克隆表达与引物设计
外源基因原核系统克隆表达的基本流程
外源基因原核系统克隆表达的基本流程
外源基因原核系统克隆表达的基本流程如下：
1. 设计引物：根据外源基因的序列，设计引物，其中至少包括一个启动子和一个终止子。
2. 基因克隆：使用PCR或其他克隆技术，将外源基因与载体DNA连接起来，形成重组质粒。
3. 转化：将重组质粒转化到适当的宿主细胞中，如大肠杆菌。
4. 筛选：通过选择性培养基或其他筛选方法，筛选出带有重组质粒的转化菌落。
5. 培养：将筛选出的转化菌落进行扩增培养，在适当的培养条件下培养细菌。
6. 表达：在培养过程中，外源基因会被宿主细胞转录和翻译，产生目标蛋白质。
7. 提取：收集细菌培养物，利用细胞破裂或其他细胞提取方法，提取目标蛋白质。
8. 纯化：通过各种纯化技术，如柱层析、电泳等，纯化目标蛋白质。
9. 鉴定：利用各种方法，如SDS-PAGE、Western blot等，对
目标蛋白质进行鉴定和定量分析。
10. 应用：利用纯化的目标蛋白质进行后续的研究或应用，如
功能鉴定、结构分析、抗原制备等。
这是一个基本的流程，根据不同的实验目的和具体情况，可能还会涉及到一些其他的步骤和操作。
克隆载体构建实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 学习克隆载体的构建方法，掌握分子克隆的基本原理和操作步骤。
2. 掌握利用限制性内切酶和DNA连接酶进行DNA片段的插入和连接。
3. 熟悉重组质粒的鉴定和扩增方法。
二、实验原理克隆载体是分子生物学研究中常用的工具，它可以将目的基因插入其中，并在宿主细胞中进行扩增。
克隆载体的构建主要包括以下步骤：1. 设计引物：根据目的基因序列设计特异性引物，用于PCR扩增目的基因片段。
2. PCR扩增：利用引物扩增目的基因片段。
3. 载体线性化：利用限制性内切酶将载体线性化，使其具有末端粘性。
4. DNA片段连接：将目的基因片段与载体进行连接。
5. 转化宿主细胞：将连接后的重组质粒转化至宿主细胞。
6. 鉴定和扩增：通过PCR、酶切等方法对转化后的细胞进行鉴定和扩增。
三、实验材料1. 试剂：PCR引物、限制性内切酶、DNA连接酶、DNA分子量标准、Taq酶、pUC19载体、感受态细胞等。
2. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、移液器、DNA纯化柱等。
四、实验步骤1. 设计引物：根据目的基因序列设计特异性引物，引物长度一般为20-30个碱基，其中包含酶切位点。
2. PCR扩增：利用引物扩增目的基因片段，PCR反应体系如下：- 10×PCR缓冲液5μl- dNTPs（每种2.5μmol/L）4μl- 引物（上下游引物各1μmol/L）2μl- DNA模板1μl- Taq酶0.5μl- ddH2O补充至50μl3. 载体线性化：利用限制性内切酶将载体线性化，反应体系如下：- 载体DNA 5μl- 10×酶切缓冲液5μl- 限制性内切酶1μl- ddH2O补充至20μl4. DNA片段连接：将PCR产物与载体进行连接，反应体系如下：- 线性化载体DNA 5μl- PCR产物5μl- 10×连接缓冲液5μl- DNA连接酶1μl- ddH2O补充至20μl5. 转化宿主细胞：将连接后的重组质粒转化至感受态细胞，具体操作方法如下：- 将感受态细胞铺板于含有适当抗生素的培养基上，37℃培养过夜。
基因克隆具体实验报告
一、实验目的1. 学习基因克隆的基本原理和方法。
2. 掌握PCR扩增、酶切、连接等基因克隆实验技术。
3. 验证目的基因的克隆是否成功。
二、实验原理基因克隆是指将目的基因片段从基因组中分离出来，并插入到载体中，使其在宿主细胞中复制、表达的过程。
实验过程中，主要涉及PCR扩增、酶切、连接、转化、筛选等步骤。
三、实验材料1. 模板DNA：含有目的基因的基因组DNA。
2. 引物：根据目的基因序列设计的上下游引物。
3. Taq DNA聚合酶：用于PCR扩增。
4. 酶切体系：限制性内切酶、缓冲液、连接酶等。
5. 连接载体：线性化载体。
6. 转化宿主菌：大肠杆菌DH5α。
7. 筛选培养基：含抗生素的LB培养基。
8. PCR扩增试剂：10×PCR缓冲液、dNTPs、MgCl2等。
四、实验方法1. PCR扩增（1）设计引物：根据目的基因序列设计上下游引物，长度约为20-30bp，分别位于目的基因的上下游。
（2）PCR反应体系：取模板DNA 1μl，上下游引物各1μl，10×PCR缓冲液5μl，dNTPs 4μl，MgCl2 2μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，加ddH2O至50μl。
（3）PCR反应程序：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，最后延伸10min。
2. 酶切连接（1）酶切：取PCR产物5μl，加限制性内切酶（如EcoRI）1μl，10×酶切缓冲液2μl，ddH2O 2μl，混匀后置于37℃水浴酶切2h。
（2）连接：取线性化载体5μl，酶切产物5μl，10×连接缓冲液2μl，T4 DNA 连接酶1μl，混匀后置于16℃连接过夜。
3. 转化（1）制备感受态细胞：将大肠杆菌DH5α在LB培养基中培养至对数生长期，按照1:100的比例加入CaCl2，混匀后冰浴30min。
（2）热激转化：将连接产物加入感受态细胞中，混匀后置于42℃水浴45s，迅速转移至冰浴中。
最新为什么要先构建克隆载体再用表达载体备课讲稿
最新为什么要先构建克隆载体再⽤表达载体备课讲稿为什么要先构建克隆载体再⽤表达载体构建克隆载体是⼤量扩增DNA⽚段，⽤以测序、酶切和改造等对DNA实施的后续操作，构建表达载体是⼤量得到翻译产物——蛋⽩质。
为什么要先构建克隆载体，再⽤表达载体，我猜是因为：①得到⼤量的DNA，虽然PCR也可以，但PCR扩增有出错率、但你每做⼀次常规的PCR，⽽且每次都要重新提DNA和RNA才⾏，⽽且，PCR反应的试剂盒⼜不便宜，⽤PCR来制备⼤量DNA有点得不偿失。
尽管构建克隆载体也存在操作复杂（相对于PCR），成功率不是极⾼，⽽且还要筛选，但⼀旦你重组成功并转⼊了⼤肠杆菌，你就可以保存了，你想什么时候⽤，摇个菌，就可以制备到⼤量的DNA。
②测序需要。
你想转表达，你⾸先得确定你扩增的⽬的⽚段是不是你要的，不要以为你设计了个特异性引物，然后跟你mark 的长度就可以确定了，这也只是推测，在科学上不严谨。
扩增出的基因⽚段保险起见或者经费允许，要拿去测序，⽽⼀般送测的序列都是构建到载体上的序列，克隆载体上⼀般也都带有测序引物，已确定这就是你要的那条序列。
你要写论⽂必须要给⼈真凭实据。
先构建克隆载体再构建表达载体并不是⼀个必须的选择，如果你的扩增PCR⽬的条带很亮，⽽且单⼀性很好，我建议你可以直接克隆进⼊表达载体。
很多⼈选择先构建克隆载体，是因为在扩增基因时⽬的条带模糊，特异性不好，这样将基因连接到克隆载体上就可以便于挑去单克隆进⾏测序，增加测序的准确度，从⽽确认⾃⼰克隆基因序列的正确性。
单纯的PCR产物往往是⼀些各种PCR⽚段的混合物，直接送过去测序，往往导致测序信号峰很杂，有时候并不能测出想要的信号序列。
同时保存的PCR⽚段⽐较容易降解，⽽构建好克隆载体后形成的质粒是很容易扩增和保存的。
先构建克隆载体，⼀是为了便于测序，确认克隆序列正确，⼆是为了便于基因PCR⽚段的保存。
怎么构建克隆载体和表达载体？⾸先根据你的实验需要选择相应的载体。
(整理)克隆载体与表达载体
一部分：概念解析二部分：问题解答克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。
克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。
克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。
(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。
) 其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。
是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。
表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。
表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。
表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。
如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。
其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。
在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。
（RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3—9bp组成的序列。
这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。
克隆载体表达载体构建详细版
克隆载体表达载体构建详细版一、稀释引物1、4℃，15min、13000转离心（先等离心机降温）2、根据OD值加DD水。
3、静置30min（冰上）4、准备1.5毫升EP管，并加90ulDD水。
5、向EP管中加10ul引物，震荡离心，-20℃保存。
二、跑MIX检测引物（20ul体系）、上引物0.8ul下引物0.8ulMix 10ulDNA（日本晴）1ulDD水7.4ul三跑高保真酶（50ul体系）DNAorCDNA 2ul上引物2ul下引物2ul5*buffer 10uldNTPs 5ulDD水28ulPfu（最后加）1ul四胶回收流程1、在紫外线下切胶，用牙签装入2ml的EP管中。
2、按量加XP2，放在55℃水浴锅中10min，每2min摇匀1次，涡旋，短离。
3、将液体冷却到室温，转移到平衡住中，离心10000转，1min30s，倒掉滤液。
4、加入xp2 300ul，离心10000r，1min30s，倒掉滤液。
5、加入spw700ul，离心10000r，1min，倒掉滤液（重复一次）6、空转2min，13000r，之后换1.5mlEP管。
7、套上保鲜膜放入37℃烘箱中，30min。
8、加入DD水10ul，静置2min，离心2min，13000r，重复3次，-20℃保存。
五、胶回收产物检测（10ul）体系上引物0.4ul下引物0.4ulMix 5ul回收产物1ulDD水 3.2ul六、构建blunt cloning 载体（克隆载体）（4ul 体系）胶回收产物 3.5ulBlunt cloning 0.5ul混匀后，PCR：25℃15min 盖子温度50℃之后转化1、提前5min从-70℃冰箱中拿出大肠杆菌感受态，冰上解冻5min。
2、将样品（4ul）加入感受态的大肠杆菌中，冰上30min，大约剩5min左右，打开水浴锅预热到42℃，并拿出SDC 培养基解冻（室温解冻）。
3、水浴锅42℃，60-90s迅速转移到冰浴2min，该过程中不要摇动离心管。
引物设计
无任何特异性
03
目的基因的获取-PCR引物设计
特异引物设计：
通用引物设计：
1、扩增的完整序列完全已知 1、扩增保守的同源基因
2、扩增序列长度要≥CDS
2、扩增序列长度一般<CDS
3、引物长度18-22，得分高
3、一般测序用
4、要blast
4、不用个人设计
5、测序时要提供引物，连到T载 5、测序不需要提供引物
03
PART THREE
引物设计原则和方法
03
目的基因的克隆
基因工程的主要目的是把经过遗传学和分子生物学前期 研究探明了结构与功能的靶基因（target gene）转导 宿主细胞中表达，以大量获取该基因的产物或改变宿主 性状。由此可见，如何分离得到靶基因是基因工程操作 的关键步骤之一，否则“巧妇难为无米之炊”。
序不好进行
3、 随机6或9个mers
4、要获得完整基因要做步移
PCR或反向PCR或测完整基因组
03
目的基因的获取-PCR引物设计
引物设计软件： 1、Oligo 6 2、Primer premier 5/6 3、Dnastar 4、Primer 3plus（在线）
03
目的基因的获取-PCR引物设计
引物二聚体
发夹结构
03
目的基因的获取-PCR引物设计
引物设计种类：
引物
克隆引物 表达引物
特异引物Specific
primers
只扩增某一类基因或生物
通用引物Universal 与基因两端基因匹配（载体）
Primers
兼并引物Degenerate 可以扩增某一类相似基因
Primers
随机引物
Random primers
分子克隆PCR引物设计
PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。
因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。
要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。
同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。
如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。
如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。
现在可以在这一保守区域里设计一对引物。
一般引物长度为15~30碱基，扩增片段长度为100~600碱基对。
让我们先看看P1引物。
一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%。
而且四种碱基的分布最好随机。
不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。
否则P1引物设计的就不合理。
应重新寻找区域设计引物。
同时引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。
引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的5′端加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、地高辛等，这对扩增的特异性影响不大。
但3′端绝对不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从3′端开始的。
这里还需提醒的是3′端不要终止于密码子的第3位，因为密码子第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。
综上所述我们可以归纳十条PCR引物的设计原则：①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
②产物不能形成二级结构。
③引物长度一般在15~30碱基之间。
④G+C含量在40%~60%之间。
⑤碱基要随机分布。
⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。
⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。
⑧引物5′端可以修饰。
⑨引物3′端不可修饰。
⑩引物3′端要避开密码子的第3位。
PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。
如前述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。
对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。
1.引物的特异性引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。
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克隆表达与引物设计
Clone,Expression,and Prime Design
克隆表达的路线
目的DNA片段和载体的制备
目的DNA片段和载体的连接
重组子筛选 什么是克隆？ 表达的目的 载体的选择 引物的设计是关键
连接产物的转化
目的蛋白的诱导表达 目的蛋白的纯化
目的基因的克隆及其原核表达 技 术 路 线
程序：
3’ Antisense primer
引物
←
5’
dNTP 上游引物 下游引物 模板 Taq 酶
95℃ 变性5min； 94℃ 变性30s，
52℃ 退火30s， 72℃延伸40s，
3）和条件
引物设计的原则
1. 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
2. 产物不能形成二级结构；避开产物的二级结构区。自由能△G°≥58.6l kJ/mol。 3. 引物长度一般在15~30碱基之间。 4. G+C含量在40%~60%之间。 5. 碱基要随机分布。 6. 引物自身不能有连续4个碱基的互补；引物之间不能有连续4个碱基的互补。 7. 引物5′端可以修饰；引物3′端不可修饰。 8. 引物3′端要避开密码子的第3位。
3. 分析所要扩增的基因片段，对其保守性，抗原优势位点等进行分析。
4. 利用软件，参照引物设计的原则，进行引物的设计。
引物设计目的和PCR扩增
PCR引物设计的目的：
找到一对合适的核苷酸片段，使其能够有效的扩增模板DNA。
Sense primer
3’ 5’
→
ddH2O 10×buffer
17µL 2.5µL 1µL 1µL 1µL 2µL 0.5µL
HEV
RNA Extraction
RT-PCR
HE
PCR Vector TProductA Vector T A
pET HE
转化 DE 3
大肠杆菌
HE蛋白
ITPG诱导
实验目的与引物设计
1. 明确实验的目的，根据实验目的设计引物。 2. 选择表达载体，根据载体的酶切位点，在引物的5‘端加入酶切位点。