体旳大量生产，要通过几种月旳一系列实验环节，下面按照制备单克隆抗体旳流程顺序，逐个简介其实验措施。
一、细胞融合前准备(一) 免疫方案选择合适旳免疫方案对于细胞融合杂交旳成功，获得高质量旳McAb至关重要。
一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原旳特性不同而定。
1.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得较好旳免疫效果。
下面以细胞性抗原为例旳免疫方案:初次免疫1×10７／0.5ml ip (腹腔内注射)↓2～3周后第二次免疫1×10７／0.5ml ip↓3周后加强免疫(融合前三天) 1×10７／0.5ml ip或iv(静脉内注射)↓取脾融合2.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。
规定抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水旳乳糜状，放一滴在水面上不易立即扩散呈小滴状表白已达到油包水旳状态。
商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀旳分枝杆菌充足混匀。
初次免疫 Ag 1～50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射│(一般0.8～1ml 0.2ml／点)↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip│(ip剂量不适宜超过0.5ml)↓3周后第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ip│ (5～7天后采血测其效价，检测免疫效果)↓2～3周后加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv↓3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原(特别是某些弱抗原)旳免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原旳免疫原性，另一方面可减少抗原旳使用量。
利用杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本原理
利用杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本原理一、引言单克隆抗体（Monoclonal Antibody，mAb）是由单一B细胞克隆产生的抗体，具有高度特异性和亲和力。
其制备方法主要有杂交瘤技术、酶联免疫吸附试验法（ELISA）、荧光激发技术等。
其中，杂交瘤技术是制备单克隆抗体最重要的方法之一。
二、杂交瘤技术基本原理1. B细胞与肿瘤细胞的融合杂交瘤技术的基本原理是将体内产生的特异性抗体B细胞与无限增殖能力的肿瘤细胞进行融合，形成可分泌大量同种特异性抗体的杂交瘤细胞。
在此过程中，B细胞提供了高度特异性的抗体基因组，而肿瘤细胞提供了无限增殖能力。
2. 杂交瘤细胞筛选和分离将获得的杂交瘤细胞进行筛选和分离，以获取单一同种特异性抗体产生的杂交瘤细胞株。
这里需要注意的是，筛选和分离的条件需要严格控制，以确保所得到的单克隆抗体具有高度特异性和亲和力。
3. 单克隆抗体的大规模制备通过对单克隆抗体杂交瘤细胞株进行培养和扩增，可以大规模制备单克隆抗体。
此过程中需要注意对培养条件、生长因子、营养物质等进行优化，以提高单克隆抗体的产量和质量。
三、杂交瘤技术的优点1. 高度特异性和亲和力通过杂交瘤技术制备的单克隆抗体具有高度特异性和亲和力，可以用于检测、诊断、治疗等领域。
2. 无限复制能力杂交瘤细胞具有无限复制能力，可以大规模制备同种特异性抗体。
3. 可重复性好由于单一B细胞产生的同种特异性抗体都是完全相同的，因此通过杂交瘤技术制备出来的单克隆抗体具有良好的可重复性。
四、杂交瘤技术存在的问题及解决方法1. 杂交瘤细胞的稳定性杂交瘤细胞的稳定性对于单克隆抗体的制备至关重要。
为了提高杂交瘤细胞的稳定性，可以采用多种方法，如对培养条件进行优化、添加生长因子等。
2. 克隆选择在杂交瘤技术中，克隆选择是一个非常重要的环节。
为了确保所得到的单克隆抗体具有高度特异性和亲和力，需要对杂交瘤细胞进行筛选和分离。
这里需要注意的是，筛选和分离的条件需要严格控制。
杂交瘤单抗的制备流程
杂交瘤单抗的制备流程杂交瘤单抗的制备呀，那可真是个超有趣又有点复杂的过程呢。
一、免疫动物。
咱们得先找个合适的小动物来进行免疫哦。
一般常用的就是小鼠啦。
为啥选小鼠呢？因为它好养呀，而且繁殖快。
我们要给小鼠注射我们想要制备单抗针对的那种抗原。
这个抗原就像是个小靶子，我们要让小鼠的免疫系统发现它，然后产生反应。
就好比是给小鼠的免疫系统出了一道题，让它想办法去解决这个外来的“小坏蛋”。
这一步可不能马虎呢，抗原的剂量、注射的途径还有注射的频率都很重要。
要是剂量不对呀，可能小鼠的免疫系统就不把这个抗原当回事儿；注射途径不对呢，可能抗原就不能很好地被免疫系统识别。
这就像我们平时学习，要是学习方法不对，就很难掌握知识一样呢。
二、细胞融合。
三、筛选杂交瘤细胞。
细胞融合之后，会出现各种各样的细胞组合，有没融合的骨髓瘤细胞，有没融合的脾细胞，当然也有我们想要的杂交瘤细胞。
这时候我们就得像个严格的裁判一样，把我们想要的杂交瘤细胞挑出来。
这里就用到一种叫HAT的培养基。
这个培养基可神奇啦，没融合的骨髓瘤细胞在这个培养基里是不能生长的，因为它缺少一种酶。
没融合的脾细胞呢，它虽然能产生抗体，但是在体外不能一直分裂繁殖，所以也会慢慢死掉。
只有杂交瘤细胞，它既有骨髓瘤细胞的长生不老的能力，又有脾细胞产生抗体的本事，所以它能在HAT培养基里茁壮成长。
这个过程就像是在一堆沙子里找金子一样，得小心翼翼又充满耐心呢。
四、克隆化培养。
把杂交瘤细胞筛选出来之后，还不能松口气呢。
因为这些杂交瘤细胞可能还不完全一样，我们得把它们一个个分开，让它们单独生长，这就是克隆化培养。
这个过程有点像把一群小朋友分开，让每个小朋友都有自己的小房间一样。
我们可以用有限稀释法或者软琼脂平板法来进行克隆化。
有限稀释法就是把杂交瘤细胞稀释到很低的浓度，然后让每个细胞都在一个小的培养孔里生长。
软琼脂平板法呢，就是把细胞放在软琼脂里，让单个细胞在琼脂里形成一个小的细胞团。
单抗制备步骤及注意事项
单抗制备步骤及注意事项脾细胞的准备：1.将Balb/c小鼠拉颈脱臼处死，浸泡于75%酒精3～5min。
无菌操作取出脾脏，置于盛有5mL不完全培养液的平皿中，洗涤3次去除脾脏表面的脂肪和结缔组织。
2.将洗好的脾脏用剪刀剪成3～5个小块，然后将脾脏研碎，过细胞筛，收集细胞。
3.将脾脏细胞悬液在1000r/min条件下，离心5min，弃上清。
再以同样的方法洗涤离心一次。
4.将沉淀细胞重新悬浮于10mL不完全培养液中，计活细胞数，取108个脾淋巴细胞悬液备用。
注意事项：•免疫脾细胞一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，因为此时B 淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。
骨髓瘤细胞的准备：1.选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞。
2.取对数生长骨髓瘤细胞离心，用无血清培养液洗2次。
3.制备细胞悬液，计活细胞数。
4.调整细胞浓度，取107细胞悬液备用。
注意事项：•常用的骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2/0、X63、Ag8.653等。
•骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内生产大量McAb。
•骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI-1640基础培养液，DMEM培养基。
小牛血清的浓度一般在10～20%。
细胞的最大密度不得超过106个/mL。
•一般扩大培养以1:10稀释传代，每3～5天传代一次。
细胞的倍增时间为16～20小时。
•一般准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HAT的敏感性，每3～6个月应用8～AG（8氮杂鸟嘌呤）筛选一次，以防止细胞的突变。
•保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95%，也是决定细胞融合的关键。
细胞融合：1.将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10 或1:5的比例混合，加入20～50mL RPMI-1640培养液。
2.在1000r/min条件下离心8min，弃上清，用滴管轻轻吸净残留液体。
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体内诱生法（IN ANIMALS） 体外诱生法（IN CELLS） 研究进展（RESEARCH PROGRESS）
体内诱生法
预处理：腹腔注射0.5ml液 态石蜡或降植烷 1~2周后
取Balb/c雌性 经产鼠若干只
接种10天左右 腹腔内接种1ml对数生长 期的杂交瘤细胞悬浮液
化代谢 OPTICELL 培养系统过程、控制抗体表达周期、
促进抗体表达和转运、翻译后加工等方面取得了较大进
展
谢谢大家
得到的单克隆抗体有限，不 能超过特定的细胞浓度
每天要换培养液，且细胞对 剪切力和环境非常敏感
会积累有毒的代谢产物
血清培养干扰抗体活性，影 响抗体分离，增加成本
牛初乳免疫球蛋白IgG单克隆抗体的制备
利用标准 IgG蛋白作为免疫原，免疫 6周龄 Balb/c 雌性小鼠，运用
淋巴细胞杂交瘤技术，通过间接 ELISA法筛选，采用有限稀释法，经 过 3次克隆筛选，获得2株稳定分泌抗 IgG蛋白的杂交瘤细胞株，单抗 细胞注射小鼠腹腔收集腹水；亚类鉴定试剂盒确定单抗细胞亚类；测 定收集小鼠腹水的抗体效价。
体内诱生法
1 随着分子生物学的飞跃发展，人—鼠嵌合抗体、人源化 抗体、完全人源性单克隆抗体应运而生 2 嵌合单克隆抗体和由转基因小鼠、噬菌体展示技术、核 糖体展示技术及共价展示技术所制备的单克隆抗体取得 了激荡人心的丰硕成果
体外诱生法
1 细胞培养用生物反应器有很大的发展：空纤维固定术、
徽胶囊术、空气升液器、生物反应大量培养术、恒化器 培养、OPTICELL培养系统 2 细胞表达抗体的研究在抗细胞凋亡、促细胞增殖、优
注射器抽取腹水， 得到大量单克隆抗体
腹水的杂交瘤细胞
Advantages
Disadvantages
可得到大量的腹水单抗
获的抗体浓度高 操作简便、经济
腹水中常混有小鼠的各种杂 蛋白（包括Ig），提纯困难 有污染动物病毒的危险 鼠源性单抗有抗原性，在人 体内产生人抗鼠抗体，降低 治疗效果又诱发变态反应
抗CPV-2a单克隆抗体的制备
纯化鼠,运用淋巴细
胞杂交瘤技术，间接 ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,采用有限稀释
法对阳性杂交瘤细胞进行3次亚克隆，得到4株稳定分泌单克隆抗体 的杂交瘤细胞，单抗细胞注射小鼠腹腔收集腹水；亚类鉴定试剂盒
确定单抗细胞亚类；测定收集小鼠腹水的抗体效价。
腹腔有自然吞噬作用，避免 组织污染造成的杂交瘤细胞 生长不良 腹腔本身为杂交瘤细胞良好 培养坏境，使其始终处于对 数生长期
体外诱生法 将杂交瘤细胞置于 培养瓶进行培养
一段时间
收集培养上清液
得到单克隆抗体
离心去除细胞及其碎片
Advantages
Disadvantages
减少鼠类动物疾病给产物带 来的污染 ; 避免鼠的其它抗体 的存在 过程可以工程化和自动控制 , 提高了重演性 可以采用单元操作法培养 , 随 着规模增大, 降低生产成本