细胞因子检测方法课件

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夹心ELISA
• 缺点：不能显示出单个细胞产生细胞因子的同一 性和频率性的直接信息
• 细胞内细胞因子的免疫荧光检测 • ELISPOT • 原位杂交 • 单一细胞PCR
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细胞内细胞因子的流式细胞仪 检测
• 原理：Brefeldin(BFA)、Monensin阻断了胞内高尔 基体介导的转运方法，使得细胞因子聚集、蓄积， 增强细胞因子信号，可被流式细胞仪检测。
量
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注意事项
实验前： • 确定试剂盒在有效期内 • 仔细阅读说明书 • 按说明书确定所有试剂齐全（数量、体积） • 根据检测标本数量确定所需试剂的量 • 按说明书将所用试剂平衡至室温，配制所需试剂
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注意事项
标本的制备和贮存 ： • 血清、血浆标本 ：尽快分装 ，贮存在-70℃ ，避
• 特点：
• 快速 简便：无需组织培养，可以全血分析，无需分离PBMCs； 灵敏度高：高度灵敏的荧光标记与检测系统； 高效：在同一细胞内同时检测两种或更多种细胞因子，也可 根据细胞免疫表型区分分泌细胞因子的细胞亚群； 接近生物体的分析条件：全血检测保留细胞及生化微环境更 准确反映了体内状况。
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生物分析法
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（一）依赖性细胞株
• 一些肿瘤细胞株必须依赖于细胞因子方能在 体外增殖，如DTLL细胞株依赖IL-2；FDC-PL细胞 株依赖于小鼠IL-3；TF-1细胞株依赖于人IL-3和人 GM-CSF，因而可利用这些依赖细胞株检测相应的 细胞因子。这种方法敏感性高，特异性也不错， 但可异的是并非所有细胞因都能找到相应的细胞 株，因而限制了它的应用。
免反复冻融 。使用前将标本平衡至室温，不能用 水浴锅 • 细胞培养上清液：1500g离心10～15分钟去除细胞 和细胞残渣。
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注意事项
试剂盒贮存条件和有效期 • 未开封试剂盒：贮存在2-8℃ • 开封/复溶试剂 ：2-8℃可以1个月左右 • 标准品：分装并贮存在-20℃以下，1个月，避免
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夹心ELISA
• 第1步，包被捕获抗体到96孔板中，BSA阻断后加 入标准品或者标本
• 第2步，加入酶标的抗体，结合被捕获的细胞因子 • 第3步，加入酶的底物显色，酶标仪或者化学发光
议读取结果（OD：optical density） • 第4步，绘制标准曲线，计算标本中细胞因子的含
• 免疫学检测法比较简单，迅速，重复性好，但所测定 的只代表相应细胞因子的量而不代表活性，同时敏感 度也低于生物活性检测法（约低10～100倍）。
• 分子生物学法只能检测基因表达情况，不能直接提供 有关因子的浓度及活性等资料，主要用于机制探讨。
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影响因素
• 原理与方法 • 灵敏度 • 准确度和特异性 • 精密度 ：免疫分析法的精密度较其生物分析法有
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mRNA的测定
（1）分子杂交实验 （2）逆转录PCR（RT-PCR）
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小结
• 生物学检测法比较敏感，又可直接测定生物学功能， 是最可靠的方法，适用于各种实验目的，是科研部门 最常用的技术，但需要长期培养依赖性细胞株，检测 耗时长，步骤繁杂，影响因素多，不容易熟练掌握。
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（二）功能检测
• 利用一些细胞因子的功能特性，可建立相应的活 性测定方法，如干扰素的抑制病毒感染效应，肿 瘤坏死因子对L929细胞的杀伤作用等。这样的方 法敏感性高，但特异性不够，容易受一些扰因素 的影响。
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免疫分析法
（1）放免实验（RIA） （2）酶联免疫吸附实验（ELISA）
反复冻融 • 微孔板：将未使用的板条用箔纸包好，加上干燥
剂沿四周封口。2-8℃可以1个月左右
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检测方法的进展
• 高通量细胞因子检测
• CBA(Cytometric Bead Array)是一种微珠多用途检 测分析技术，它由一系列的微珠组合来捕获并结 合流式细胞仪技术检测细胞培养液、EDTA血浆、 血清样本中被检测物质的量。其采用夹心法分析 策略，与传统的ELISA分析技术相比，此方法可以 同时检测多项指标。用已知的标准品和对照标准 曲线就可以得出被测样本的浓度。此分析方法不 受样本量的限制，而且可以得到一个样本的多个 数据。
较大提高 ；批内变异通常为20%～25%，因此有必 要进行2次或3次检测 • 标准化
生物分析法和免疫分析法结合使用
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免疫分析法
• ELISA • 细胞内细胞因子的流式细胞仪检测 • ELISPOT
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ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
• 用途：检测单个细胞内多个细胞因子；并可区分 表达特定细胞因子的细胞亚群。
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细胞内细胞因子的流式细胞仪 检测
• 方法：用抗细胞因子抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志组 合，即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌，同时采用特殊 的化学与抗体选择，确保静止与无细胞因子分泌细胞的最小 荧光背景。
• 1． 间接ELISA（Indirect ELISA）：用于筛检抗体（抗 特定抗原成分的特异性抗体）。此法是测定抗体最常 用的方法。
• 2． 夹心ELISA（Sandwich ELISA）：用于检测目的抗 原的量。其优点是避免了对特异性抗体的直接标记， 但增加了操作步骤和测定时间。
• 3． 竞争ELISA（Competitive ELISA）用于确定抗原特 异性或待检标本中含交叉反应成分时为了提高实验的 特异性而使用的一种方法。根据标记抗原与同种未标 记待测抗原与抗体间发生竞争性结合的原理，主要用 于测定小分子抗原。
细胞因子检测方法
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背景
• 细胞因子检测是判断机体免疫功能的一个重要指 标
• 疾病的诊断、病程观察、疗效判断及细胞因子治 疗监测等
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• （一）依赖性细胞株 ：生物分析法 • （二）功能检测 ：生物分析法 • （三）免疫测定 ：免疫分析法 • （四）功能测定与抗体抑制 • （五）分子杂交技术 ：mRNA的测定 • （六）多聚酶链反应技术（PCR）：mRNA的测定