双光子及光谱扫描在激光共聚焦显微镜上的应用经验
双光子显微成像原理及近期应用案例
双光子显微成像原理及近期应用案例双光子显微成像是一种高分辨率的成像技术，它利用两个光子的共同作用实现对生物样本的成像。
该技术在生命科学、医学和材料科学等领域有着广泛的应用。
本文将介绍双光子显微成像的原理，并探讨其在近期的应用案例。
双光子显微成像的原理是基于非线性光学效应。
在传统的荧光显微镜中，利用单光子的激发来激发和探测样品中的荧光信号。
然而，单光子的能量较高，容易导致样品的光化学损伤和细胞的光毒性作用。
而双光子显微成像则采用两个光子的准同步非共线激发，以降低光毒性并增加分辨率。
双光子显微成像的工作原理是通过使用超短脉冲激光来激发样品中的荧光物质。
这种超短脉冲激光具有高能量浓度和高峰值功率，可以实现光穿透较深的样品，如活体组织。
当两个光子同时到达荧光物质并被吸收后，它们的能量叠加，使得荧光物质处于激发态，进而发出荧光信号。
通过检测和记录这些荧光信号，可以获取样品的高分辨率图像。
在生命科学领域，双光子显微成像因其高分辨率和非侵入性的优势而得到广泛应用。
例如，研究者可以利用双光子显微成像技术观察细胞内的亚细胞器、蛋白质分子和细胞结构的变化。
双光子显微成像还可以用于监测神经元活动和细胞信号传导等重要生理过程。
通过对这些生物学过程的观察和研究，我们可以更好地理解生命的本质和疾病的发生机制。
近年来，双光子显微成像在医学诊断和治疗方面也取得了重要进展。
例如，在皮肤科领域，双光子显微成像可以非侵入性地观察皮肤水分含量、胶原蛋白分布和血管结构等，从而帮助医生诊断和治疗各种皮肤病。
另外，双光子显微成像还可以用于术前虚拟操作和手术引导等方面，提高手术的准确性和成功率。
例如，在眼科手术中，医生可以利用双光子显微成像技术精确地观察眼底血管和细胞变化，从而为患者提供更好的治疗方案。
除了生命科学和医学领域，双光子显微成像还在材料科学、纳米技术和能源研究等领域得到广泛应用。
例如，研究者可以利用双光子显微成像技术观察材料中的晶格结构、电子云变化和界面反应等，为新材料的设计和合成提供重要的参考。
双光子及光谱扫描在激光共聚焦显微镜上的应用经验
Ex 1000
498
副发射峰位于约540nm
Lambda合成图特征：
GFP标记利水用稻根不中同自发波荧长光的的清双除 光子激光照 目La的mb：d了a射合解成土可图壤能特中征的含：不碳同细纳菌米间的管竞的争关靶系向药物， 目的：了la解m土b壤d中a的扫不描同细发菌现间的荧竞光争关信系号呈现 e原x理90：0某n严m些做材格z料-s的在tac双倍k，光频显子示激关多发系层，光会刻发效射果波，长信为号激随发深光度一增半加的而荧衰光减
GFP：绿色偏蓝
呈台阶形
自发荧光：绿色偏黄
自发荧光：
叶绿素荧光：红色
在560nm左右对称分布
叶绿素荧光：
625nm以上强烈信号
转基因ห้องสมุดไป่ตู้料的快速筛选
原则：密集预排列待测样
技巧：lambda扫描
色彩判别
荧光峰形检查
GFP蓝绿特征色
GFP台阶形特征峰
518
540
土壤浸出液中外源GFP标记细菌浓度分析
目的：了解土壤中的不同细菌间的竞争关系 方法：等比掺入外源GFP标记菌体，设置多种 环境条件 问题：土壤标本背景嘈杂，往往带有各种带荧 光的杂质颗粒 解决： 1 固定样品体积 2 lambda成像检测GFP特异荧光 3 最大化pinhole
主 6绿2发色5n射信m峰 号以激 光位 被上于 强发一强约 烈烈，半红5信1光会的号8n掩m发荧盖射光波长为激发
3 最大化pinhole
GFP和RFP弱时无法分辨
ex 900nm 做z-stack，显示多层光刻效果，信号随深度增加而衰减
利用光谱扫描鉴定微弱荧光信号的真假
后者高度约为前者的一半
在2个不同Z坐标下做bleach， ex 458nm
双光子和光谱扫描在激光共聚焦显微镜上的应用经验
图像采集与处理
采集参数设置
根据样本特性和实验目的，合理 设置图像采集的参数，如曝光时 间、增益等，以提高图像质量。
图像处理与分析
利用专业软件对采集到的图像进 行必要的处理和分析，如去噪、 增强对比度、测量荧光强度等。
数据导出与共享
将处理后的数据导出为通用的文 件格式，便于进一步的数据分析 和共享。
防止光漂白
在观察过程中，应尽量避免长时间 照射和频繁扫描，以减少荧光染料 的光漂白。
荧光探针的选择与使用
探针特异性
选择具有高特异性的荧光探针，以确 保标记的准确性和可靠性。
探针浓度与稳定性
探针混合使用
在某些情况下，可能需要将几种荧光 探针混合使用，此时应确保它们之间 不会发生相互干扰或淬灭现象。
根据实验需求，调整荧光探针的浓度， 并确保其在样本中的稳定性。
药理学研究中的应用
总结词
双光子和光谱扫描在药理学研究中具有重要价值，能够观察药物对细胞和组织的影响，有助于发现新 的药物作用机制和靶点。
详细描述
在药理学研究中，双光子和光谱扫描技术被广泛应用于观察药物对细胞和组织的影响。这些技术能够 实时监测药物对细胞代谢、能量代谢、蛋白质表达等方面的影响，帮助科学家们发现新的药物作用机 制和靶点，为新药研发提供有力支持。
04 技术挑战与未来展望
提高成像深度与分辨率
优化双光子吸收截面
通过提高双光子吸收截面，可以降低成像所需的激光功率，从而 减少光毒性。
开发新型光谱扫描技术
通过改进光谱扫描技术，可以实现更快速、更准确的图像采集，提 高分辨率。
优化光学元件
选用高数值孔径的物镜和低噪声的光电探测器，提高成像深度和分 辨率。
察细胞和组织的细微结构。
激光扫描共聚焦显微镜技术讲解
激光扫描共聚焦显微镜技术Laser Scanning Confocal Microscope——基础篇李治国细胞的内在生活显微镜的发展史没有显微镜就不可能有细胞学诞生。
1590年，荷兰眼镜制造商J 和Z.Janssen 父子制作了第一台复式显微镜。
1665年，英国人Robert Hook首次描述了植物细胞(木栓，命名为cella 。
1680年，荷兰人A.van Leeuwenhoek成为皇家学会会员，他一生中制作了200多台显微镜和400多个镜头，用设计较好的显微镜观察了许多动植物的活细胞与原生动物。
Made by A.van Leeuwenhoek (1632-1723.Magnification ranges at 50-275x.显微镜的最重要参数——分辨力显微镜物象是否清楚不仅决定于放大倍数，还与显微镜的分辨力（resolution ）有关。
分辨率是指区分开两个质点间的最小距离各种显微镜的分辨能力光学显微镜（light microscopy）0.2μm电子显微镜 (Electro microscopy 0.2nm扫描遂道显微镜 (scanning tunneling microscope 0.2nm以下 1932年，德国人M.Knoll 和E.A.F.Ruska 发明电镜，1940年，美、德制造出分辨力为0.2nm 的商品电镜。
1981年，瑞士人G.Binnig 和H.RoherI 在IBM 苏黎世实验中心（Zurich Research Center）发明了扫描隧道显微镜而与电镜发明者Ruska 同获1986年度的诺贝尔物理学奖。
常用的光学显微镜（light microscopy普通光学显微镜暗视野显微镜相差显微镜偏光显微镜微分干涉显微镜荧光显微镜激光共焦扫描显微镜普通光学显微镜原理普通光学显微镜原理图1. 构成：①照明系统②光学放大系统③机械装置2. 原理：经物镜形成倒立实像，经目镜放大成虚像。
激光共聚焦显微镜的原理和应用
激光共聚焦显微镜的原理和应用1. 引言激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope，简称LSCM）是一种高分辨率的显微镜技术，已经广泛应用于生物学、医学和材料科学等领域。
本文将介绍激光共聚焦显微镜的原理和应用。
2. 原理激光共聚焦显微镜通过激光束的共聚焦和通过物体的反射或荧光发射来实现图像的采集。
2.1 激光共聚焦•通过透镜来聚焦激光束•聚焦点在样本表面上产生光斑•样本反射或发射出来的光再次通过透镜，聚焦到探测器上•透镜的位置可以移动，可以扫描整个样本2.2 反射和荧光信号的采集•激光束照射到样本上，经过反射或荧光发射•光学系统收集并聚焦这些发射的光•通过探测器记录下发射光的强度和位置•通过移动透镜和探测器，可以获得样本的三维图像3. 应用激光共聚焦显微镜在许多领域都得到了广泛的应用，以下是其中的几个典型应用。
3.1 细胞生物学•可以观察细胞的形态和结构•可以追踪细胞内的生物分子运动•可以观察细胞的生物化学过程3.2 分子生物学•可以观察和定量细胞器的分布和聚集情况•可以观察和测量分子的扩散速率•可以研究蛋白质的合成和代谢过程3.3 医学研究•可以观察和诊断组织和器官的病理变化•可以研究疾病的发生和发展机制•可以评估治疗方法的有效性和副作用3.4 材料科学•可以观察材料的微观结构和表面形貌•可以研究材料的热力学和力学性质•可以评估材料的耐久性和可靠性4. 总结激光共聚焦显微镜是一种高分辨率的显微镜技术，通过激光束的共聚焦和物体的反射或荧光发射来实现图像的采集。
它在细胞生物学、分子生物学、医学研究和材料科学等领域都有着广泛的应用。
利用激光共聚焦显微镜，科研人员可以观察和研究生物和材料的微观结构、功能和相互作用，为科学研究和应用提供了强大的工具。
激光共聚焦扫描显微镜成像的基本原理
激光共聚焦扫描显微镜成像的基本原理激光共聚焦显微镜（LCM）是近年来发展起来的一种高分辨率荧光显微成像技术。
它通过将样品置于激光束的焦点处，利用高灵敏度的探测器记录样品发出荧光信号，从而实现对样品内部结构的高分辨率成像。
本文将详细介绍LCM的基本原理、成像途径、成像原理及优缺点等方面的内容。
一、激光共聚焦显微镜的基本原理激光共聚焦显微镜基于利用激光束在三维空间内聚焦成极小的点状光斑，对样品进行扫描成像的技术原理。
在聚焦点位置，通过聚焦光斑的极高光密度，激活样品中的荧光染料，荧光染料则针对特定的结构在荧光信号波长处发出荧光信号，被高灵敏度荧光探测器探测并记录下来，然后通过计算机处理、分析和重建，生成高质量的高分辨率图像。
与普通显微镜最大的区别在于，普通显微镜由于透过整个样品并以相位差效应成像，而激光共聚焦显微镜由于仅仅聚焦于样品表面的非常窄的一点，信号只能从聚焦点的附近探测到，而且该点在扫描过程中会不断变换位置。
换言之，成像并不是透过整个样品实现，而是在样品上面扫描得到，并聚焦于单个点上。
对于毫米量级的样品，其层面精度可以达到25nm。
二、激光共聚焦显微镜成像途径激光共聚焦显微镜的成像途径目前有两种，分别为单光子激发型和双光子激发型。
1、单光子激发型单光子成像模式是利用激光束在荧光染料上发生的单光子激发效应进行成像的一种方式。
在单光子激发光下，荧光染料的各自精细结构会发生辐射跃迁产生能量并发射荧光，同时发射时间对荧光能量的传递产生影响，可以通过荧光转移速率反映。
荧光束在被激活后，将以光子流的形式反射回来，被共聚焦显微镜探测并捕捉。
2、双光子激发型双光子成像模式使用了两次光子激发效应，产生高到对比度的图像，并最小化了样品在激发时所受的损伤输出功率。
双光子成像所需条件包括至少两个光子激发、空间和时间上的集中在样品特定区域。
在这种情况下，激光光束相互作用，将样品中转运载分子激发成放射的谐振态发生荧光发射。
双光子激光扫描荧光显微镜及其应用
表 1 几种常见荧光分子的单光子 、双光子 和三光子的吸收截面 3 [5 ]
荧光分子
δ1 (λ/ nm) / 10 - 16cm2
ηδ2 (700nm)
/ 10 - 50cm4·s / 光子
ηδ3 (700nm) / 10 - 83cm6·s2/ 光子2
DAPI free
113 (345nm)
Dansy1
TWO PHOTON LASER SCANNING FL UORESCENCE MICROSCOPY AND ITS APPL ICATIONS
CHEN De2Qiang XIA An2Dong WAN G Ke2Yi HUAN G Wen2Hao
( Depart ment of Precision M achi nery and Inst rument ation , U niversity of Science and Technology of Chi na , Hef ei 230026)
图 1 单 、双光子激发过程示意图
图 2 单 、双光子激发所形成的荧光形貌 (样品为罗丹明 B 的水溶液. 上为单光子激发 ,下为双光子激发)
3 材料的吸收截面 δ
吸收截面 δ是双光子激发现象的重要参数 , 它 的大小反映了分子吸收双光子的本领. 对单光子激 发中的吸收截面 δ已有较为准确的文献记载 , 而对 双光子乃至多光子吸收截面 δ,目前尚缺乏全面 、准 确的记载. 因此 ,对常用的荧光分子多光子吸收截面 δ和光谱的进一步研究 , 将有助于多光子激发共焦 激光扫描荧光显微镜的进一步广泛应用.
·232 ·
2 双光子激发原理简介
在激光照射下 ,基态荧光分子或原子吸收一个 光子后成为激发态 ,随后又弛豫到某一基态 ,同时以 光子形式释放能量而发出荧光. 这一过程就是通常 的单光子激发情况. 1931 年 ,Maria G ppert - Mayer 预言一个分子或原子可以在同一个量子过程中 ,同 时吸收两个光子而成激发态 ,这种情况就是双光子 激发过程[2 ] . 1961 年 , Kaiser 等在 CaF2 ∶Eu2 + 晶体 中首次观察到了这种双光子激发现象[3 ] . 图 1 简单 地描述了这种双光子激发的过程. 比如在单光子激 发情形 ,NADH 酶在 350nm 的光激发下产生 450nm 的荧光 ,而在双光子激发情形 , NADH 酶则需同时 吸收两个 700nm 的光子才能产生 450nm 的荧光. 这 就是说 ,双光子技术可以使我们无需使用紫外光源
激光共聚焦显微镜的原理与应用范围讲解
激光共聚焦显微镜的原理与应用范围讲解激光共聚焦显微镜（Confocal laser scanning microscope, CLSM）是一种高分辨率的显微镜技术，它利用激光束进行点扫描，将样品的不同深度处的信息获取并合成，从而实现三维图像的获取。
本文将对激光共聚焦显微镜的原理和应用范围进行详细介绍。
首先是激光扫描。
激光束通过空气透镜和扫描镜反射，聚焦在样品上。
扫描镜以一个固定的频率和幅度来快速振动，使得激光束扫描在样品表面，形成二维扫描像。
其次是共焦原理。
共焦显微镜利用一个空孔径光阑（pinhole）来调整激光束的直径，只允许经过焦平面的光通过，其他散射光被阻挡。
这样可以消除在光路上不同深度处的散射光干扰，提高图像的纵向分辨率。
同时，由于只有通过焦平面的光才能进入探测器，所以可以采集不同深度处的信息，合成三维图像。
最后是探测技术。
通常激光共聚焦显微镜会配备一个光电探测器，并通过探测器来收集散射和荧光光信号。
散射光可以用来形成反射式图像，而荧光光信号则可以用来观察标记了特定分子或细胞的样品。
通过调整激光的波长和探测器的设置，可以实现不同特定分子和结构的成像。
1.细胞和组织成像：激光共聚焦显微镜可以提供高分辨率的细胞和组织成像。
通过荧光标记特定蛋白质或细胞结构，可以观察和研究细胞内部的生物过程和结构。
2.神经科学：激光共聚焦显微镜在神经科学中的应用得到了广泛关注。
可以观察和追踪神经元的形态和功能，研究神经网络的连接和活动，揭示神经系统的工作机制。
3.生物医学研究：激光共聚焦显微镜在生物医学研究中也扮演着重要的角色。
可以用于癌症细胞的培养和观察，研究癌症的发生和发展机制。
还可以用于研究哺乳动物早期发育过程中的细胞分化和组织形态的变化。
4.材料科学：激光共聚焦显微镜可用于对材料的表面和内部结构进行观察和分析。
可以研究纳米材料的形貌和组成，观察材料的晶体结构和缺陷。
总之，激光共聚焦显微镜是一种重要的显微镜技术，具有高分辨率、三维成像和可观察特定分子和结构的能力。
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转基因材料的快速筛选
原则：密集预排列待测样
技巧：lambda扫描
色彩判别
荧光峰形检查
GFP蓝绿特征色
GFP台阶形特征峰
518
540
土壤浸出液中外源GFP标记细菌浓度分析
目的：了解土壤中的不同细菌间的竞争关系 方法：等比掺入外源GFP标记菌体，设置多种 环境条件 问题：土壤标本背景嘈杂，往往带有各种带荧 光的杂质颗粒 解决： 1 固定样品体积
Ex 1000
300 250 200 150 100 50 0
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利用不同波长的双光子激光照 射可能含碳纳米管的靶向药 物，lambda扫描发现荧光信号 呈现严格的倍频关系
Ex 1040
250 200 150 100 50 0
421 440 459 479 498 518 537 556 576 595 615 634 654 673 692 712
421 440 459 479 498 518 537 556 576 595 615 634 654 673 692 712
ex 1040nm
518
光刻和深度扫描
一种人工合成的透明有机晶体， 在一定强度的近紫外光下会发生 局部变性，从而具有双光子效应 在2个不同Z坐标下做bleach， ex 458nm ex 900nm 做z-stack，显示多层光 刻效果，信号随深度增加而衰减
双光子和光谱扫描在激光共聚焦显微 镜上的应用经验
浙江大学生命科学学院 仪器与技术服务平台
机型：Zeiss LSM710 nlo
690-1080nm可调谐飞秒激光器 32通道阵列PMT
激光共聚焦显微镜的非常规应用
• • • • • • • 利用双光子分辨目标荧光和自发荧光 利用光谱扫描鉴定微弱荧光信号的真假 转基因材料快速筛选 嘈杂背景下的细胞计数 非线性效应 光刻和深度扫描 模拟近红外光源
GFP标记水稻根中自发荧光的清除
单光子激发，水稻根带有强烈的黄绿色 自发荧光
ex 488nm，Lambda mode 双光子激发，自发荧光为蓝色 ex 820nm , lambda mode
GFP标记水稻根中自发荧光的清除
• 双光子激发下GFP荧光与自发荧光 的波长分离，820nm激发时，仅采 集493-542nm区间的信号以保证特 异性 Ex 820nm, channel mode
微弱或自发荧光存在下的信号鉴定
Promoter::GFP载体注射烟草叶转GFP弱表达 镜下目视特征：
转GFP不表达 光谱特征：
绿色信号被强烈红光掩盖 GFP： GFP和RFP弱时无法分辨 主发射峰位于约518nm 副发射峰位于约540nm Lambda合成图特征： 后者高度约为前者的一半 呈台阶形 GFP：绿色偏蓝 自发荧光： 自发荧光：绿色偏黄 在560nm左右对称分布 叶绿素荧光：红色 叶绿素荧光： 625nm以上强烈信号
叶表面蜡质层成像及厚度测定
菲（多环芳烃类）渗透 Ex 700nm Channel mode Z-stack
谢谢大家
2 lambda成像检测GFP特异荧光
3 最大化pinhole
非线性效应：碳纳米管
Ex 850
原理：某些材料在双光子 激发，会发射波长为激发 光一半的荧光
100 80 60 40 20 0
421
ex 850nm
394 440 469 498 527 556 586 615 644 673 702
ex 1000nm