大肠杆菌电转化
大肠杆菌电转化感受态细胞制备.
大肠杆菌电转化感受态细胞制备第一天:1.将适合菌株(如XL1-Blue, DH5α置于LB或其他营养丰富的培养基上,在37°C 下过夜培养2.高温灭菌大的离心瓶(250-500ml以备第二天摇瓶用3.准备几瓶灭菌水(总量约1.5升,保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用第二天:4.转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB(或其他营养丰富的培养基的1-2升挡板摇瓶中5. 37°C下剧烈振荡培养2-6小时6. 定时监控O.D.600值(培养1小时后每半小时测定一次7. 当O.D.600值达到0.5-1.0时,从摇床中取出摇瓶,置于冰上冷却至少15分钟(需要的话这种方式可以存放培养液数小时8.细胞在4°C 5000g下离心15分钟,弃上清液(如需要,沉淀可在4°C的10%甘油中保存一两天9.用灭菌的冰水重悬浮细胞。
先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中(几毫升,然后加水稀释至离心管的2/3体积。
10.照上面步骤重复离心,小心弃去上清液11.照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞12.离心,弃上清液13.用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞14.照上面步骤离心,小心弃去上清液(沉淀可能会很松散15.用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml16. 将细胞按150μl等份装入微量离心管,于-80°C保存转化方法:1. 在冰上解冻电感受态细胞添加1-10μl DNA ,冰上培育约5分钟2. 添加1-3μl DNA ,冰上培育约5分钟3. 转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器(无泡中4. 加载P1000,准备好300μl LB 或2xYT5. 对电穿孔容器进行脉冲(200 欧姆, 25μFd, 2.5 千伏(检查时间常数,应该在3以上6. 立即添加300μl 的LB或2xYT至电穿孔容器中7. 37°C下培养细胞40分钟至1小时以复原8. 转移细胞至适当的选择培养基上培养大肠杆菌感受态细胞制备及转化中的影响因素1、感受态细胞的概念重组DNA分子体外构建完成后,必须导入特定的宿主(受体细胞,使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状,这个导入过程及操作统称为重组DNA 分子的转化。
电转化条件对大肠杆菌TG1转化效率的影响
第２７卷第３期吉林农业科技学院学报Ｖｏｌ.２７Ｎｏ.３２０１８年９月ＪｏｕｒｎａｌｏｆＪｉｌｉｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＳｅｐ.２０１８电转化条件对大肠杆菌ＴＧ１转化效率的影响刘㊀麒ꎬ王阔鹏ꎬ于凌娇ꎬ刘倩宏∗摘㊀要:研究探索不同条件对ＴＧ１大肠杆菌转化率的影响ꎬ以探索最适合电转化条件ꎮ研究通过对细菌生长曲线绘制ꎬ改变不同生长阶段㊁感受态细胞浓度㊁转化后复苏液以及复苏时间㊁电转化参数㊁质粒浓度㊁抗生素浓度等影响电转化率的条件ꎬ探索最适合的电转化条件ꎮ结果表明ꎬＴＧ１大肠杆菌３７ħ㊁１７０ｒｐｍ/ｍｉｎ震荡活化培养时间３ｈ后ꎬ以电压１８００Ｖ㊁电容２５μＦ㊁电阻２００Ω进行电击转化ꎬ以ＬＢ液体对电击细胞复苏４５ｍｉｎꎬ为最佳转化条件ꎮ该结果具有可重复性ꎬ为后续建立基因文库奠定良好基础ꎮ关键词:大肠杆菌ꎻＴＧ１ꎻ电转化基金项目:吉林农业科技学院大学生科技创新项目(吉农院合字[２００９]第１１４３９０２４号)收稿日期:２０１８￣０３￣２６文章编号:１６７４￣７８５２(２０１８)０３￣０００６￣０４作者简介:刘麒ꎬ吉林农业科技学院动物科技学院学生ꎬ本科在读ꎻ刘倩宏ꎬ通讯作者ꎬ吉林农业科技学院动物科技学院副教授ꎬ博士ꎬ研究方向:布鲁菌病ꎮ(吉林㊀１３２１０１)转化是基因重组中的一项重要技术ꎬ是决定平末端连接效率及建立高质量基因文库的关键ꎮ将携带目的基因的质粒成功导入受体细胞的方法有两种:一种是氯化钙法ꎬ另一种是电转化法ꎮ电转化法是利用瞬间高压迫使细胞膜产生孔隙使质粒导入细胞ꎬ其转化率较高[１]ꎮ基因的平末端连接对转化率要求较严格ꎬ需要较高的转化率作为支撑ꎮ目前ꎬ在不同实验室环境的影响下ꎬ感受态细胞的制备以及转化条件都有所不同ꎮ为提高平末端连接㊁转化效率ꎬ进而建立较高质量的文库ꎬ因此本研究通过比较不同电转化条件下大肠杆菌ＴＧ１的转化效率ꎬ为后续噬菌体展示基因文库的建立奠定基础ꎮ１㊀试验材料与方法１.１㊀试验材料与主要仪器大肠杆菌菌株ＴＧ１本室－８０ħ保存ꎻｐＤＪ０１质粒为梅西大学ＪａｓｎａＲａｋｏｎｊａｃ教授惠赠ꎬ－８０ħ保存ꎻ大肠杆菌ＴＧ１株购自广州碧云天生物有限公司ꎻ质粒提取试剂盒购自康为世纪生物有限公司ꎮＬＢ液体培养液:量取胰蛋白胨２ｇꎬ酵母提取物２.０ｇꎬＮａＣｌ１.０ｇꎬ用去离子水定容补足体积至５００ｍＬꎮＳＯＣ培养液:在９５０ｍＬ去离子水中加入胰化蛋白胨２０.０ｇꎬ酵母提取物５.０ｇꎬＮａＣｌ０.５ｇꎬ加入１０ｍＬ２５０ｍｍｏｌ/ＬＫＣｌ溶液ꎬ用５ｍｏｌ/ＬＮａＯＨ调ｐＨ至７.０ꎮ用去离子水定容１Ｌꎬ高压蒸汽灭菌２０ｍｉｎꎬ备用ꎮ使用前加入５ｍＬ灭菌的２ｍｏｌ/ＬＭｇＣｌ２ꎬ高压灭菌后冷却至６０ħ或６０ħ以下ꎬ加２０ｍＬ除菌的１ｍｏｌ/Ｌ葡萄糖溶液[２]ꎮＬＢ固体培养基(含２０μｇ/ｍＬ氯霉素):称取胰蛋白胨２ｇꎬ酵母提取物２ｇꎬＮａＣｌ１ｇꎬ琼脂糖４ｇꎬ用去离子水定容补足体积至５００ｍＬꎮ待蒸汽灭菌后ꎬ将培养基放置水浴锅中ꎬ待温度降至４０ħ左右添加氯霉素以２０μｇ/ｍＬ的终浓度添加于培养基中ꎮＴＧＬ２０Ｍ离心机㊁超净工作台㊁电转仪(Ｂｉｏ￣ｒａｄ)㊁无菌恒温培养箱(Ｔｈｅｒｍｏｌ)ꎮ１.２㊀试验方法１.２.１㊀ｐＤＪ０１质粒提取㊀用接种环蘸取一定的菌液在新鲜的ＬＢ(含２０μｇ/ｍＬ氯霉素)固体培养基上交错划线ꎬ３７ħ倒置过夜培养ꎮ挑取单菌落接种于５ｍＬＬＢ(含２０μｇ/ｍＬ氯霉素)液体培养基中３７ħ㊁２００ｒｐｍ/ｍｉｎ过夜震荡培养ꎬ将菌液离心ꎬ利用康为世纪质粒提取盒提取质粒ꎮ１％琼脂糖凝胶电泳检测提取质粒浓度ꎮ１.２.２㊀ＴＧ１大肠杆菌生长曲线的绘制㊀取出－８０ħ保种的ＴＧ１大肠杆菌ꎬ用接种环蘸取一定的菌液在新鲜的ＬＢ固体培养基上交错划线ꎬ３７ħ过夜㊁静置培养ꎮ挑取单菌落接种于５ｍＬＬＢ液体培养液中ꎬ３７ħꎬ１７０ｒｐｍ/ｍｉｎ振荡过夜培养ꎬ此即为母液ꎮ按母液与ＬＢ液体培养液１ʒ１００比例ꎬ转接新鲜ＬＢ液体培养液中ꎬ３７ħꎬ１７０ｒｐｍ/ｍｉｎ振荡培养ꎬ每隔０.５ｈ取菌液０.５ｍＬꎬ直至培养９.５ｈꎬ取不同时间点菌液进行菌落计数ꎬ具体操作参照文献进行ꎬ绘制ＴＧ１株大肠杆菌生长曲线图[３￣４]ꎮ对经过培养的菌液用ＬＢ液体培养液进行１０倍稀释ꎬ稀释成１０－１~１０－１３ꎬ取不同稀释度菌液１００μＬ涂板计数ꎮ试验重复三次ꎮ１.２.３㊀ＴＧ１感受态细胞的制备㊀取２ｍＬ母液转接到２００ｍＬ新鲜的ＬＢ液体培养液中ꎬ３７ħ㊁１７０ｒｐｍ/ｍｉｎ振荡培养(振荡培养时间及条件根据１.２.２结果确定)ꎬ冰浴３０ｍｉｎꎮ将冰浴后的菌液分装至预冷的无菌离心管中ꎬ４ħ㊁５０００ｒｐｍ/ｍｉｎ离心２０ｍｉｎꎬ操作始终保持在冰浴环境下进行ꎮ将上清液吸出后ꎬ再用１０％无菌甘油水轻轻吹打重悬细胞ꎬ重复洗涤２次后分别用１０％无菌甘油水重悬细胞沉淀ꎮ每管１００μＬ分装至ＥＰ管中ꎬ－８０ħ保存备用ꎮ１.２.４㊀电转化㊀将２μＬｐＤＪ０１质粒加入１００μＬ感受态细胞中充分混合ꎬ电转化条件为电压１８００Ｖꎬ电容２５μＦꎬ电阻２００Ωꎬ０.１ｃｍ电击杯ꎬ进行电击ꎮ立刻加入５００μＬＬＢ保护受损细胞并转移到离心管中ꎬ再加入４００μＬＬＢ充分吹尽菌体加入到离心管中ꎬ３７ħ㊁１７０ｒｐｍ/ｍｉｎ振荡培养４５ｍｉｎꎬ用移液枪吸取１００μＬ涂于ＬＢ固体培养基(２０μｇ/ｍＬ氯霉素)ꎬ３７ħ恒温箱过夜培养ꎬ通过生长的菌落数评价转化效率ꎮ１.２.５㊀ＴＧ１菌株在不同生长阶段对电转化效率的影响㊀通过１.２.２确定的对数生长期ꎬ选取活化后１.５ｈ㊁２.０ｈ㊁２.５ｈ㊁３.０ｈ㊁３.５ｈ的ＴＧ１菌液ꎬ制备感受态细胞ꎬ进行电转化ꎬ条件同１.２.４ꎬ进行菌落计数检测电转化效率ꎮ１.２.６㊀感受态细胞浓度对转化率的影响㊀理论上感受态细胞的浓度越高其转化率越高ꎬ但过高的浓度会使菌体过于粘稠ꎬ不利于质粒与菌体混合ꎬ反而会降低其对质粒的转化率ꎮ按１.２.５优化的最佳条件制备感受态细胞后ꎬ将其分装在４管５０ｍＬ预冷的无菌离心管中ꎬ每管约１００μＬ菌体ꎬ分别加入１０％无菌甘油水进行１ʒ１㊁１ʒ３㊁１ʒ５㊁１ʒ７倍稀释ꎬ以确定感受态细胞制备最佳稀释浓度ꎮ将２μＬｐＤＪ０１质粒分别与不同稀释倍数的感受态细胞混合ꎬ电转化ꎬ其余操作同１.２.４ꎮ１.２.７㊀转化后复苏时间及复苏液对转化率的影响㊀对电击后细胞的复苏液的选取及复苏时间进行优化ꎮ将２μＬｐＤＪ０１质粒与１００μＬ感受态细胞混合ꎬ进行电转化操作同１.２.４ꎬ电击后立即加入９００μＬＬＢ液体培养液和ＳＯＣ培养液ꎬ３７ħ㊁１７０ｒｐｍ/ｍｉｎ振荡培养ꎬ分别在０.７５ｈ㊁１.５ｈ㊁２.０ｈ㊁２.５ｈ四个时间点取样ꎮ取不同复苏液及不同复苏时间的菌液样本５０μＬ进行涂板ꎬ恒温箱３７ħ倒置过夜培养ꎬ进行菌落计数ꎮ其余操作同１.２.４ꎮ图１图１.ｐＤＪ０１质粒提取结果１.提取质粒ｐＤＪ０１结果ꎻ２.１００００ｍａｒｋ(条带大小从下到上分别为１００ｂｐ.２５０ｂｐ.５００ｂｐ.７５０ｂｐ.１０００ｂｐ.１５００ｂｐ.２０００ｂｐ.３０００ｂｐ.５０００ｂｐ.１００００ｂｐ)１.２.８㊀电转化条件对转化率的影响㊀选用以下三组不同条件进行电转化:电压１８００Ｖ㊁电容２５μＦ㊁电阻２００Ω㊁０.１ｃｍ电击杯ꎻ电压２５００Ｖ㊁电容２５μＦ㊁电阻２００Ω㊁０.１ｃｍ电击杯ꎻ电压３０００Ｖ㊁电容２５μＦ㊁电阻２００Ω㊁０.２ｃｍ电击杯ꎮ电转化后操作与１.２.４相同ꎬ培养后进行观察ꎮ１.２.９㊀质粒浓度改变对转化率的影响㊀分别取１００ｎｇ/ｍＬ㊁５０ｎｇ/ｍＬ㊁２５ｎｇ/ｍＬ不同浓度的ｐＤＪ０１质粒２μＬ与１００μＬ感受态细胞充分混合ꎬ冰浴静置５ｍｉｎ进行电转化ꎬ操作与１.２.４相同ꎬ根据结果评价质粒浓度改变对转化率的影响ꎮ１.２.１０㊀抗生素浓度对转化率的影响㊀向ＬＢ固体培养基中添加氯霉素使其浓度为１０μｇ/ｍＬ㊁２０μｇ/ｍＬ㊁４０μｇ/ｍＬꎮ利用１.２.８优化的电转化参数对其进行电转化操作后ꎬ分别将其涂布于氯霉素浓度分别为１０μｇ/ｍＬ㊁２０μｇ/ｍＬ㊁４０μｇ/ｍＬ的ＬＢ固体培养基上ꎮ其余操作同１.２.４ꎬ根据结果评价抗生素对转化效率的影响ꎮ２㊀结果２.１㊀ｐＤＪ０１质粒提取结果ｐＤＪ０１质粒提取结果见图１ꎮｐＤＪ０１质粒大小约为１５００ｂｐꎬ在预期位置发现目的条带ꎬ并估算其浓度约为１００ｎｇ/μＬꎮ２.２㊀大肠杆菌ＴＧ１生长曲线的绘制分别取活化后不同时间点ＴＧ１菌液ꎬ绘制细菌生长曲线ꎬ结果见图２ꎮ从图中可看出ꎬ１.５ｈ至５ｈＴＧ１处于对数生长期ꎮ细菌处于对数生长期时的形态㊁染色特性㊁致病性㊁抗药性等生物特征最为典型ꎬＴＧ１生长曲线的绘制对于后续系列转化条件的优化至关重要ꎮ７第３期刘㊀麒ꎬ等:电转化条件对大肠杆菌ＴＧ１转化效率的影响图２大肠杆菌ＴＧ１生长曲线图３ＴＧ１菌株在不同生长阶段对转化率的影响图４细胞浓度对转化率的影响图５ＴＧ１转化时间及复苏液对转化率影响结果图６电转化条件对转化率的影响２.３㊀ＴＧ１菌株在不同生长阶段对电转化率的影响分别取活化后１.５ｈ㊁２.０ｈ㊁２.５ｈ㊁３.０ｈ㊁３.５ｈ的大肠杆菌ＴＧ１菌液制备感受态细胞ꎬ电转化ꎬ进行菌落计数ꎬ结果见图３ꎬ经统计学分析ꎬ各组间差异极显著(ｐ<０.０１)ꎬ因此在活化后３.０ｈ时ꎬ其电转化效率最高ꎮ２.４㊀感受态细胞浓度对转化率的影响取活化后３.０ｈ菌液制备感受态细胞ꎬ以１０％无菌甘油水稀释制备好的感受态细胞ꎬ电转化后确定不同感受态细胞浓度对转化效率的影响ꎬ结果见图４ꎮ经统计学分析ꎬ１组(１ʒ１倍稀释)㊁２组(１ʒ３倍稀释)㊁３组(１ʒ５倍稀释)之间结果无显著差异(ｐ>０.０５)ꎬ１组㊁２组㊁３组与４组(１ʒ７倍稀释)之间结果差异极显著(ｐ<０.０１)ꎬ试验以１ʒ１倍稀释浓度为最佳操作条件ꎮ２.５㊀电转化后复苏培养液及复苏时间对转化率的影响选用ＬＢ和ＳＯＣ不同复苏液对电击后感受态细胞进行复苏ꎬ结果见图５ꎮ用ＬＢ复苏液复苏电击后细胞效果明显优于ＳＯＣ复苏液ꎬ经统计学分析ꎬ差异极显著(ｐ<０.０１)ꎮ选取ＬＢ复苏液后分别摇动０.７５ｈ㊁１.５ｈ㊁２.０ｈ㊁２.５ｈ后ꎬ从图５看出并经统计学分析ꎬ不同复苏时间对转化效率没有影响ꎮ经统计学分析ꎬ差异不显著(ｐ>０.０５)ꎬ因此试验选用电击后复苏０.７５ｈꎮ选取ＳＯＣ复苏液后分别摇动０.７５ｈ㊁１.５ｈ㊁２.０ｈ㊁２.５ｈ后ꎬ从图５看出并经统计学分析ꎬ差异不显著(ｐ>０.０５)ꎬ不同复苏时间对转化效率没有影响ꎮ因此试验选用电击后复苏０.７５ｈꎮ２.６㊀电转化条件对转化率的影响分别设定三组不同电击参数及不同厚度电击杯ꎬ确定其对转化效率影响ꎬ结果见图６ꎮ从图中可以看出第１组即电压１８００Ｖꎬ电容２５μＦꎬ电阻２００Ωꎬ电转化效率最高ꎬ并经统计学分析ꎬ１组与２组㊁３组间差异极显著(ｐ<０.０１)ꎬ为最佳电转化参数ꎮ２.７㊀质粒浓度的改变对转化率的影响选取１００ｎｇ/ｍＬ㊁５０ｎｇ/ｍＬ㊁２５ｎｇ/ｍＬ不同浓度的ｐＤＪ０１质粒２μＬ与１００μＬ感受态细胞充分混合后ꎬ从图７看出１００ｎｇ/ｍＬｐＤＪ０１质粒转化效率最佳ꎬ经统计学分析ꎬ１组与２组㊁３组间差异极显著(ｐ<０.０１)ꎬ为最佳质粒浓度ꎮ２.８㊀抗生素浓度对转化率的影响向ＬＢ固体培养基中分别添加１０μｇ/ｍＬ㊁２０μｇ/ｍＬ㊁４０μｇ/ｍＬ浓度的氯霉素ꎬ从而确定不同浓度抗生素对转化效率的影响ꎮ结果见图８ꎬ抗生素浓度为２０μｇ/ｍＬ时转化率最高ꎬ恰好适宜转化后的细胞增殖并抑制杂菌生长ꎬ经统计学分析ꎬ１组与２组㊁３组间差异极显著(ｐ<０.０１)ꎬ在氯霉素含量为２０μｇ/ｍＬ的条件下ꎬ转化效率最高ꎮ８吉林农业科技学院学报㊀㊀㊀第２７卷图７质粒浓度的改变对转化率的影响图８抗生素浓度对转化率的影响３㊀讨㊀论感受态细胞的制备和转化已经成为分子生物学实验中的一项常规操作ꎬ常见转化方法包括电转化法㊁ＭｇＣｌ２￣ＤＭＳＯ法㊁ＬｉＡｃ和ＣａＣｌ２法等ꎬ而电转化法相对成本较低㊁操作简单㊁转化效率较为理想ꎬ转化条件因实验室不同ꎬ结果也不尽一致ꎬ而且不同的菌株对电转化的反映程度不同ꎬ所用的转化效率和转化条件一定不同[５￣８]ꎮ研究对大肠杆菌ＴＧ１转化条件进行了探索ꎬ为后续平端连接以及建库打下良好的基础ꎮ电压是决定电转化效率的重要参数ꎬ通过运用高电压将细胞的细胞壁电击出可以使大分子物质通过的小孔ꎮ由于利用强电压对细胞进行电击将会对细胞造成极大的损伤ꎬ在此过程中会使较多的细胞受损死亡以及生存受限而难以得到高转化率ꎬ并且死亡的菌体会严重影响细菌的生存空间从而限制其生长ꎮ因此ꎬ严格选择适宜的电压是进行电转化试验时ꎬ达到预期效果和必需条件的重点ꎮ经过试验摸索最适电压为１８００Ｖꎬ此电压电击转化率最好ꎮ研究对ＳＯＣ㊁ＬＢ两种复苏液的效果也进行了比较ꎮＳＯＣ复苏液营养物质含量较ＬＢ更加丰富ꎬ但其对电击后细菌的生长并没有明显促进作用ꎬ即使在复苏过程中ꎬ菌体沉淀量远多于ＬＢ复苏液ꎬ事实上并没有在转化率上体现出来ꎬ分析其原因可能是因为ＳＯＣ复苏液丰富的营养ꎬ相对而言只加速了未受损细胞的生长速度ꎬ而对转化率则没有明显促进作用[９]ꎮ这与黄学娟ꎬ张金迪ꎬ张壮等人的研究不符ꎬ其原因可能是由于试验条件与环境不同而造成的差异ꎮ４㊀结㊀论在本实验室条件下大肠杆菌ＴＧ１株感受态细胞最优制备条件为:ＴＧ１大肠杆菌母液按照１ʒ１００导入新鲜ＬＢ液体培养液后ꎬ３７ħ㊁１７０ｒｐｍ/ｍｉｎ活化培养３ｈꎬ感受态终浓度１.４ˑ１０７ꎬ复苏液选用ＬＢ液体培养液ꎬ复苏时间为３.０ｈꎻ最佳电转化条件:为电压１８００Ｖꎬ电容２５μＦꎬ电阻２００ΩꎬｐＤＪ０１质粒浓度为１００ｎｇ/μＬꎬ氯霉素浓度２０μｇ/ｍＬꎮ参考文献:[１]唐颜苹ꎬ王小媚ꎬ何薇ꎬ等.大肠杆菌感受态细胞保存条件的研究[Ｊ].华中农业大学学报ꎬ２００８(６):７４５￣７４８.[２]萨姆布鲁克Ｊ.分子克隆实验指南[Ｍ].３版.北京:科学出版社ꎬ２００２.[３]代军.大肠杆菌感受态细胞制备及转化条件优化[Ｊ].江苏农业科学ꎬ２０１５(４):５３￣５４.[４]宋晓蕾ꎬ周芬芬ꎬ吴湜ꎬ等.ｓｐｏ０Ａ基因在艰难梭菌生长及芽孢形成中的作用[Ｊ].中国感染与化疗杂志ꎬ２０１７(１):３３￣３６.[５]ＪａｎｋｏｖｉｃＤｒａｇａｎａꎬＣｏｌｌｅｔｔＭｉｃｈａｅｌＡꎬＬｕｂｂｅｒｓＭａｒｋＷꎬｅｔａｌ.ＤｉｒｅｃｔｓｅｌｅｃｔｉｏｎａｎｄｐｈａｇｅｄｉｓｐｌａｙｏｆａＧｒａｍ￣ｐｏｓｉｔｉｖｅｓｅｃｒｅｔｏｍｅ.[Ｊ].Ｇｅｎｏｍｅｂｉｏｌｏｇｙꎬ２００７ꎬ８(１２):１８６￣１９１.[６]张岚岚ꎬ徐春燕ꎬ徐昌杰.大肠杆菌感受态细胞转化能力的影响因素[Ｊ].细胞生物学杂志ꎬ２００４(０４):４２９￣４３２.[７]朱森康ꎬ黄磊ꎬ李燕飞ꎬ等.制备高效大肠杆菌电转化感受态细胞和电转化条件的研究[Ｊ].生物技术通报ꎬ２０１１(１０):２０６￣２０９.[８]罗锋ꎬ余腾ꎬ范丽梅.感受态细胞制备和质粒转化冰浴时间对大肠埃希菌转化效率的影响[Ｊ].江汉大学学报(自然科学版)ꎬ２０１１ꎬ３９(０３):８２￣８５.[９]黄学娟ꎬ张金迪ꎬ张壮ꎬ等.一种优化的大肠杆菌感受态细胞制备及转化方法[Ｊ].基因组学与应用生物学ꎬ２０１７ꎬ３６(１２):５１９９￣５２０４.ʌ责任编辑:吴艳玲ɔ９第３期刘㊀麒ꎬ等:电转化条件对大肠杆菌ＴＧ１转化效率的影响。
大肠杆菌电转化及电转感受态细胞的制备
3.大肠杆菌电转化及电转感受态细胞的制备电转化法是利用瞬间高压在细胞上打孔，同时，DNA在电场力的作用下进入细胞，随后细胞复苏和弥合，从而实现质粒DNA的物理转移。
为避免电击时出现“击穿”，即产生电流，细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。
转化效率为109～1010转化子/µg DNA。
3.1．感受态细胞的制备（1）感受态细胞及材料准备同钙转化感受态细胞的制备相同。
（2）选合适的大肠杆菌在4℃，3000 rpm下离心10min，弃上清液（如需要，沉淀可在4℃的10%甘油中保存1～2天）。
（3）弃上清，离心管中加入少量ddH2O，轻柔的悬浮沉淀后，再将水注满离心杯，4℃，3000 rpm离心10min。
（4）重复步骤（3）1次。
（5）小心弃上清（沉淀可能会很松散），再往离心管中加入少量10%甘油（灭菌，预冷），重悬菌体，再加满10%甘油，4℃，4000 rpm离心10min。
（6）用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2～3ml，将细胞按200μl等份装入微量离心管，放置于－80℃下保存。
（7）按照钙转化感受态细胞方法进行转化效率和抗性检测。
3.2．电转化为了降低离子浓度，待转化的质粒DNA，如质粒或酶连产物，在电转化前应该进行纯化（乙醇沉淀），以下所有步骤都需要保持无菌操作。
（1）从－80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻；加入待转化的质粒DNA，冰浴10min；同时将电转化杯进行冰浴。
实际操作中，如果电转化杯浸泡在乙醇中，可提前取出电转化杯，在无菌的超净台上吹干。
（2）打开电转仪，调至Manual，调节电压为2.1KV。
特别注意，不同的电转化杯，所使用的电压不同。
防止电压不够，难以有效转化，以及，电压过高，击爆电转化杯，产生火花，产生危险。
（3）将冰浴后的感受态细胞（含DNA）转移到电转化杯中，轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电极杯的底部（注意：其体积以填充电转化杯到电极之间空间即可，具体的用量可参见具体所使用的电转化杯的说明）。
简述大肠杆菌转化法的原理
简述大肠杆菌转化法的原理
大肠杆菌转化法是一种重要的基因工程技术，用于将外源DNA片段引导入大肠杆菌细胞中。
其原理如下：
1. 准备质粒DNA：外源DNA片段被克隆到一个环状DNA分子上，称为质粒。
质粒中通常包含一个选择性的抗生素抗性基因，用于筛选带有插入物的转化菌落。
2. 制备有效的感受态细胞：将大肠杆菌细胞在低温条件下处理，使其处于亚温感受夹状态。
这样可使细胞外膜孔增大，利于DNA片段进入细胞。
3. 转化：将质粒DNA与感受态细胞混合，并通过热激冷冻法或电穿孔法等方式，增加DNA片段进入细胞的效率。
这些DNA片段会进入大肠杆菌细胞的质粒或染色体。
4. 恢复和培养：将转化后的细菌在适宜条件下恢复生长，使其表达并复制质粒中的外源DNA片段。
5. 识别重组菌落：在含有相应抗生素的培养基上培养细菌，通过筛选获得带有外源DNA片段的重组菌落。
这些菌落会在培养基中形成可见的生长。
通过大肠杆菌转化法，科研人员可以将外源DNA片段导入到细胞中，从而实现基因的增加、改变或删除。
这是基因工程研究和应用中常用的手段，对于生物医
学、农业和工业领域都具有重要意义。
电转化细胞制作及电转步骤
质粒电转化大肠杆菌感受态细胞操作步骤实验原理：利用瞬间高压造成细胞膜的不稳定，形成电穿孔，有利于DNA 等大分子进入。
因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生长前期的细胞，以使细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。
109〜1010转化子M g DNA。
,-电转化法制备大肠杆菌感受态细胞的实验步骤1.前夜接种受体菌（DH5a或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37 C 摇床培养过夜；2.取2ml过夜培养物转接于200ml LB培养基中，在37 C摇床上剧烈振荡培养至OD600=0.6 （约2.5-3 小时）；3.将菌液迅速置于冰上。
以下步骤务必在超净工作台和冰上操作4.吸取1.5ml培养好的菌液至1.5m l离心管中，在冰上冷却10分钟；5.4C下3000g冷冻离心5分钟；6.弃去上清，加入1500^ l冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；7.4C下3000g冷冻离心5分钟8.弃去上清，加入750^ l冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；9.4C下3000g冷冻离心5分钟10.加入20^ l冰冷10%的甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；11 .立即使用或迅速置于-70 C超低温保存。
-质粒电转化大肠杆菌感受态细胞操作步骤1.制备选择性培养基平板：在融化的250ml LA培养基中加入250^ l Amp （100mg/ml） , 250 诉l X-gal （20mg/ml）, 25 l IPTG （200mg/ml）,混匀后倒入灭菌培养皿中；2.取出制备好的感受态细胞，放在冰上融化；3.每管感受态细胞加入1^ l连接产物，用移液器轻轻吸打均匀，置冰上；4.电转化仪选择1800V作为输出电压；5.将要转化的混合物加入预冷的 1 mm的电转化杯中，立即按下按纽电击；6.立即加1ml SOC培养基到转化杯中重悬细胞；7.将细胞转入合适的培养管中37C培养1小时；8.吸取合适体积的菌液涂布已倒好的选择培养基平板；9.37C培养过夜，观察结果。
大肠杆菌电转糊板的原因
大肠杆菌电转糊板的原因
大肠杆菌电转糊板的原因可能有以下几个方面：
基因组差异：大肠杆菌的基因组在不同菌株之间存在一定的差异，这可能导致某些菌株在电转过程中更容易发生糊板现象。
细胞壁结构：大肠杆菌的细胞壁结构对电转糊板的发生也可能有影响。
一些细胞壁结构较为松散的菌株可能在电转过程中更容易发生糊板现象。
生长条件：大肠杆菌的生长条件如培养基成分、温度、pH等也可能影响电转糊板的发生。
例如，培养基中某些成分可能会影响细胞的通透性或细胞壁的稳定性，从而增加糊板的风险。
电转条件：电转条件如电场强度、电转时间、电极间距等也可能影响糊板的发生。
例如，过高的电场强度可能会导致细胞内物质泄漏，从而增加糊板的风险。
操作不当：在电转过程中，如果操作不当，如电极放置不当、电极间距过小等，也可能导致糊板现象的发生。
综上所述，大肠杆菌电转糊板的原因是多方面的，包括基因组差异、细胞壁结构、生长条件、电转条件和操作不当等。
为了减少糊板现象的发生，可以尝试优化电转条件、选择合适的生长条件和操作方法等措施。
同时，对于出现糊板现象的菌株，可以采用适当的处理方法，如离心洗涤、重新悬浮等，以提高电转的效率和质量。
大肠杆菌菌株感受态制备_电击转化及转化效率检测
大肠杆菌DH10B（Streptomycin resistant）电转化感受态制备1．从保存的甘油管中取出200 μL菌液到100 mL的LB液体中，37o C，200 rpm培养约13~16小时后（对数期），按2%接种到SOB培养基中；2．37o C，约2~2.5小时后，OD600约0.5左右，取出，冰上缓慢摇育30 min。
3．预先4o C降温的冷冻离心机离心收集菌体，用预冷的离心管，并时刻保持在冰上，5000 rpm离心5 min；4．用50~60 mL的冰预冷灭菌超纯水洗菌体两次，用枪吸打时一定要轻柔，并时刻保持在冰上，第二次洗时可以将2管的菌体并到一管，水洗过程离心的转速要高一些，约6000 rpm离心5 min，因为离心得不是很实，离心完后要立即倒掉上清，以免菌体重新悬浮造成损失；5．用50 mL的冰预冷灭菌10%甘油洗菌体两次，用枪吸打时一定要轻柔，并时刻保持在冰上，离心后立即倒掉上清；6．最后一次甘油洗涤后立即倒掉上清，视菌体量加入0~x μL的10%冰预冷甘油重新悬浮细胞，75~200 μL/管,分装到预冷的离心管中，电转化或立即放入-80o C冰箱保存，该感受态可以在-80o C保存半年。
SOB培养基（1L）：20 g Tryptone；5 g Yeast Extract；0.6 g NaCl；0.19 g KCl，8磅灭菌20 min。
注意事项：种子一定要新鲜，最好是从甘油管中直接液体活化的。
OD600控制在0.5左右，建库用的话千万不要过！过了0.6感受态效率不会太高，做一般克隆和质粒转化的要求可以适当放低。
菌体时刻保持冰上（4 o C以下）！尽量减少离开冰的时间。
最后分装的菌体浓度要浓。
对待菌体要尽量轻柔。
收集菌体用的管和枪头要灭菌，并在超净台操作。
电击转化1.75 μL的感受态细胞加入TE溶解的质粒和连接产物最好不要超过0.6 μL，不然容易击穿，如果质粒是用纯水溶解的可以适当提高，冰上放置10~30 min；2.洗干净并烘干的电转杯冰上预冷，快速将上述感受态细胞转到电转杯里，感受态细胞要位于杯子底部；3.此步骤动作要快：将杯子外壁擦干，2 mm的杯子用电转化程序Ec2，1 mm杯子用电转化程序Ec1，电击后立即加入900~1000 μL37o C预热的SOC（见分子克隆），轻柔吸打，转到2 mL的离心管中，37o C摇床，150 rpm，45~60 min后取适量涂平板。
大肠杆菌基因工程 (2)
大肠杆菌基因工程引言大肠杆菌(Escherichia coli)是一种广泛存在于自然界中的革兰氏阴性菌，它可以在动植物肠道中找到。
由于其生长快速、易于培养和转化，大肠杆菌成为了基因工程研究中最重要的模式生物之一。
大肠杆菌基因工程是通过改变大肠杆菌的遗传特征，实现对其功能的改造和优化，从而达到生产特定产物或解决特定问题的目的。
大肠杆菌基因工程的原理基因传递与插入大肠杆菌基因工程的核心在于将目标基因导入到大肠杆菌中。
目前常用的方法有以下几种：1.转化(transformation)：通过将外源DNA直接导入大肠杆菌细胞内，使其在细胞内复制和表达。
2.电转化(electroporation)：利用强电场将质粒DNA引入细胞内，使其与大肠杆菌细胞内的DNA重组。
3.病毒介导的转染(viral-mediated transduction)：使用病毒载体将目标基因导入大肠杆菌细胞内。
4.转座子介导的DNA转移(transposon-mediated DNAtransfer)：利用转座子将目标基因插入到大肠杆菌染色体的特定位点上。
基因表达与调控在大肠杆菌基因工程中，外源基因导入之后需要进行表达和调控，以产生所需的受体蛋白或产物。
常用的表达系统包括启动子-启动子区域-编码序列-终止子的结构。
其中，启动子可以选择适当的促进剂或抑制剂进行调节，以控制基因的表达水平和时机。
应用案例生物医药领域在生物医药领域，大肠杆菌基因工程被广泛应用于生产重组蛋白药物。
通过引入外源基因，大肠杆菌可以高效地合成重组蛋白，并通过分离和纯化得到高纯度的药物。
例如，利用大肠杆菌表达系统，可以生产出重组人胰岛素、生长激素等重要药物。
环境治理领域大肠杆菌基因工程还可以应用于环境治理领域。
例如，通过改造大肠杆菌的基因组，使其具有降解有机污染物的能力，可以用于处理工业废水和土壤污染。
此外，大肠杆菌的工程还可以用于制造生物能源，例如利用大肠杆菌产生生物柴油或生物氢。
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大肠杆菌电转化感受态细胞制备实验步骤和转化方法
实验步骤：
1、将适合菌株（如XL1-Blue, DH5α）置于LB或其他营养丰富的培养基上，在37℃下过夜培养。
2、高温灭菌大的离心瓶（250-500ml）。
准备几瓶灭菌水（总量约1.5升），保存于冷冻室中以备重悬浮细胞用。
3、转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB（或其他营养丰富的培养基）的1-2升挡板摇瓶中。
4、37℃下剧烈振荡培养2-6小时。
5、定时监控O.D.600值（培养1小时后每半小时测定一次），当O.D.600值达到0.5-1.0时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却至少15分钟（需要的话这种方式可以存放培养液数小时）。
6、细胞在4℃5000g下离心15分钟，弃上清液（如需要，沉淀可在4℃的10%甘油中保存一两天）。
7、用灭菌的冰水重悬浮细胞。
先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中（几毫升），然后加水稀释至离心管的2/3体积。
8、照上面步骤重复离心，小心弃去上清液。
9、照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞。
10、离心，弃上清液。
用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞14. 照上面步骤离心，小心弃去上清液（沉淀可能会很松散）。
11、用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml。
12、将细胞按150μl等份装入微量离心管，于-80℃保存。
转化方法:
1、在冰上解冻电感受态细胞添加1-10μl DNA ，冰上培育约5分钟。
2、添加1-3μl DNA ，冰上培育约5分钟。
3、转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器（无泡）中。
4、加载P1000，准备好300μl LB 或2xYT 。
5、对电穿孔容器进行脉冲（200 欧姆, 25μFd, 2.5 千伏）（检查时间常数，应该在3以上）。
6、立即添加300μl 的LB或2xYT至电穿孔容器中。
7、37℃下培养细胞40分钟至1小时以复原。
8、转移细胞至适当的选择培养基上培养。