实验方法---单抗制备
单抗制备的原理及过程
单抗制备的原理及过程嘿，咱今儿就来讲讲单抗制备的那些事儿！你知道吗，单抗就像是我们身体里的小战士，专门去对付那些坏家伙。
单抗制备啊，就好比是一场奇妙的旅程。
首先呢，得有个好的起点，那就是选择合适的抗原。
这抗原就像是小战士要攻击的目标，得找得准准的。
然后呢，把这个抗原送进动物体内，比如小白鼠啦。
这小白鼠就像是一个训练基地，让免疫系统在里面好好练兵。
经过一段时间，免疫系统就会产生针对这个抗原的抗体啦。
这时候，就像在茫茫人海中找到了那个特别的战士。
可是呢，这里面的抗体可不都是我们想要的单抗哦，这就需要我们去筛选啦。
筛选的过程就好像是沙里淘金，得仔细又耐心。
把那些不是单抗的抗体都去掉，只留下我们的宝贝单抗。
这可不容易呢，就像在一堆石头里找出那颗最闪亮的宝石。
接下来，就是要让单抗不断繁殖啦。
这就像是让小战士不断成长壮大，组成一支强大的军队。
通过细胞培养等技术，让单抗越来越多。
然后呢，还得对这些单抗进行各种检测和优化，确保它们个个都是精兵强将。
这就像是给战士们配备最好的武器和装备，让他们在战场上能发挥最大的作用。
你说这单抗制备是不是很神奇？就像变魔术一样，从一个小小的抗原，最后变成了能治病救人的神奇单抗。
单抗在医学上的作用可大了去啦！可以帮助诊断疾病，就像一个敏锐的侦探，能快速找出疾病的线索。
还可以治疗疾病呢，就像一个勇敢的战士，直接冲向病魔，把它们打得落花流水。
想想看，如果没有单抗，那得有多少病人得不到有效的治疗呀！所以说，单抗制备真的是太重要啦！这就像是为人类的健康筑起了一道坚固的防线。
咱们的科学家们可真是厉害呀，他们不断探索，不断创新，让单抗制备技术越来越先进。
他们就像是一群勇敢的开拓者，在未知的领域里披荆斩棘，为我们带来希望和健康。
所以啊，大家可别小看了这单抗制备，它背后蕴含着无数人的努力和智慧呢！让我们一起为单抗制备点赞，为科学家们加油吧！。
单抗制备的详细步骤
免疫应答反应中，取脾细胞与骨髓瘤细胞 融合，特异性杂交瘤的形成高峰分别为第 4 天和第 22 天，在初次免疫应答时获得的 杂交瘤主要分泌 IgM 抗体，再次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌 IgG 抗体。笔者 体会阳性杂交瘤出现的高峰与小鼠血清抗体的滴度并无明显的平行关系，且多在血清 抗体高峰之前。因此，为达到最高的杂交瘤形成率需要有尽可能多的浆母细胞，这在 最后一次加强免疫后第 3 天取脾进行融合较适宜。已有人报道采用脾内免疫，可提高 小鼠对抗原的免疫反应性，且节省时间，一般免疫 3 天后即可融合。
(1) 抗原制备 制备单克隆抗体的免疫抗原，从纯度上说虽不要求很高，但高纯度的 抗原使得到所需单抗的机会增加，同时可以减轻筛选的工作量。因此，免疫抗原是越 纯越好，应根据所研究的抗原和实验室的条件来决定。一般来说，抗原的来源有限， 或性质不稳定，提纯时易变性，或其免疫原性很强，或所需单抗是用于抗原不同组分 的纯化或分析等，免疫用的抗原只需初步提纯甚至不提纯，但抗原中混杂物很多，特 别是如果这些混杂物的免疫原性较强时，则必须对抗原进行纯化。检测用抗原可以是 与免疫抗原纯度相同，也可是不同的纯度，这主要决定于所用筛检方法的种类及其特 异性和敏感性。 (2) 免疫动物的选择 根据所用的骨髓瘤细胞可选用小鼠和大鼠作为免疫动物。因为， 所有的供杂交瘤技术用的小鼠骨髓瘤细胞系均来源于 BALB/c 小鼠，所有的大鼠骨髓 瘤细胞都来源于 LOU/c 大鼠，所以一般的杂交瘤生产都是用这两种纯系动物作为免 疫动物。但是，有时为了特殊目的而需进行种间杂交，则可免疫其他动物。种间杂交 瘤一般分泌抗体的能力不稳定，因为染色体容易丢失。就小鼠而言，初次免疫时以 8-12 周龄为宜，雌性鼠较便于操作。 (3) 免疫程序的确定 免疫是单抗制备过程中的重要环节之一，其目的在于使 B 淋巴 细胞在特异抗原刺激下分化、增殖，以利于细胞融合形成杂交细胞，并增加获得分泌 特异性抗体的杂交瘤的机会。因此在设计免疫程序时，应考虑到抗原的性质和纯度、 抗原量、免疫途径、免疫次数与间隔时间、佐剂的应用及动物对该抗原的应答能力等。 没有一个免疫程序能适用于各种抗原。现用的免疫程序中多数是参照制备常规多克隆 抗体的方法。表 6-1 列举了目前常用的免疫程序。免疫途径常用体内免疫法包括皮下 注射、腹腔或静脉注射，也采用足垫、皮内、滴鼻或点眼。最后一次加强免疫多采用 腹腔或静脉注射，目前尤其推崇后者，因为可使抗原对脾细胞作用更迅速而充分。在 最后一次加强免疫后第 3 天取脾融合为好，许多实验室的结果表明，初次免疫和再次
(仅供参考)单抗的制备方法(实验室Protocol)
单抗的制备方法1，免疫BALB/c 小鼠的免疫 BALB/c 小鼠的免疫按常规方法进行，二免后一个星期分别用断尾抽真空法采血200μL 进行抗体检测，二免采血后让小鼠休息两周进行加强免疫，三天后融合。
表1 BALB/c 小鼠的免疫方案（供参考）免疫次数 时间免疫剂量（μg/ mL ） 免疫方法 佐 剂 首免 二免 加强0d21d42d (融合前三天) 100 100 200 颈背部皮下 腹腔注射 腹腔注射 弗氏完全佐剂 弗氏不完全佐剂 不加佐剂2，BALB/c 小鼠的抗体检测2.1 BALB/c 小鼠血清的制备将采集的全血样品于37℃温箱放置30min 后，4℃放置半天，待血清析出后， 4 500r/min ，离心10min ，用移液器吸出血清，4℃放置待检。
2.2 间接ELISA 法的建立BALB/c 小鼠免疫后，用间接ELISA 法对其血清抗体水平进行检测，间接ELISA 法步骤如下：包被： 4℃包被过夜。
洗板：弃去包被液，拍干，向酶标板内加入洗涤液，每孔200μL ，3～5min 后倒掉洗涤液，再拍干。
如此重复三次。
加待检血清：将血清用ELISA 洗涤液从1：10 000开始进行倍比稀释(即 1：10 000、20 000、40 000、80 000、160 000、320 000、640 000、1 280 000)，共8个浓度。
将稀释好的血清按浓度由低至高的顺序加入酶标板内，每孔100μL ，每只小鼠的血清做两列，在37℃温箱内孵育30min 。
同时设阴性血清对照。
洗板：同上。
加HRP 标二抗：工作浓度1：10 000，每孔100μL ，在37 ℃温箱内孵育30min 后，洗板三次。
显色：加底物(TMB-过氧化氢脲)，每孔100μL ，37℃温箱放置10min ，加2mol/L H 2SO 4终止显色反应，每孔50μL ，用酶标仪测定OD 450值。
结果判定：P/N ≥2，判为阳性(P 、N 分别为待检和阴性血清的OD450值)。
实验方法---单抗制备
抗D-二聚体单克隆抗体的制备和鉴定1 材料和方法1.1 实验材料1.1.1 动物和细胞6周龄BALB/c雌鼠，体重18～22g，购于武汉大学实验动物中心；小鼠骨髓瘤细胞SP2/0细胞。
1.1.2 试剂小牛血清（NCS）——56℃灭活30分钟过滤除菌、HT及HAT选择培养液（筛选杂交瘤细胞，Sigma 公司）、8-氮杂鸟嘌呤（8-azaguanine）、RPMI 1640、Hank's液、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG （HRP-GAM-IgG）及鼠源McAb亚类检测试剂盒（Sigma公司/ Roche公司）、Western blot 试剂盒（Roche 公司）、96孔和24孔细胞培养板、5%脱脂奶粉、ELISA板、FPLC（快速蛋白液相层析）、弗氏完全和不完全佐剂（Sigma公司）、D-二聚体标准品、台盼蓝染色细胞存活率检测试剂盒（Sigma公司）、二甲基亚砜（DMSO，分析纯）、75%酒精。
1.1.3 主要仪器设备CO2培养箱、液氮、细胞计数板、酒精灯、玻璃平皿、平底烧瓶、200目不锈钢网筛、细胞培养板、培养瓶、解剖器械（剪刀和镊子）、加样枪及枪头（黄，蓝，白）、一次性无菌塑料离心管（15ml）、滤菌器、PH试纸、酶标仪、蛋白检测仪、蛋白纯化系统、高速冷冻离心机、低速大容量多管离心机、层析柱、倒置显微镜、电热干燥箱。
1.2 方法1.2.1 动物免疫首次免疫以100ug D-二聚体+完全佐剂按1：1乳化，于小鼠颈背部皮下多点注射；第二次和第三次改为不完全佐剂，其他免疫指标不变，于小鼠颈背部皮下多点注射。
注射量均为0.3ml/只。
1.2.2 ELISA法测定小鼠血清效价小鼠血清抗体效价应>1:10 000，融合前3天加强免疫一次。
1.2.3细胞融合前的准备1.2.3.1 骨髓瘤（浆细胞瘤）细胞的选择和培养：骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。
单抗制备步骤及注意事项
单抗制备步骤及注意事项脾细胞的准备：1.将Balb/c小鼠拉颈脱臼处死，浸泡于75%酒精3～5min。
无菌操作取出脾脏，置于盛有5mL不完全培养液的平皿中，洗涤3次去除脾脏表面的脂肪和结缔组织。
2.将洗好的脾脏用剪刀剪成3～5个小块，然后将脾脏研碎，过细胞筛，收集细胞。
3.将脾脏细胞悬液在1000r/min条件下，离心5min，弃上清。
再以同样的方法洗涤离心一次。
4.将沉淀细胞重新悬浮于10mL不完全培养液中，计活细胞数，取108个脾淋巴细胞悬液备用。
注意事项：•免疫脾细胞一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，因为此时B 淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。
骨髓瘤细胞的准备：1.选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞。
2.取对数生长骨髓瘤细胞离心，用无血清培养液洗2次。
3.制备细胞悬液，计活细胞数。
4.调整细胞浓度，取107细胞悬液备用。
注意事项：•常用的骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2/0、X63、Ag8.653等。
•骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内生产大量McAb。
•骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI-1640基础培养液，DMEM培养基。
小牛血清的浓度一般在10～20%。
细胞的最大密度不得超过106个/mL。
•一般扩大培养以1:10稀释传代，每3～5天传代一次。
细胞的倍增时间为16～20小时。
•一般准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HAT的敏感性，每3～6个月应用8～AG（8氮杂鸟嘌呤）筛选一次，以防止细胞的突变。
•保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95%，也是决定细胞融合的关键。
细胞融合：1.将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10 或1:5的比例混合，加入20～50mL RPMI-1640培养液。
2.在1000r/min条件下离心8min，弃上清，用滴管轻轻吸净残留液体。
单抗制备的详细步骤
单抗制备的详细步骤单抗（monoclonal antibody）是由单一细胞母克隆细胞系产生的抗体，具有高度特异性和一致性。
单抗制备的过程通常包括免疫原的选择、动物免疫、细胞融合、克隆筛选和克隆扩增等步骤。
下面将详细介绍这些步骤。
第一步，免疫原的选择。
免疫原是制备单抗必不可少的关键组成部分。
免疫原的选择应基于目标抗体的特异性和重要性。
常用的免疫原包括蛋白质、多肽、多糖、细胞表面分子等。
为了提高免疫原的免疫原性，可以将免疫原与佐剂混合，以增强其免疫原性。
第二步，动物免疫。
将选择的免疫原注射到合适的动物体内。
常用的免疫动物包括小鼠、大鼠、兔子等。
在免疫过程中，通常需要多次免疫，在每次免疫之间有一定的间隔时间，以增强免疫效果。
在免疫的过程中，可以通过采血检测免疫反应的进展，并决定最佳的免疫时间点。
第三步，细胞融合。
在免疫过程中，免疫细胞会产生针对免疫原的抗体。
为了制备单抗，需要将这些抗体产生的免疫细胞与癌细胞进行融合，形成杂交瘤细胞。
常用的癌细胞包括骨髓瘤细胞、葡萄膜炎细胞等。
第四步，克隆筛选。
将细胞融合密度适宜的细胞悬浮液均匀分配到培养皿中，使单个杂交瘤细胞分布在不同的培养皿中。
培养皿中含有特定选择性培养基，使只有杂交瘤细胞能够存活和生长。
在适当的条件下，杂交瘤细胞会形成一个细胞克隆。
然后，可以通过ELISA、细胞培养和动物注射等方法对克隆的细胞上清液进行筛选，以检测是否含有特定的抗体。
第五步，克隆扩增。
通过继续培养和传代，可以扩增含有特定抗体的细胞克隆。
克隆扩增的时间可能需要数周或数月，具体取决于细胞系的生长速度和特性。
最后，可以将克隆扩增的细胞培养液进行纯化和浓缩，以获得高纯度的单抗。
通常使用亲和层析、离心、电泳等技术进行单抗的纯化。
单抗制备的最终产品可以用于医学研究、诊断和治疗等领域。
尽管以上步骤可以概括标准的单抗制备过程，但实际制备中可能因为不同的实验目的和具体需求而存在一些变化。
制备单抗是一个复杂而耗时的过程，需要专业的实验技术和丰富的经验。
单抗体制备
单抗体制备引言单抗（monoclonal antibody）是指来源于单一克隆细胞的抗体，具有高度特异性和高亲和力。
单抗在医学、生物工程和疾病治疗等领域具有广泛应用前景。
本文将介绍单抗的制备方法，包括杂交瘤细胞制备、单克隆细胞培养和纯化等步骤。
一、杂交瘤细胞制备杂交瘤细胞是由B淋巴细胞（B lymphocyte）和骨髓瘤细胞（myeloma cell）融合而成的细胞系，具有无限增殖能力和产生单克隆抗体的能力。
制备杂交瘤细胞的步骤如下：1.1.采集B淋巴细胞从免疫动物（如小鼠）的脾脏或淋巴结中采集B淋巴细胞。
这些细胞是免疫系统中产生抗体的关键细胞。
1.2.准备骨髓瘤细胞选择一种骨髓瘤细胞系，如NS-1细胞或SP2/0细胞，作为杂交瘤的母细胞。
这些细胞具有无限增殖能力，适合用于制备杂交瘤细胞。
1.3.融合细胞将采集到的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞按照一定比例混合，加入聚乙二醇等融合剂，使细胞融合为杂交瘤细胞。
融合后的细胞称为杂交瘤。
二、单克隆细胞培养杂交瘤细胞具有无限增殖能力，但并不能产生单一的抗体。
为了获得单克隆抗体，需要对杂交瘤细胞进行单克隆化培养。
2.1.稀释培养将融合后的杂交瘤细胞进行稀释培养，使细胞以单个细胞的形式分散在培养基中。
这样可以使每个细胞形成一个单克隆。
2.2.筛选单克隆细胞将稀释后的杂交瘤细胞进行筛选，通常采用限稀稀释法或HTP法。
限稀稀释法是在培养基中加入一定浓度的杂交瘤细胞，使每个细胞在培养皿上形成单个克隆。
HTP法则是将杂交瘤细胞分装到96孔板中，每个孔中只有一个细胞，便于单克隆的筛选。
2.3.培养和扩增单克隆细胞将筛选出的单克隆细胞进行培养和扩增，可以使用无血清培养基，添加合适的生长因子和抗生素，促使细胞的生长和分裂。
三、单抗纯化经过单克隆细胞培养，可以得到大量的单克隆抗体，但其中还含有其他蛋白质和杂质。
为了获得纯净的单抗，需要进行纯化步骤。
3.1.采集培养上清将培养单克隆细胞的上清液收集起来，其中含有分泌的单克隆抗体。
单抗制备实验报告
一、实验背景单克隆抗体（Monoclonal Antibody，简称mAb）是一种具有高度特异性和亲和力的抗体，由单个B细胞克隆产生。
单抗在生物医学研究、疾病诊断、治疗药物研发等领域具有广泛的应用。
本实验旨在通过细胞融合技术制备小鼠单克隆抗体，并对其特异性、亲和力和效价进行鉴定。
二、实验材料1. 实验动物：雌性小鼠，体重18-22g。
2. 试剂与耗材：淋巴细胞分离液、Ficoll、RPMI-1640培养基、胎牛血清、链霉素、青霉素、聚乙二醇（PEG）、小鼠抗小鼠IgG-FITC、兔抗小鼠IgG-HRP、ELISA 试剂盒、抗体稀释液、抗体亲和层析柱等。
3. 仪器：超净工作台、显微镜、酶标仪、离心机、冰箱、培养箱等。
三、实验方法1. 动物免疫（1）选择雌性小鼠，将其随机分为两组，每组10只。
（2）对实验组小鼠进行免疫，每次免疫剂量为1mg抗原，间隔2周进行第2次免疫。
（3）对照组小鼠仅给予生理盐水注射。
2. 细胞分离与培养（1）免疫后第3周，处死实验组小鼠，无菌操作取出脾脏。
（2）将脾脏剪碎，加入Ficoll分层液，进行细胞分离。
（3）收集单个核细胞，用RPMI-1640培养基洗涤2次，计数。
（4）将脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行混合，加入PEG进行细胞融合。
（5）将融合后的细胞进行培养，选择杂交瘤细胞。
3. 单抗制备（1）将杂交瘤细胞进行扩大培养，收集培养上清。
（2）用ELISA试剂盒检测培养上清中的抗体效价，筛选出高亲和力抗体。
（3）将高亲和力抗体进行亲和层析纯化。
4. 单抗鉴定（1）用小鼠抗小鼠IgG-FITC和兔抗小鼠IgG-HRP进行Western blot检测，鉴定单抗的特异性。
（2）用ELISA试剂盒检测单抗的效价。
（3）用抗体亲和层析柱对单抗进行亲和力测定。
四、实验结果1. 动物免疫实验组小鼠在免疫过程中未出现明显异常，免疫成功。
2. 细胞分离与培养成功分离出脾细胞和骨髓瘤细胞，细胞融合率为90%。
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抗D-二聚体单克隆抗体的制备和鉴定1 材料和方法1.1 实验材料1.1.1 动物和细胞6周龄BALB/c雌鼠，体重18～22g，购于武汉大学实验动物中心；小鼠骨髓瘤细胞SP2/0细胞。
1.1.2 试剂小牛血清（NCS）——56℃灭活30分钟过滤除菌、HT及HAT选择培养液（筛选杂交瘤细胞，Sigma 公司）、8-氮杂鸟嘌呤（8-azaguanine）、RPMI 1640、Hank's液、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG （HRP-GAM-IgG）及鼠源McAb亚类检测试剂盒（Sigma公司/ Roche公司）、Western blot 试剂盒（Roche 公司）、96孔和24孔细胞培养板、5%脱脂奶粉、ELISA板、FPLC（快速蛋白液相层析）、弗氏完全和不完全佐剂（Sigma公司）、D-二聚体标准品、台盼蓝染色细胞存活率检测试剂盒（Sigma公司）、二甲基亚砜（DMSO，分析纯）、75%酒精。
1.1.3 主要仪器设备CO2培养箱、液氮、细胞计数板、酒精灯、玻璃平皿、平底烧瓶、200目不锈钢网筛、细胞培养板、培养瓶、解剖器械（剪刀和镊子）、加样枪及枪头（黄，蓝，白）、一次性无菌塑料离心管（15ml）、滤菌器、PH试纸、酶标仪、蛋白检测仪、蛋白纯化系统、高速冷冻离心机、低速大容量多管离心机、层析柱、倒置显微镜、电热干燥箱。
1.2 方法1.2.1 动物免疫首次免疫以100ug D-二聚体+完全佐剂按1：1乳化，于小鼠颈背部皮下多点注射；第二次和第三次改为不完全佐剂，其他免疫指标不变，于小鼠颈背部皮下多点注射。
注射量均为0.3ml/只。
1.2.2 ELISA法测定小鼠血清效价小鼠血清抗体效价应>1:10 000，融合前3天加强免疫一次。
1.2.3细胞融合前的准备1.2.3.1 骨髓瘤（浆细胞瘤）细胞的选择和培养：骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。
常用骨髓瘤细胞系有：SP2／0、NS1、P3/X63-Ag8.653等。
骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基。
小牛血清的浓度一般在10～20％，细胞浓度以104～105/ml为宜，最大密度不得超106／ml，一般扩大培养以1：3～1∶10稀释传代，传代培养要保持细胞的对数生长期（约105细胞/毫升，细胞形态规则要一致，圆而亮，有一定的立体感，机能要活跃，活细胞数在90—95%以上。
要得到这种细胞，其培养技巧在于，在融合前24小时，将生长良好的细胞全部自瓶壁冲下来，并除去1/2或更多的细胞，加入新鲜培养液令细胞重新贴壁分裂增繁），每3～5天传代一次，细胞的倍增时间为16～20小时，一般可间隔3天更换一次培养液（一般一传三或把一瓶细胞弃去一半后再一传二，这样24小时后又全部长满。
）。
细胞在传代过程中，部分细胞可能有返祖现象，应定期用8-氮杂鸟嘌呤进行处理（15～20ug／ml），HGPRT阳性细胞利用8-AG后，合成毒性核苷酸而死亡，只有HGPRT阴性细胞能持续生长，从而避免细胞的返祖现象，使生存的细胞对HA T呈均一的敏感性。
上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴壁（半贴壁）生长，无须用姨蛋白酶消化，直接用吸管轻轻吹打即可使细胞分散。
骨髓瘤细胞的最高生长浓度为9X105／ml，倍增时间通常为10～15h。
一般在准备融合前两周就应开始复苏骨髓瘤细胞（融合前经8-氮杂鸟嘌呤筛选2周）。
用于融合试验前必须做对HAT选择培养基敏感性试验。
由于HGPRT酶缺损，DNA合成障碍细胞应发生死亡，否则有变异，不能用于试验。
为阻止出现返祖现象，确保该细胞对HAT的敏感性，在筛选建株时应在含8-氮杂鸟嘌呤致死剂的培养液中（20～30mg/L）培养一代后（条件摸索：两代），换成常规培养基培养。
融合细胞应选择处于对数生长期、细胞形态和活性佳的细胞（活性应大于95％），在细胞融合前1天用新鲜培养基调细胞浓度为2×105／ml，一般次日即为对数生长期细胞。
每3～6月应用8-AG（8氮杂鸟嘌呤）筛选一次，以防止细胞的突变。
复苏的主要步骤及注意事项见《医用细胞工程》第111页。
1.2.3.2 免疫脾细胞的制备：免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞一般取最后一次加强免疫3天以后（第4天，融合当天）的脾脏，制备成细胞悬液，由于此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。
脾细胞悬液的制备：a 摘除小鼠眼球放血，留作阳性对照。
b 拉颈处死小鼠，用75%的酒精浸泡消毒小鼠皮毛3～5分钟。
c 无菌条件下打开腹腔取出脾脏，去除脂肪和结缔组织，用无血清的培养液（1640）或Hank's液洗去红细胞。
d 置不锈钢筛网上用注射器内芯研磨成细胞悬液后吸入小试管中，直立小试管3 min使大块的结缔组织下沉，把脾细胞悬液吸入离心管中（不锈钢筛网置于玻璃平皿中，加入洗液，用注射器内芯研磨好后，再用适量洗液将不锈钢筛网上的脾细胞冲入平皿）。
e 用洗液洗2次，再用无血清1640洗一次。
洗液充满离心管，经1000 r / min离心5 min（与此同时开始制备骨骼瘤细胞）。
f 弃上清加入完全培养基（10%FCS的RPMI 1640），用吸管吹打分散，收集上层悬液，除去沉下的大块。
g 用计数板进行细胞计数（第125页），细胞计数，并用培养基调整适当的细胞浓度（1～２×10８/L左右）置室温待融合用；以台盼兰染色用显微镜检查，活细胞数应高于80%为合格。
一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的２倍，细胞数为1～２.5×10８/L左右。
1.2.3.3 饲养细胞的制备：为防止细胞融合时因损伤而难以生长、促进杂交瘤细胞生长、增加克隆数，常需制备饲养层细胞。
可用肉汤刺激小鼠腹腔并收获腹腔中的巨噬细胞，该细胞有助于清洁培养表面和吞噬死亡细胞。
小鼠腹腔巨噬细胞的制备：小鼠采用与免疫小鼠相同的品系，常用BaLb／c小鼠6～10周龄↓拉颈处死浸泡于75％酒精，消毒3～5分钟↓用无菌剪刀剪开腹部一小口，剥开皮肤，露出腹腔↓用无菌注射器注入5ml培养液↓反复冲洗，吸出液体/ 右手固定注射器，左手持酒精棉球轻轻按摩腹1min，抽回腹腔内液体↓放入10ml离心管，1000转／分离心10min洗一次↓用10％小牛血清（NCS）选择培养液（HAT）混悬10～15ml；台盼兰染色计数活细胞，并调整细胞数至1～2×10５／ml。
（如果融合后发现培养孔中饲养细胞数量少，则可以在细胞换液时再入一些。
）↓加入96孔？板包板培养，100μl／孔↓放入37℃CO2孵箱培养一般在融合前一天制备饲养细胞，一只小鼠可获得3～5×106个腹腔巨噬细胞，可供一次融合用，亦可取两只小鼠腹腔巨噬细胞混合使用。
此外，同系小鼠胸腺细胞和脾细胞等亦可作为饲养细胞。
若用小鼠胸腺细胞作为饲养细胞时，细胞浓度为5×106／ml，小鼠脾细胞为1×106／ml，小鼠的成纤维细胞（3T3）1×105／ml，均为100μl／孔。
在制备饲养细胞时，切忌针头刺破动物的消化器官，否则所获细胞会有严重污染。
1.2.4细胞电融合用电融合仪进行细胞融合，骨髓瘤细胞与脾细胞的比值1：1（也可进行条件摸索，1：2、1：3等）。
融合后沉淀细胞悬浮于24 ml （不够可以少加一些）HA T培养基中，将细胞分种于含饲养细胞的24孔板中，0.5 ml /孔，置37℃、5%CO2培养箱中培养，每3～5天半量换HAT培养（吸出1/2旧液），15天后改用HT培养基，3周后改用普通完全培养液（完全RPMI 1640培养基）。
1.2.5HAT选择杂交瘤细胞及Ab检测筛选阳性细胞克隆融合后，大多数实验室在融合当天就加入HAT培养液，也可次日加入。
一般在融合后7～14天内使用HA T培养液，然后改用HT培养液（15天后）。
3～5天后未融合及自身融合的细胞逐渐死亡，1周左右可出现克隆，并不断增殖，一般在杂交瘤细胞布满孔底1/3～1/2面积时（约培养8～12天），即可取培养上清液进行特异性抗体检测，筛选出所需要的杂交瘤细胞系，同时补加新鲜培养液。
一旦检测到分泌预定抗体的克隆，应及时将阳性克隆转入培养瓶扩大培养，冻存部分克隆细胞，并尽快进行克隆化培养。
可靠的筛选方法必须在融合前建立，避免由于方法不当贻误整个筛选时机。
在一次较好的融合试验中，约70～80％孔有克隆生长。
所有生长克隆的孔都需要取培养上清液进行抗体活性检测。
检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法，一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。
本试验选用ELISA法，可用于可溶性抗原（蛋白质）、细胞和病毒等McAb的检测。
1.2.6杂交瘤阳性克隆化并扩大培养和细胞冻存克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。
经过HA T筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。
在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞；所需要的抗体（特异性抗体）分泌细胞和其它无关抗体分泌细胞。
要想将这些细胞彼此分开，就需要克隆化。
克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。
即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。
克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀释和软琼脂平板法。
1.2.6.1 有限稀释法的程序①阳性克隆化前一天制备饲养细胞悬液（同融合前准备）。
②取对数生长期的阳性孔细胞制成悬液，经台盼蓝染色计数，测定活细胞数及浓度（细胞存活率及单个细胞百分率应高于90%以上），用培养基在试管中稀释调整细胞数至1～5×10３／ml。
③取130个细胞放入6.5ml含饲养细胞完全培养液（HT-1640，10%NCS），即20个细胞／ml，100μl／孔加A、B、C三排（96孔板，每排12孔）为每孔2个细胞。
余下2.9ml细胞悬液补加2.9ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数为10个／ml，100μl／孔加D、E、F三排，为每孔1个细胞。
余下2.2ml细胞悬液补加2.2ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数5个／ml，100μl／孔，加G、H两排，为每孔0.5个细胞。
④次日在倒置显微镜下观察培养板各孔中的细胞数，挑选只含一个细胞的孔，做好标记并补加100ul 培养液继续培养。
⑤培养期间，视PH值的变化决定是否换液或补加培养液，1周左右，孔中有明显克隆出现（肉眼可见细胞克隆），及时进行抗体检测，扩大培养（待长至孔底面的1/3～1/2时，可将96孔中的单一克隆的细胞分别移至24孔板中进行扩大培养）并冻存细胞。