培养基模拟灌装试验

关键因素十一: 干预措施
干预措施应该模拟实际运行时可能发生的情况；培养基灌装 记录中应该记录所有发生的干预措施，以及被移走产品的数 量。
常规的干预措施：对于无菌生产线的安装、拆卸和连接， 如果已经灭菌的部件脱离保护措施而被安装的话，是一个潜 在危险。因此，开始灌装的容器更容易反映出无菌设备装配 的潜在问题（注：如果正常生产过程中开始会有部分产品丢 弃的话，可以不进入培养计数，但是也可以进行培养，能提 供额外的信息）。
关键因素一:起始步骤
新版GMP第四十八条：。。。应尽可能模拟常规的 无菌生产工艺，并包括所有对结果有影响的关键生 产工序。。。 1、从配制开始：冻干制剂从液体配料开始，需要更多 量的培养基，考察的最全面。（如工艺要求配好的 液体需要在配制罐中蒸汽灭菌的应从配制开始） 2、从除菌过滤前开始：考察的内容包括除菌过滤系统， 考察较全面，培养基不需要灭菌，需要考虑生物负 荷。 3、从除菌过滤后面开始：只考察灌封等操作过程，培 养基需要事先灭菌。
培养基模拟 灌装试验
无菌的概念
什么是无菌? 理论上：无菌＝没有任何活的微生物 实际上：我们无法证明产品中没有活微生物 存在
无菌的概念
“无菌”的实际定义: ������ 经生长和繁殖证明无生物 ������ 实际为概率上的无菌，普遍接受的标准是： 最终灭菌无菌制剂：微生物存活的概率达到10-6，即保证一百
关键因素三: 培养基及培养条件 (1/3)
培养基必须适应广谱微生物的生长，包括需氧菌、 酵母菌和霉菌（非选择性培养基）。
较好的澄明度，较小的粘度，易于除菌过滤。 推荐使用大豆消化酪素琼脂培养基(SCD) ，以及大
豆胰蛋白胨肉汤(TSB)。 如果产品在缺氧条件、通常在氮气保护下灌装时，
目的
证明生产线采用无菌工艺生产无菌产品的能力 对人员进行资格确认 符合GMP的要求
试验前的准备工作
设备确认 通风系统（HVAC）、水系统的验证 设备的清洗和消毒CIP,SIP 灭菌工艺验证 湿热、干热灭菌工艺 除菌过滤的验证 空气过滤器的完好性检测 容器/胶塞密闭性测试 人员培训 洁净室环境达到设计要求
通常情况，在培养结束后，一些玻璃瓶（从生产开 始、中间、结束时取样）进行微生物接种。
关键因素三: 培养基及培养条件 (3/3)
培养温度 全部样品应在20-35℃(±2.5℃)下培养14天。通常在 20-25℃下 培养 7 天，然后在30-35℃下培养 7 天；或 者在30-35℃培养 7 天后，再转移到 20-25℃培养 7 天。
或在环境中分离出厌氧菌时，可能需要使用厌氧 培养基:液体硫乙醇酸盐培养基(FTM)。
关键因素三: 培养基及培养条件 (2/3)
培养基必须做促生长试验，按药典方法（10版药典 新规定）进行评价。有条件的推荐使用1~2种最常见 的环境分离菌。
促生长试验可以同步或14天培养后进行。用于促生 长试验的培养基培养前需经过同样的工艺步骤（例 如清洗、灭菌、充氮、灌装、冻干等）
关键因素五: 容器体积(2/2)
在最初的验证中，可以二次选用最大的容器（配合 一次最慢、一次最快的灌装速度），第三次选用最 小的容器（配合最快的灌装速度）。
在每年2次的再验证中，用其它规格尺寸的容器轮转 试验。
不能使用琥珀色的容器，而应该使用透明的容器， 保证可以目视检测到微生物的生长。
培养基灌装的原则
通常情况下，应该包括产品实际操作过程中可能发 生的“最差条件”
必须考虑可能采取那些干预措施 ?
最差条件 ������ 高于或低于正常范围的条件限度，与正常生产
条件相比最有可能造成工艺或生产失败的条件。 ������ 注意 ������ 如果某些做法会带来污染的风险，则不允许用
风险：结合了发生危害的可 能性和危害的严重性
评估风险的参数
严重性
可能性
风险评估
可能性 可探测性 严重性 风险
最终灭菌的 无菌制剂
较小
非最终灭菌 的无菌制剂
较大
很差 很差
严重 大 严重 很大
非最终灭菌制剂 的风险大不大？
我们如何做到上述的无菌保障水平
无菌生产工艺
什么是无菌生产工艺？
➢ 无菌生产工艺
在培养灌装过程中，微生物监测（主动或被动的 空气采样、设备表面、人员）以及悬浮粒子监测应 该按照日常的操作程序进行。包括间隔期间和不同 的人员。
微生物监测程序的详细原则，包括取样点的选择、 行动限和警戒线、方法学等可以参考PDA技术报告N0. 13。
工艺模拟实验中收集到的环境监测数据有利于建立 和支持正常无菌操作区域的环境监测的行动限。
✓ 产品、容器和密封件分别进行灭菌，然后进行灌 封
✓ 在极高洁净环境下进行灌装和密封 ✓ 产品在最终容器中不再做进一步的灭菌处理 ✓ 对各个组成部分的灭菌工艺需要进行严格验证和
监控 ✓ 在灌封前和灌封过程中的操作会带来污染风险
什么是无菌生产工艺？
生产环境 洁净区 人员
药液制备和过滤 药液除菌过滤前的微生物负荷 过滤器完整性测试和验证 生产设备和内包装材料的准备和灭菌 灌装过程 转运＼冻干＼轧盖 无菌工艺过程验证
一般生产量小于5000，培养基灌装数量应 等同批量；生产量大于5000时，培养基最 小灌装数量不少于5000。
一些法规中建议应该根据批量确定灌装的 数量。
关键因素五: 容器体积(1/2)
应该考虑到灌装容器的极端尺寸。 最大的容器（通常由于充填体积较大而导
致最小的充填速度）通常开口较大，所以从环 境中微生物侵入的潜在风险是最大的。 最小的容器（通常由于充填体积较小而导 致最大的充填速度）体现了最大的操作难度； 小的容器更容易破碎，稳定性差，在设备中更 容易破裂或堵塞。
万个已灭菌物品或制剂中存活的微生物数低于一。 非最终灭菌无菌制剂：目标是零生长，但在污染率低于0.1%，
可信度在95%时是可以接受的。
什么是污染率低于0.1%？
➢ 计算公式：实际污染率 = (95%置信限值)/(灌封容器 数) × 100%
培养基灌装试验的批量与判断合格的标准
批量（瓶）
3000 4750 6300 7760
灌装少于5000支时，不应检出污染品； 灌装在5000至10000时：
有1支污染需进行调查，并考虑重复培养基灌装 试验
2支污染需进行调查，并可即视作再验证的理由 灌装超过10000支时：
1支污染需进行调查 2支污染需进行调查，并可即视作再验证的理由 发生任何微生物污染时，均应进行调查。
关键因素十四:污染调查（1/9）
关键因素二: 试验的次数和频率
培养基模拟试验的初始验证，至少需要成功的连续 进行 3 次独立的模拟试验（建议在不同的工作日进 行试验）。
首次验证后，培养基模拟试验通常每年进行2次，每 次进行1批即可。
当生产线发生变更，并且经过评估可能对无菌生产 工艺有潜在危险时，应当进行额外的培养基灌装试 验。
调查的范围应包括 ������ 环境微生物监测数据，空气悬浮粒子监测数据 ������ CIP设备，清洁、消毒程序的执行情况 ������ 培养基、设备和零件的灭菌工艺，灭菌釜的校
允许污染的数量（瓶） 0
≤1 ≤2
≤3
无菌检查的局限性
• 试验目的：不合格的可能性(%) • 试验批量：60,000支 • 试验方法：按无菌测试方法
真实的不合格率 1％
测试20支样品 不合格的可能性
18.2%
5％
64.2%
15％
96.1%
测试40支样品 不合格的可能性
33.1%
87.2%
99.8%
速度，另外二次可以选用最高速度。 在生产线的每年2次的再验证中，模拟试验的速
度应该进行变换。
关键因素八:灌装的持续时间
通常情况，培养基灌装的时间应该足够长，能够 包括所有的必需的干扰、生产中断，包括正常的 无菌操作如开始前的安装、重量或体积的调整、 改变设备或手动维修等，还包括更衣、暂停、换 班等，持续时间还应能反映出潜在的人员疲劳。
什么是无菌生产工艺？
Environment 环境
原料
人Pe员rsonnel
工艺验证
无菌检验
作业环节与风险
作业环节 验证难易度 人员依赖程度
灭菌
易
低
房间设计
N/A
N/A
环境监测
中等
可变
消毒
难
高
更衣
难
很高
物品转移
难
高无菌技术（灌封） 难很高无菌装配难
很高
相关风险 低 中等 高 高 很高 高 很高 很高
模拟过程最好有全程录像，瓶子或托盘应编号，阳 性样品可追溯。每个瓶子都要目视检查，阳性的样 品应别标记并移出培养箱。
破损的样品不应包括在对无菌工艺能力的评价中。 但破损的来源应被调查和纠正。
关键因素十三: 可接受标准
新版GMP第四十八条：培养基模拟试验的目标是 不出现长菌，且遵循以下原则：
其它的常规干预措施：胶塞供给， 移走掉落的玻璃瓶, 移 走堵塞的胶塞，人员的停顿，换手套，环境的监测。
非常规的干预措施（意外发生）：玻璃瓶破裂，灌装针 头的更换或重新安装，装量调整的干预，传感器故障，传输 带的调整等。
关键因素十二:容器的检查
任何灌装的产品都应该在培养前进行检查，发现任 何不合格品（如容器密封性存在问题或完整性不好） 时，都应该被剔除并记录。（还包括检查后被损坏 的如向培养箱中转移的过程中）
仅仅参加（看）是不够的，操作人员（包括设备安 装人员）必须执行他们在正常生产中会进行到的操 作。
应该确定无菌操作间可以最多容纳的操作人员数 量（n+1）。
当一个企业有多个班次工作时，第二个班次、第 三个班次也应该包括在培养基灌装试验的计划中。 包括班次的更换、暂停和必要的更衣。