WB过程中常见的问题及可能原因分析
WB常见问题的解答
Western Blot详解Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术:一、原理二、分类i.放射自显影ii.底物化学发光ECLiii.底物荧光ECFiv.底物DAB呈色三、主要试剂四、主要步骤五、实验常见的问题指南1.参考书推荐2.针对样品的常见问题3.抗体4.滤纸、胶和膜的问题5.Marker的相关疑问6.染色的选择7.参照的疑问8.缓冲液配方的常见问题9.条件的摸索10.方法的介绍11.结果分析一、原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
二、分类现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。
只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
三、主要试剂1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。
WB免疫印迹实验常见问题全汇总
【干货收藏贴】WB常见问题精品全集锦做了很久的WB（western blot），走了很多弯路，但是WB想要做好并不难，总结WB实验中可能会遇到的问题，分析可能的原因及对应的解决方案，这就是实验成功的基石。
以下，我们先解决很多技术菌的疑惑，然后再着手汇总实验中常见问题和可能原因分析以及给出建议解决方案。
WB常见问题分析1.为什么我的细胞提取液中没有检测到目的蛋白？原因有很多：a) 细胞中不表达这种蛋白质，换一种细胞；b) 细胞中的蛋白质被降解掉了，可加入蛋白酶抑制剂，抑制蛋白酶活性；c) 抗体不能识别目标蛋白，多看看说明，是否有问题；d) 酶降解可能是没有保持低温操作，样品保存不当，样品放置时间过长。
2.我做的蛋白质分子量很小（10KDa），请问怎么做WB？a)可以选择PSQ 膜，同时缩短转移时间。
也可以将两张膜叠在一起，再转移。
其他按步骤即可；b)也可选择孔径0.22um的PVDF膜或者NC膜，转膜时间缩短，另外可采用Tricine-SDS-PAGE体系。
3.我的目的带很弱，如何加强？a)可以加大抗原上样量，这是最主要的；b)也可以将一抗稀释比例降低；c)还可以延长曝光时间。
4.DAB好还是ECL好？DAB 有毒，但是比较灵敏，是HRP 最敏感的底物；ECL结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值，就特别灵敏，可以检测pg 级抗原。
5.胶片是一片空白，是怎么回事？如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。
a) 二抗的HRP 活性太强，将底物消耗光；b) ECM底物中H2O2，不稳定，失活；c) ECL底物没覆盖到相应位置；d) 一抗选择不当二抗失活；e) 二抗失活。
6.磷酸化抗体的检测样本制备时是否一定要加NaF等？NaF是一种广谱磷酸化酶的抑制剂，一般最好加。
但是不加也可以，大部分时候是不用加的。
7.细胞水平要做WB，多少细胞提的蛋白够做WB？一般5×106就足够。
wb实验过程中的各种问题和解决方法
wb实验过程中的各种问题和解决方法在进行WB实验过程中，可能会遇到一些问题，下面是一些常见问题和相应的解决方法。
1.染料溶液没有颜色或颜色很浅。
解决方法：-检查染料溶液是否过期，如果过期需要更换新的溶液。
-检查染料溶液的浓度是否正确，可能需要重新制备一份更浓的溶液。
-检查染料溶液的保存条件是否正确，染料溶液应避光保存，并且在低温下保存。
2.染料在染色过程中不均匀。
解决方法：-在染色前先将细胞均匀地分布在载玻片上，可以通过离心或其他方法来实现。
-在染料溶液中加入混匀剂，如液体洗涤剂，以帮助染料均匀地渗透到细胞内。
-改变染色时间和温度，染色时间过长或温度过高都可能导致染料渗透不均匀。
3.染色结果不明显。
解决方法：-检查抗体的质量，可能需要更换新的抗体。
-检查染色的时间和温度，染色时间过短或温度过低可能导致染色结果不明显。
-检查染色液的浓度，可能需要调整染色液的浓度以获得更明显的染色结果。
-提高显微镜的放大倍数，以便更清楚地观察染色结果。
4.细胞在染色过程中丧失形态。
解决方法：-确保在染色前细胞的状态良好，新鲜的细胞应该被使用。
-降低染色液的渗透压，使用低渗透压的缓冲液来进行染色。
-控制染色液的温度，避免用过高或过低的温度来处理细胞。
5.染色结果有杂质。
解决方法：-使用高纯度的试剂和试验设备，避免使用过期的试剂。
-对比试验，使用负对照来排除非特异性染色引起的杂质。
-进行洗涤步骤时，确保从载玻片上完全洗去所有未结合的染料。
6.染色结果无法观察到。
解决方法：-检查显微镜的镜头和光源是否正常，可能需要清洁镜头或更换光源。
-调整显微镜的对焦和光源的亮度，以找到最佳的观察条件。
-检查染色实验的结果是否正常，可能需要重新实验。
在进行WB实验时，还应注意以下问题：1.实验操作要准确无误，遵循实验方案的步骤和要求。
2.注意个人防护，佩戴实验室服和防护手套等个人防护用品。
3.注意实验器材的清洁与消毒，避免交叉污染。
4.正确保存和处理实验样品和废弃物，按照实验室安全规范进行处理。
WB问题分析
WesternBlot问题解答1.凝胶肿胀或卷曲：注意转膜之前，切割下来的凝胶一定要在转膜缓冲液中浸泡平衡5-10分钟，要含有20%的甲醇。
2.条带歪斜、或漂移:因为转膜仪使用时间太长，两块板之间的海绵由于长期使用变得很薄。
当按照阴极-海棉-滤纸-胶-膜-滤纸-海绵依次放好后两块板不能压紧，因而在胶和膜之间可能存在潜在的间隙，电转移时蛋白从胶和膜之间的空隙中流走，形成如图所示的形状。
使用十几张普通的草纸垫在两块海棉之间，条带就可以变得非常的漂亮。
另外，转膜时转膜液一定要浸没凝胶和膜，否则也可能出现上述情况。
3.单个或多个白点：转膜时在膜与胶之间有气泡。
做三明治时一定要逐层压紧，赶尽气泡。
同时转膜液要提前配置好，加好甲醇，保证转膜前夜体内气泡排净。
气泡存在的局部会抵抗蛋白转膜，降低转膜效率。
4、转膜缓冲液过热：缓冲液离子强度太低，或电压及电流过高,转膜过程中注意降温。
在冰水混合物中转膜，效果很好。
5背景过高:1）封闭不全， 5%脱脂奶粉，效果还可以，现在做基本上没什么背景。
如果你觉得不够可以加点BSA,1%吧。
2）一抗或者是封闭液与膜蛋白的交叉反应。
这种情况通常可以通过加入TWEEN-20或多次洗膜加以解决。
如果问题不能解决，那么降低一抗浓度，或更换封闭液种类可能解决 3）一抗二抗中某些不纯的物质也可以造成背景。
4）抗体浓度太高，或孵育时间太常都可能遇到这种情况。
那么可以适当降低一抗二抗的浓度，或是用提高温度的方式来代替杂交时间的延长；另外，少量多次得洗膜效果要优于多量而长时间得洗膜效果。
5)曝光时间的控制:通常我们线曝光一分钟试试，条带清晰背景也强，可以缩短曝光时间，或者过一段时间等荧光减弱以后再发光，一般也可以发出比较好的条带。
如果背景强于条带，那么肯定是前面默默个原因的一种，这是可以将膜在TBST中漂洗以下再发光，有时会有比较好的效果（仅限于国外较好的试剂盒，国产的不行，洗一下啥也没了！）这个时候可以洗膜，洗膜后重新发光。
WB常见故障问题点分析(鱼骨图)
其他补偿参数 参数校正 USG输出不稳定 FORCE FORCE基准不正确
CAP不良 金线污染
设备真空不好
ENCODER 不好
LEAD OPEN
工程的温湿度 接触材料不当，污染 W/C和H/B不对称 个别位置CLASS不好
温度设置不对或 未打开
CAP CHANGE 异常 技能存在差异 通风口设备报警多
放 EFO Height 打火棒高度不佳
LEAD氧化
氧化
CAP不良
FORCE FORCE基准不正确 设备值与实际值差异 打火电源不稳定 打火回路
金线污染
EFO OPEN
工程的温湿度
接触材料不当，污染 CAP CHANGE 异常 温度设置不对 或未打开 技能存在差异 设备螺丝不好没有更换 Bond2参数设 置不佳 通风口设备报警多 个别位置CLASS不好
PAD OPEN
METHOD
MAN
ENVIRONMENT
Ass’y1 设备技术组
对外秘
Lead Open 问题点
W/C闭合不好
MATERIAL
LEAD污染 污染 人为污染 LEAD氧化 氧化
材料变形 材料异常 材料缺失
MACHINE
W/C污染 WIRE CLAMP 不好 报警敏感度不好 放线回路不好 误报警 打火棒高度不好 接地线不好
METHOD
MAN
ENVIRONMENT
Ass’y1 设备技术组
对外秘
Sagging wire 问题点
ENVIRONMENT
地面有异物影响 handling
MACHINE
MATERIAL
load部L/F导入 unload设置不好 wire bond设备 transfer setting不好 feeder部步进不好 wire bond之前材料异常 chip pad设计不合理
刚开始接触WB实验有没有大佬可以分享常见WB常见问题的解决方法
刚开始接触WB实验有没有大佬可以分享常见WB常见问题的解决方法对于WB实验，我真的很有发言权，实验室苦干几年加上毕业后在试剂公司做技术支持好几年，我碰到的正常与非正常的WB实验问题肯定比一般人更多！这里给大家分享我们合作的课题组以及我们自己课题组在做WB实验的时候常见的一些问题以及解决方法！在讲WB之前，大家有兴趣的可以保存下这套课程，这是我自己买过的一套解螺旋实验技术学习的课程，2000分钟的实验讲堂，40个实验技能认证培训，有需要的可以自取，能学到非常多的实验实操知识。
好了，继续我们的主题内容。
Western Blot，通常我们在日常交流中说的就是简称“WB”，中文名称是“蛋白印迹”或“免疫印迹”，其核心本质是抗原抗体的特异性反应。
Western Blot的基本原理是蛋白质通过凝胶电泳后，按分子量大小顺序在分离胶中分离开来，通过转膜可将胶上蛋白质转移到固相载体（通常是PVDF膜、NC膜和尼龙膜）表面，然后加入一抗去特异性结合膜上蛋白质，再加入酶或者荧光素标记的二抗，二抗与一抗结合反应后，通过底物显色、化学发光等方法检测目的蛋白。
Western Blot实验一般用来判断特定蛋白在样本中是否表达及粗略分析特定蛋白表达量的高低。
01样本问题Q：蛋白样本如何准备？A：对于细胞样本，蛋白的提取方法比较简单，只需要将细胞培养基弃掉，然后利用PBS清洗2-3次，随后添加RIPA裂解液进行冰上直接裂解，离心上清即为蛋白；但是对于植物和动物组织而言，需要将组织分解成较小的组织块，液氮研磨，后续利用RIPA裂解液进行冰上裂解，相对于细胞蛋白的提取，多了一步组织样块的处理步骤。
02电泳问题Q1：大小分子蛋白各自的电泳胶浓度如何选择？小提示：1、由于SDS能够阻止蛋白与膜的结合，因此小分子蛋白转膜可不加SDS，同时甲醇浓度提高到20%；2、大蛋白易在凝胶里形成沉淀，转膜缓冲液中加入0.1%SDS，可增加蛋白的溶解性；3、由于甲醇易使SDS从蛋白上脱离，可降低甲醇的浓度（低至10%或者更低）来防止蛋白沉淀；4、推荐浓度梯度预制胶，4-20%高分辨率梯度预制胶，分离分子量范围3.5-200kD，大分子量小分子量兼顾，非常好用幺。
WB常见问题----westernblot条件摸索的问题
WB常见问题----westernblot条件摸索的问题1. 用的是Santa Cruz的抗体，也实验过一抗和二抗肯定能结合，二抗加DAB肯定能显色。
电泳的胶用考马斯亮蓝染色没问题，但是不知道与Marker对应的条带是否是我要的（我目的蛋白的分子量分别是55KD、29KD）。
半干法2小时转膜后，丽春红染色发现大分子量蛋白转过去的较少。
难道是裂解液出了问题？我用的是三去污剂，但没加叠氮钠和大概叫Apoptin的那种蛋白酶抑制剂。
冰上裂解-80度冻存的细胞，4度12000g离心5分钟，取上清，与分子克隆（第二版）上的加样buffer混合，沸水变性5分钟，上样。
不知道是哪里出了问题？解答：建议：a、首先确定您提的蛋白质量如何？可用PIERCE公司的BCA试剂盒测蛋白的浓度，一般来讲，其浓度应该在几-20微克/微升。
b、若是蛋白没问题，哪就看是不是电泳的问题，首先要看胶的浓度，您目的蛋白的分子量分别是55KD、29KD，建议分别用10％和12％的胶。
60-80V，1小时左右。
跑过积层胶与分离胶的线时，换用100V，3-4小时。
c、转膜，建议恒压，15V，不用转2小时，45分钟足以。
您所说的大蛋白转过去的，并不是真正的少，而是因为在提的蛋白中大蛋白本身就很少。
我曾经也转过2小时，但和45分钟的区别并不大。
d、根据MARKER的条带（我的是7条带：14、18、25、35、45、66、116KD），您根据MARKER的条带剪下25与35之间（29KD）的条带，45-66之间（50KD）的条带。
这样第一，可以节省抗体，第二，您要的目的条带肯定在上面。
e、延长1抗、2抗孵育时间（我曾室温1小时，4度过夜），适当加大1抗浓度。
f、我买的也是Santa Cruz的抗体，我觉得质量还可以，我想您应该先找其他方面的原因。
2. 电泳用的是恒流，一块胶，20mA，100分钟左右。
转膜也是恒流，38mA，100分钟。
而且我用别人的细胞和一抗在我的整个反应体系下做出来了，当然彼此的目的蛋白不同。
WB常见问题及处理方法
WB常见问题及处理方法问题描述可能原因验证或解决办法无信号一抗和二抗不匹配1.二抗需和一抗宿主的物种相同（如一抗来自兔，二抗为抗兔抗体）。
没有足够的一抗或二抗结合目标蛋白1.降低一抗的稀释度（二抗一般确认体系之后不调）；2.使用效价高的一抗；3.延长抗体孵育时间，一抗4℃过夜，二抗室温1-2h；4.在孵育一抗或者二抗的时候，几张膜叠在一起，导致孵育不充分；5.一抗和二抗量不足，或者膜飘浮在表面，导致孵育不充分。
封闭液与一抗或二抗有交叉反应1.选择合适的封闭液（例如磷酸化抗体选择BSA溶液进行封闭）；2.选择合适的一抗，二抗的稀释液（建议选择成分比较清楚的BSA或者明胶）。
一抗不识别检测物种的蛋白1.参考说明书，此抗体是否适合这个物种；2.分析比对免疫原序列和蛋白序列，保守性强的可以尝试；3.设置能检测的阳性对照。
抗原量不足1.检测样本中目的蛋白表达较少；2.每泳道蛋白上样量少，总蛋白量不低于20-30μg，使用蛋白酶抑制剂并设置阳性对照；3.磷酸化抗体检测优先使用BSA进行封闭。
4.使用相应的刺激，使目的蛋白表达丰度提高。
组织中目的蛋白含量低1.选择特异表达目的蛋白的组织；2.组织新鲜，及时提取，尽快使用；3.使用相应的蛋白酶抑制剂。
转膜不充分或电极插反没转成功1.根据目的蛋白的分子量，选择合适的转膜条件；2.转膜结束后，用丽春红对膜进行染色，分析转膜效果（也可对残留胶进行考染，观测转膜效率）；3.转膜时电极插反，导致转膜失败4.选择相应的转膜液，5.膜孔太大，转膜条件过大，目的蛋白转过。
洗膜过度 1.降低洗膜强度（洗膜时间，次数和温度）。
过度封闭使目标蛋白不能显色1.减少封闭时间，考虑封闭温度；2.更换封闭剂，使用含0.5%脱脂奶粉或无脱脂奶粉的抗体稀释液，代替5%脱脂奶粉、显色液失活 1.检测使用的显色液是不是有效，特别是ECL显色中，ECL-B特别容易失效。
激发光波长选择不合适 1.对于不同荧光标记的二抗，选择合适的激发光波长。
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缩短曝光时间
抗体与阻断蛋白有交叉反应
检测抗体与阻断蛋白的交叉反应性，选择无交叉反应的封闭剂。洗涤液中加入Tween-20可减少交叉反应
没有阳性条Leabharlann ，或者阳性条带比较弱抗体染色不充分
增加抗体浓度，延长孵育时间
酶失活
直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物
WB过程中常见的问题及可能原因分析
问题
可能原因
验证或解决办法
背景高
膜没有完全均匀湿透
使用100%甲醇浸透膜5-10min
洗膜不充分
增加洗液体积和洗涤次数
阻断不充分
增加封闭液孵育时间，或者提高温度。选择合适的封闭试剂（脱脂奶粉，BSA，酪蛋白等）
二抗浓度过高
降低二抗浓度
检测过程中膜干燥
保证充分的反应液，避免出现干膜现象
抗体浓度过高
降低抗体（一抗、二抗）浓度，可以减少非特异性条带
蛋白上样量过大
降低上样量
封闭剂中有聚集体
使用前过滤封闭试剂
HRP耦联二抗中有聚集体
过滤二抗试剂，去除聚集体
HRP含量过高
降低酶联二抗的浓度
标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低
设置阳性对照，如果阳性对照有结果，但标本没有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考虑增加标本上样量解决靶蛋白含量低的原因。
试剂不匹配
一抗与组织种属，一抗与二抗或/和底物与酶系统之间不匹配。通过设置内参照可以验证二级检测系统的有效性
一抗失效
选择在有效期内抗体；并选择现配现用的工作液
对于厚的胶以及高分子量蛋白需要延长转移时间
抗体染色不充分
增加抗体浓度，延长孵育时间
标本中靶蛋白含量太低
增加标本上样量。
HRP抑制剂
所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠
抗体活性降低
选择在有效期内的抗体，工作液现配现用，避免长时间放置
封闭过度
减少封闭剂的量或缩短时间；换用不同封闭剂类型
曝光时间过短
延长曝光时间
条带位置不对；或有非特异性条带
色带）
二抗的非特异性结合
增加一个对照：不加一抗，其他操作过程不变，即可验证背景是否由二抗系统来源。选择其他二抗（特异性更强的，只针对重链的）
一抗的特异性不够
使用单克隆或者亲和纯化的抗体，保证抗体的特异性
蛋白降解
使用新鲜制备的标本，并使用蛋白酶抑制剂
二聚体或多聚体存在
增加蛋白质变性过程及强度
HRP抑制剂
所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠
膜没有完全均匀湿透
使用100%甲醇浸透膜
靶蛋白分子量小于10Kd
选择小孔径的膜，缩短转移时间
甲醇浓度过高
过高甲醇浓度会导致蛋白质与SDS分离，从而沉淀在凝胶中，同时会使凝胶收缩或变硬，从而抑制高分子量蛋白的转移。降低甲醇浓度或者使用乙醇或异丙醇代替
转移时间不够