双光子及光谱扫描在激光共聚焦显微镜上的应用经验
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Ex 1000
300 250 200 150 100 50 0
498
利用不同波长的双光子激光照 射可能含碳纳米管的靶向药 物，lambda扫描发现荧光信号 呈现严格的倍频关系
Ex 1040
250 200 150 100 50 0
421 440 459 479 498 518 537 556 576 595 615 634 654 673 692 712
GFP标记水稻根中自发荧光的清除
单光子激发，水稻根带有强烈的黄绿色 自发荧光
ex 488nm，Lambda mode 双光子激发，自发荧光为蓝色 ex 820nm , lambda mode
GFP标记水稻根中自发荧光的清除
• 双光子激发下GFP荧光与自发荧光 的波长分离，820nm激发时，仅采 集493-542nm区间的信号以保证特 异性 Ex 820nm, channel mode
双光子和光谱扫描在激光共聚焦显微 镜上的应用经验
浙江大学生命科学学院 仪器与技术服务平台
机型：Zeiss LSM710 nlo
690-1080nm可调谐飞秒激光器 32通道阵列PMT
激光共聚焦Leabharlann Baidu微镜的非常规应用
• • • • • • • 利用双光子分辨目标荧光和自发荧光 利用光谱扫描鉴定微弱荧光信号的真假 转基因材料快速筛选 嘈杂背景下的细胞计数 非线性效应 光刻和深度扫描 模拟近红外光源
2 lambda成像检测GFP特异荧光
3 最大化pinhole
非线性效应：碳纳米管
Ex 850
原理：某些材料在双光子 激发，会发射波长为激发 光一半的荧光
100 80 60 40 20 0
421
ex 850nm
394 440 469 498 527 556 586 615 644 673 702
ex 1000nm
微弱或自发荧光存在下的信号鉴定
Promoter::GFP载体注射烟草叶片（lambda mode成像）
GFP
叶绿素
转GFP弱表达 镜下目视特征：
转GFP不表达 光谱特征：
绿色信号被强烈红光掩盖 GFP： GFP和RFP弱时无法分辨 主发射峰位于约518nm 副发射峰位于约540nm Lambda合成图特征： 后者高度约为前者的一半 呈台阶形 GFP：绿色偏蓝 自发荧光： 自发荧光：绿色偏黄 在560nm左右对称分布 叶绿素荧光：红色 叶绿素荧光： 625nm以上强烈信号
421 440 459 479 498 518 537 556 576 595 615 634 654 673 692 712
ex 1040nm
518
光刻和深度扫描
一种人工合成的透明有机晶体， 在一定强度的近紫外光下会发生 局部变性，从而具有双光子效应 在2个不同Z坐标下做bleach， ex 458nm ex 900nm 做z-stack，显示多层光 刻效果，信号随深度增加而衰减
转基因材料的快速筛选
原则：密集预排列待测样
技巧：lambda扫描
色彩判别
荧光峰形检查
GFP蓝绿特征色
GFP台阶形特征峰
518
540
土壤浸出液中外源GFP标记细菌浓度分析
目的：了解土壤中的不同细菌间的竞争关系 方法：等比掺入外源GFP标记菌体，设置多种 环境条件 问题：土壤标本背景嘈杂，往往带有各种带荧 光的杂质颗粒 解决： 1 固定样品体积
叶表面蜡质层成像及厚度测定
菲（多环芳烃类）渗透 Ex 700nm Channel mode Z-stack
谢谢大家
300 250 200 150 100 50 0
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利用不同波长的双光子激光照 射可能含碳纳米管的靶向药 物，lambda扫描发现荧光信号 呈现严格的倍频关系
Ex 1040
250 200 150 100 50 0
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GFP标记水稻根中自发荧光的清除
单光子激发，水稻根带有强烈的黄绿色 自发荧光
ex 488nm，Lambda mode 双光子激发，自发荧光为蓝色 ex 820nm , lambda mode
GFP标记水稻根中自发荧光的清除
• 双光子激发下GFP荧光与自发荧光 的波长分离，820nm激发时，仅采 集493-542nm区间的信号以保证特 异性 Ex 820nm, channel mode
双光子和光谱扫描在激光共聚焦显微 镜上的应用经验
浙江大学生命科学学院 仪器与技术服务平台
机型：Zeiss LSM710 nlo
690-1080nm可调谐飞秒激光器 32通道阵列PMT
激光共聚焦Leabharlann Baidu微镜的非常规应用
• • • • • • • 利用双光子分辨目标荧光和自发荧光 利用光谱扫描鉴定微弱荧光信号的真假 转基因材料快速筛选 嘈杂背景下的细胞计数 非线性效应 光刻和深度扫描 模拟近红外光源
2 lambda成像检测GFP特异荧光
3 最大化pinhole
非线性效应：碳纳米管
Ex 850
原理：某些材料在双光子 激发，会发射波长为激发 光一半的荧光
100 80 60 40 20 0
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ex 850nm
394 440 469 498 527 556 586 615 644 673 702
ex 1000nm
微弱或自发荧光存在下的信号鉴定
Promoter::GFP载体注射烟草叶片（lambda mode成像）
GFP
叶绿素
转GFP弱表达 镜下目视特征：
转GFP不表达 光谱特征：
绿色信号被强烈红光掩盖 GFP： GFP和RFP弱时无法分辨 主发射峰位于约518nm 副发射峰位于约540nm Lambda合成图特征： 后者高度约为前者的一半 呈台阶形 GFP：绿色偏蓝 自发荧光： 自发荧光：绿色偏黄 在560nm左右对称分布 叶绿素荧光：红色 叶绿素荧光： 625nm以上强烈信号
421 440 459 479 498 518 537 556 576 595 615 634 654 673 692 712
ex 1040nm
518
光刻和深度扫描
一种人工合成的透明有机晶体， 在一定强度的近紫外光下会发生 局部变性，从而具有双光子效应 在2个不同Z坐标下做bleach， ex 458nm ex 900nm 做z-stack，显示多层光 刻效果，信号随深度增加而衰减
转基因材料的快速筛选
原则：密集预排列待测样
技巧：lambda扫描
色彩判别
荧光峰形检查
GFP蓝绿特征色
GFP台阶形特征峰
518
540
土壤浸出液中外源GFP标记细菌浓度分析
目的：了解土壤中的不同细菌间的竞争关系 方法：等比掺入外源GFP标记菌体，设置多种 环境条件 问题：土壤标本背景嘈杂，往往带有各种带荧 光的杂质颗粒 解决： 1 固定样品体积
叶表面蜡质层成像及厚度测定
菲（多环芳烃类）渗透 Ex 700nm Channel mode Z-stack
谢谢大家