1293462556几丁质酶
几丁质脱乙酰酶菌株的选育
几丁质脱乙酰酶菌株的选育几丁质脱乙酰酶菌株的选育几丁质是一种来源于甲壳动物外骨骼和真菌细胞壁的重要生物材料，具有生物可降解、生物相容性和生物活性等特点，因此在医药、农业、水产等领域有广泛的应用前景。
然而，由于几丁质的结构复杂，传统的化学方法生产几丁质的成本较高，且对环境造成了一定的污染。
因此，寻找一种高效、低成本的几丁质脱乙酰酶（chitinase）菌株成为了当前研究的热点之一。
几丁质脱乙酰酶是一种可以将几丁质分解为N-乙酰葡萄糖胺和几丁二糖的酶，广泛存在于微生物中，可通过筛选适应环境的菌株来获得高效的几丁质脱乙酰酶。
在几丁质脱乙酰酶菌株的选育过程中，主要包括菌种收集、分离、筛选和鉴定等环节。
首先，菌种收集是选育几丁质脱乙酰酶菌株的第一步。
可以从各种自然环境中收集土壤、水体、河流等样品，也可以从已知具有几丁质脱乙酰酶活性的菌株中进行分离。
采集的样品需要在恰当的温度和潮湿环境下进行保存和传递，以确保菌株的存活。
其次，菌种分离是选育几丁质脱乙酰酶菌株的关键环节。
样品收集后，应该在适宜的富含几丁质的培养基上进行菌种的分离。
分离方法主要有稀释板法、半固体划线法和滴法等。
采用不同的分离方法可以获得不同的菌落型，可以提高菌种的多样性。
接下来，菌种筛选是选育几丁质脱乙酰酶菌株的重要环节。
首先将菌落转移到含有几丁质的培养基上进行预筛选。
经过一段时间后，观察培养物上是否出现了透明圈附近的菌落，透明圈往往表示该菌株产生了几丁质脱乙酰酶。
然后通过测定菌株的酶活性和菌株的几丁质分解效果等指标，筛选出具有较高几丁质脱乙酰酶活性的菌株。
最后，通过鉴定确定几丁质脱乙酰酶菌株的分类和特性。
可以通过形态学观察、生理生化指标检测、分子生物学方法等来鉴定菌株的分类和特性。
鉴定的结果可以用于评估菌株的应用潜力和确定菌株是否适合于大规模生产。
综上所述，几丁质脱乙酰酶菌株的选育是一个复杂的过程，需要从环境样品中筛选适用的菌种，进一步分离、筛选和鉴定，最终得到高效的几丁质脱乙酰酶菌株。
几丁质脱乙酰酶的研究进展
由于 CDA 的来源不同，其酶学性质也存在差异 性。到目前为止，自然界所发现的 CDA 都是糖蛋白。 CDA 热稳定性良好，大多数 CDA 的最适温度为 50 ℃~ 60 ℃。而最适 pH 差异较大，一般胞外酶的最适 pH 为 7~12，胞内酶最适 pH 为 4.5~6。大部分 CDA 的等电点 （isoelectric point，pI）都在酸性范围内[3-4]。影响 CDA 酶 学性质的因素主要有温度、pH、底物状态及浓度、相对 分子质量和金属离子等。不同金属离子对 CDA 酶学性 质的影响不同，同种金属离子也可能因其浓度不同而
产酶菌属 红球菌[5] 毛霉（Mucor）[6] 卷柄根霉（Rhizopus circinans）[7] 短杆菌（Brevibacterium）[8] 菜豆炭疽菌 （Colletotrichum lindemuthianum）[9] 蓝色犁头霉（Absidia coerulea）[10] 草酸青霉（Penicillium oxalicum）[11]
Research Advance of Chitin Deacetylase YANG Qian1，LIU Jian-hui1，JIANG Tong1，DONG Li-li1，DUAN Hong-yu1，SUN Ji-lu2，* （1. College of Science and Technology，Hebei Agricultural University，Cangzhou 061100，Hebei，China； 2. College of Food Science and Technology，Hebei Agricultural University，Baoding 071001，Hebei，China） Abstract：Chitin deacetylase（CDA）is an enzyme which can catalyze deacetylase reaction in chitin generating chitosan. Chitosan has several excellent properties，such as antibacterial，anticancer，and antiviral，with wide application prospect in the medicine，chemical，and food industries. The research situation of CDA was re－ viewed，including enzymatic properties，catalytic mechanism，the method of separation and purification，etc. Furthermore，the screening methods and process of CDA producing strains were briefly introduced，and the fu－ ture research direction of CDA was prospected. Key words：chitin deacetylase；chitin；chitosan；deacetylation
几丁质的基本单位
几丁质的基本单位
几丁质的基本单位是乙酰葡萄糖胺。
甲壳质又称甲壳素、几丁质，英文名Chitin，是一种从海洋甲壳类动物的壳中提取出来的多糖物质，化学式为(C8H13O5N)n。
甲壳质是淡米黄色至白色，溶于浓盐酸、磷酸、硫酸和乙酸，不溶于碱及其它有机溶剂，也不溶于水。
甲壳质的脱乙酰基衍生物壳聚糖不溶于水，可溶于部分稀酸。
它是由 1000～3000 个乙酰葡萄糖胺残基通过 p1,4 糖甙链相
互连接而成聚合物。
几丁质也是一种多糖，又称为壳多糖，为N-乙酰葡糖胺通过β连接聚合而成的结构同多糖。
广泛存在于甲壳类动物的外壳、昆虫的甲壳和真菌的胞壁中,也存在于一些绿藻中。
甲壳质的化学结构和植物纤维素非常相似。
都是六碳糖的多聚体，分子量都在100万以上。
纤维素的基本单位就是葡萄糖。
二化螟几丁质酶基因家族及几丁质含量的分析
二化螟几丁质酶基因家族及几丁质含量的分析几丁质是昆虫外骨骼的主要组成成分,具有支撑身体,阻碍捕食者的捕食,防御病原体侵入等功能,表皮物质中大约40%的成分是几丁质。
几丁质也存在于部分昆虫前肠和后肠的肠衬、口器和唾液腺中,同时中肠的围食膜也主要是由几丁质和蛋白构成。
几丁质的合成和降解分别需要几丁质合成酶和几丁质酶,这两种酶与昆虫的生长发育具有密切关系。
根据几丁质酶基因结构的最新研究表明,几丁质酶可以分为8个Group,8个Group除了结构不同外,每个Group的功能也不相同。
为了研究二化螟体内的几丁质酶的结构和功能,本文以鳞翅目螟蛾科昆虫二化螟(Chilo suppresalis)为研究对象,利用RACE 术克隆了 4个几丁质酶基因cDNA全长并对其基因序列和表达量进行分析,同时研究结果表明不同的几丁质酶在不同龄期高表达,我们猜测与几丁质的含量和成分有关,因此我们对几丁质在二化螟体内的含量进行了测定。
1)二化螟几丁质酶基因的全长克隆从二化螟转录组数据中获得4个几丁质酶相关蛋白的基因片段,即CsCht1、CsCht2、CsCht3和CsCht4。
经序列验证后,利用RACE技术,成功获得这4个基因的cDNA序列全长,对4个基因蛋白序列的分子量、等电点预测发现,CsCht1、CsCht2和CsCht3的分子量在40-85 kD之间,PI值在5-7之间;而CsCht4的分子量为37.11 kD,其PI值达到9.25,同时发现4个几丁质酶蛋白序列均含有α螺旋、延伸链、β折叠和无规则卷曲等二级结构。
2)二化螟几丁质酶基因家族的分析对二化螟12个几丁质酶基因序列的基因结构、蛋白结构域及系统发育进行分析。
结果表明,12个几丁质酶序列的外显子和内含子的数量不相同,所含外显子和内含子的长度也不相同。
CsCht5和家蚕、赤拟谷盗、黑腹果蝇和意大利蜜蜂的Cht5在基因结构上也不相同,表明Cht5基因在序列上具有保守性,而基因结构却发生了改变;蛋白结构域方面,12个几丁质酶序列都属于糖基水解酶18家族(GH18),CsCht1、CsCht3、CsCht5和CsCht7都含有保守结构域ChtBD2,CsCht10含有保守结构域ChtBD3;通过构建几丁质酶系统进化树,发现CsCht5和CsCht7两个基因属于GroupⅠ,CsCht3 和 CsCht9 两个基因属于 Group Ⅱ,CsCht1 和CsCht6属于 Group Ⅲ,CsCht2、CsCht4、CsCht8、CsCht11和CsCht12和属于Group Ⅳ;Group Ⅵ含有 CsCht10 基因,而Groups Ⅴ、Ⅶ和Ⅷ中尚未发现二化螟的几丁质酶基因。
地衣芽孢杆菌几丁质酶的生物信息学分析
酸Ｃ端有一个催化功能区，是结合几丁质的区 域；氨基酸序列中有一段保守区，该蛋白有可能 参与乙酰基的转移旧Ｊ。
几丁质酶普遍存在于芽孢杆菌各菌株中。 用ＢＬＡＳＴ进行同源分析后用ＭＥＧＡ７．０构建系统 进化树（图１）。从进化角度分析，ＢＩＣＨＩ与ｃｈｉｔｉ－ ｎａｓｅ［Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｙｎｅｓｉｉ］海内氏芽孢杆菌几丁质酶 的同源性最高（９６．５４％），其次是ｃｈｉｔｉｎａｓｅ［Ｂａｃｉｌ－
ｌｕｓ ｐａｒａｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ］副水杨芽孢杆菌几丁质酶。
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号肽及跨膜区、空间结构等。结果该酶是由６９３个氨基酸组成的蛋白质，相对分子质量为７７８０３．７９，分子式
为ｃ弘８，Ｈ５２５１Ｎ”７０１０５９Ｓ”，理论等电点为５．４２，不稳定系数为３３．８２，亲水性系数为一０．５９０，二级结构中仅一螺
旋、Ｂ一折叠、无规则卷曲所占比分别为１５．７３％、２６．５５％和５７．７２％。结论地衣芽孢杆菌几丁质酶为一种亲
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地衣芽孢杆菌可大量地向细胞外分泌几丁 质酶，但酶的结构与性质还未十分清楚，本文从 生物信息学的角度对地衣芽孢杆菌几丁质酶进 行分析，以期为其进一步研究与应用提供前提。 ｌ数据
甘肃省植物源农药重点实验室课题组提取 并保存的地衣芽孢杆菌基因组数据库获取几丁 质酶基因序列（基因检索号：ＮＣ＿００６２７０．３），提交
几丁质的合成酶抑制剂
1. 几丁质(chitin) ,又称甲壳质,甲壳素[1], 是由β2(1 ,4)连接的N2乙酰氨基葡萄糖,是自然界中一种天然生物多糖,含量仅次于维生素2]。
几丁质的生物合成需要多种酶的参与,是一个极其复杂的生理和生化过程。
几丁质在自然界中有3 种晶形:α2几丁质和β2几丁质、2几丁质[3]。
2.几丁质合成酶
几丁质合成酶(chitin synthase ,CS) 是一种膜结合的糖苷转化酶,在它的作用下,几丁质前体物尿苷二磷酸酯2N2乙酰氨基葡萄糖(UDP2GlcNAc) 生物合成几丁质(图1).。
3 几丁质合成酶抑制剂对几丁质合成酶抑制剂的研究始于多氧霉素(polyoxins)及尼克霉素(nikkomycins) 的发现。
几丁质的基本组成单位
几丁质的基本组成单位几丁质的基本组成单位几丁质是一种多糖类物质，是由N-乙酰-D-葡萄糖胺分子通过β-1,4-糖苷键连接而成。
它是天然存在的重要生物聚合物，广泛分布于动植物界中，如虾壳、蟹壳、昆虫的外骨骼等。
几丁质在生物体内具有重要的功能，同时也有着广泛的应用价值。
1. 几丁质的化学结构几丁质是由N-乙酰-D-葡萄糖胺分子组成的聚合物，它的化学结构简单而有序。
几丁质的分子结构中，每个N-乙酰-D-葡萄糖胺分子与相邻分子通过共价键连接，形成线性链状结构。
几丁质中的葡萄糖胺分子可以部分地被去乙酰基化，形成葡萄糖胺单元和葡萄糖醛酸单元，这种结构上的变化使得几丁质具有不同的特性与功能。
2. 几丁质的生物功能几丁质在生物体内具有多种重要功能。
几丁质是昆虫、甲壳类动物等的外骨骼主要组成成分，它能够提供保护和支撑的作用，使得这些生物能够适应不同的环境。
几丁质具有极好的生物相容性和生物可降解性，这使得几丁质在医学领域有着广泛的应用，如制备生物材料、药物递送系统等。
几丁质还具有良好的吸附能力，可以用于废水处理、环境修复等环境领域。
3. 几丁质的应用价值由于几丁质具有生物可降解性、生物活性和生物相容性等优点，它已经成为材料科学和生物医学领域的研究热点。
几丁质可以用于制备生物材料，如凝胶、薄膜、纳米颗粒等，用于组织工程、骨修复等方面。
几丁质还可以作为药物递送系统的载体，用于缓释药物、靶向治疗等应用。
除了医学领域，几丁质还可以用于废水处理、环境修复等环境领域。
4. 对几丁质的个人观点和理解个人认为几丁质作为一种天然存在的聚合物，具有广泛的应用潜力。
几丁质不仅在生物体内发挥着重要的功能，而且在材料科学、生物医学和环境领域也有着广泛的应用前景。
科学研究者们已经通过改性几丁质的方法来制备不同形态的几丁质材料，并探索了几丁质的生物活性和生物相容性。
未来，我相信几丁质材料将会在医学和环境领域取得更多的突破和应用。
总结起来，几丁质是一种重要的多糖类物质，在生物体内具有多种功能。
几丁质酶的活性测定(精)
几丁质酶活性的测定⑴几丁质酶几丁质是绝大多数真菌细胞壁的主要成份，而在植物中却不存在。
但高等植物普遍存在着几丁质酶，并可通过几丁质酶催化几丁质的水解，使植物具有抵御真菌侵染的能力（Shibuya and Minami, 2001）。
在正常情况下，高等植物的几丁质酶表达水平很低，而当植物体遭受到病原真菌、细菌和病毒侵染，机械创伤或乙烯处理时，其表达活性显著增强。
特别是在β-1,3-葡聚糖酶的协同作用下，可明显抑制真菌的生长（Sela-Buurlage et al., 1993）。
几丁质酶是植物体中与防御有关的一种次生水解酶，是植物广谱防御机制的一个成分（V an Loon and Van Strien, 1999），它能催化真菌细胞壁的重要成分——几丁质的水解，从而抑制真菌的生长增殖，提高植物的抗真菌能力。
而植物体中尚未发现几丁质酶作用的底物，所以，几丁质酶在植物体中诱导与积累，对于增强植物的抗病能力有重要作用。
几丁质酶主要水解几丁质多聚体β-1,4键，产生N-乙酰葡聚糖胺寡聚体，水解可以是外切作用也可以是内切作用。
⑵试剂的配制①胶状几丁质的制备称取粉末状几丁质（甲壳素，sigma）5.0 g，缓慢加入200 mL （≤4℃）预冷的浓HCl中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，待几丁质粉末均匀分散后，在水浴中轻度搅拌并缓慢加热至37 ℃混合物的粘度迅速增加，几分钟后粘度开始下降，混合物逐渐变得清亮。
当几丁质基本上溶解完毕时，用玻璃棉过滤，将滤液倒入2000 mL预冷（≤4℃）的蒸馏水中，搅拌，几分钟后几丁质沉淀，溶液变得混浊，30分钟后停止搅拌，将悬液置于冰箱(≤4℃)沉淀过夜。
倒掉上清，剩余部分用双层中性滤纸抽滤，沉淀用蒸馏水洗涤数次，待pH达到5以上时，加数滴1 N NaOH使溶液呈中性。
将上述中性沉淀物加到200 mL的蒸馏水中，剧烈搅拌重新悬浮，即为胶体几丁质溶液。
取该溶液5 mL, 105℃烘箱干燥至衡重，测定溶液几丁质的含量（胶体几丁质溶液的几丁质含量为: mg/mL），并将胶体几丁质溶液浓度稀释为1%。
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几丁质酶(chitinase)是以几丁质(chitin)为作用底物的水解酶。
几丁质又称甲壳素或甲壳质,存在于节肢动物、线虫和软体动物的体壁、真菌细胞壁(除卵菌)和一些藻类等生物的细胞壁中。
在昆虫中,几丁质是围食膜及体壁的主要组成成分之一,通过几丁质酶对其有规律地降解以保证昆虫正常生长发育。
如果编码该酶的基因在不适当的时候表达或该表达时未表达,都会对昆虫造成伤害。
由于植物中不含几丁质,因此在植物害虫防治中,昆虫几丁质是几丁质酶的一个极具吸引力的作用靶标。
一、昆虫几丁质酶生物化学与生理作用昆虫几丁质酶存在于中肠、蜕皮腺及某些昆虫的毒腺中,是一种糖蛋白,可以水解昆虫体壁和中肠中的几丁质,酶切位点通常随机发生在链中间的任何一个部位,其最终产物是可溶低分子量的GlcNAC寡聚物。
昆虫蜕皮时约有90%的几丁质被降解,几丁质酶和几丁质之间的作用是一种动态过程,包括经过几丁质结合区(CBD)的吸附过程、水解过程、解吸附作用及活性催化区在作用底物表面的配置过程。
昆虫几丁质酶除能降解几丁质外,还担负许多重要生理功能,如昆虫肠道组织中的几丁质酶具有分解肠内和围食膜的几丁质和消化作用。
昆虫几丁质酶分泌到肠道中,以无活性酶原形式存在,在需要时被胰蛋白酶激活而降解围食膜。
蜕皮腺中的几丁质酶可以调节昆虫在生长发育中周期性蜕皮并合成新表皮。
毒腺中的几丁质酶有助于毒腺物质在取食对象的组织中扩散渗透。
二、昆虫几丁质酶分子特征1993年,编码昆虫几丁质酶的cDNA序列首次从烟草天蛾Manduca sexta中克隆出来。
目前已克隆得到烟草天蛾、家蚕Bombyx mori和美国白蛾Hyphantria cunea等十几种昆虫的几丁质酶cDNA序列。
这些克隆的基因主要集中在鳞翅目昆虫中,双翅目、鞘翅目和膜翅目仅有少数几丁质酶基因被克隆的报道。
昆虫几丁质酶分子量在40~85kDa之间,比植物几丁质酶(25~40kDa)和细菌几丁质酶(20~60kDa)大。
酶活性范围为pH4~8,等电点在5~7之间,大都属于18家族几丁质酶。
昆虫几丁质酶为多结构域蛋白,一般都包含信号肽区、一个或多个N-端催化区、富含丝氨酸和苏氨酸(S/T)的糖基化位点区(linker区)、一个或多个fibronectin-like区和C-端富含半胱氨酸(Cys)的几丁质结合区(CBD)。
但不同昆虫的几丁质酶,其多区结构有所不同,如一种寄生蜂Chelonus sp.的几丁质酶大小为52kDa,有一个富含丝氨酸和苏氨酸的区域,但缺少C-端富含半胱氨酸的区域。
这些结构域构成上的变化以及氨基酸序列的不同导致了昆虫几丁质酶在最适pH、催化活性、对几丁质的亲合力及稳定性方面的差异。
昆虫几丁质酶的多个结构区独自发挥功能,互不影响,其中N-端催化区序列具有保守性,决定酶的催化活性。
连接N-端催化区和几丁质结合区的linker区,是经过O-位高度糖基化修饰,而催化区只是适度的N-位糖基化修饰,linker区使几丁质酶易于分泌到细胞外,并且在有蛋白水解酶存在的情况下,保持几丁质酶的稳定性。
几丁质结合区(CBD)基本功能是使几丁质酶结合不溶性的底物并提高降解效率。
具有多个CDB区时,能增强昆虫几丁质酶对大分子不溶底物的结合能力及作用活性,提高催化区在水解不溶性底物时的催化效率,linker区也可能影响碳水化合物结合区的功能。
昆虫几丁质酶的CBD约为65个氨基酸,且不同的昆虫几丁质酶CBD序列有高度的相似性,其中6个Cys最为保守,存在于所有昆虫几丁质酶的CBD中。
研究表明, 几丁质酶的活性仅与活性催化区有关,而昆虫几丁质酶与体壁和中肠几丁质的相互作用依赖于几丁质结合区和活性催化区同等、共同的作用。
昆虫几丁质酶中有几个重要的氨基酸残基保守位点:W145,D144,E146和D142。
W145维持几丁质酶催化区域结构,对酶的催化活性产生重要影响。
如以甘氨酸替代则活性完全丧失,但是W145对几丁质酶与几丁质之间的结合并不是必需的。
E146在水解中起酸碱催化剂的作用,D144维持一种电离平衡,D142影响几丁质酶最适pH值,该位点的突变可使几丁质酶最适PH由碱性变为酸性。
三、昆虫几丁质酶基因的体内表达昆虫几丁质酶的表达受蜕皮激素的诱导,而保幼激素抑制其表达。
研究表明,在没有几丁质酶基因表达的虫期,蜕皮激素类似物(RH5992)能够诱导云杉卷叶蛾几丁质酶基因的表达,在诱导36h后表达量最大,且几丁质酶基因仅在体壁表达,这种现象可能是因为诱导表达是一种间接表达,需要某些只在体壁才具有的因子参与。
在昆虫生长发育过程中,几丁质酶表达具有组织特异性。
Northern杂交在云杉卷叶蛾体壁和脂肪体中检测到几丁质酶mRNA的表达;通过Western杂交在体壁和中肠中检测到了几丁质酶蛋白质。
RT-PCR分析表明,棉铃虫Heliothisarmigera体壁、肠道、脂肪体中存在几丁质酶基因转录产物。
表达水平随昆虫不同生长发育阶段而变化。
蜕皮液中的几丁质酶仅仅是在幼虫-幼虫、幼虫-蛹和蛹-成虫期的蜕皮前短暂时间内表现活性,且在蜕皮前达到高峰。
四、影响昆虫几丁质酶活性因素温度、pH、紫外线等因子均可影响昆虫几丁质酶的活性。
昆虫几丁质酶pH范围较宽,以便其能在微酸(血淋巴)和微碱性环境(内脏)中起作用。
大部分植物、细菌和动物来源的几丁质酶最适宜的几丁质酶pH约为6。
昆虫几丁质酶在pH为4~8范围内具有活性,等电点为5~7。
在30~60℃之间昆虫几丁质酶活性较高且持久,温度超过60℃活性迅速降低。
果蝇Drosophila hydei几丁质酶最适宜的pH为5.5~6.2,最适宜温度为35℃;Locusta migratoria几丁质酶最适宜的pH为4~5,最适温度约为50℃。
作用底物不同时,昆虫几丁质酶表达的适宜pH、温度也存在差异。
家蚕54 kDa几丁质酶作用于短底物N-acetylchitopentaose(GlcNAc5)时,最适pH为6.0,最适温度为60℃;作用于长底物glycolchitin、pH为9.5~10.0时酶活性高,pH为4.0时活性低。
另外,在最适PH值情况下,作用于GlcNAc5时,家蚕的65 kDa和88 kDa两种几丁质酶在60℃时都表现出了高活性。
pH值对昆虫几丁质酶活性的影响,可能是因为昆虫几丁质酶在多区结构及氨基酸序列方面的不同造成的。
某些二价阳离子也影响昆虫几丁质酶的活性。
9 mMHgCl2抑制家蚕65 kDa和88 kDa几丁质酶活性分别达58%和72%,但9 mM CuSO4只能抑制65 kDa几丁质酶43%活性,而对88 kDa几丁质酶无抑制作用。
2.3 mM EDTA 对65 kDa和88 kDa几丁质酶几乎都没有影响。
除以上几种影响因素外,昆虫不同部位的几丁质酶其活性也不一样。
如果蝇体壁、肠道和脂肪体中的几丁质酶都有活性,但在体壁中的具有最高的活性,脂肪体中的仅有微弱的活性。
五、昆虫几丁质酶在植物害虫防治上的应用前景当前,几丁质酶在植物保护中的应用研究方兴未艾。
对昆虫几丁质酶的利用,包括使昆虫体内的几丁质酶水平低于或高于正常水平两个方面,从而扰乱昆虫正常的生长发育节律,甚至使昆虫死亡。
Blattner-R等合成了几丁质酶的抑制剂al-losamidin,用它对幕衣蛾Tineola biselliella幼虫进行实验,发现暴露于alosamidin的幕天蛾幼虫比对照具有更高的致死率。
1.几丁质酶的增效作用从上世纪70年代开始,人们就已知道细菌几丁质酶能增强昆虫病原微生物的效力。
研究中发现,昆虫几丁质酶也能增强Bt转基因植物的抗虫效果。
Ding等(1998)将烟草大蛾几丁质酶基因导入烟草中,用转基因烟草喂食烟草蚜虫和烟草天蛾幼虫,蚜虫幼虫生物量及成活率都显著下降,但对天蛾幼虫似乎没有明显影响。
当用亚致死浓度的Bt制剂处理转基因烟草来喂食蚜虫和天蛾幼虫,烟草叶片的损失量明显少于单独使用Bt的非转基因烟草,两种昆虫的生长都受到显著抑制。
Shapiro 等(1987)研究发现几丁质酶能显著增强杆状病毒LdMNPV对舞毒蛾Lymantria dispar的致死作用。
在NPV制剂中添加1%的几了质酶,14d幼虫死亡率即达到50%,而单用NPV制剂21d 幼虫死亡率仅为50%。
观察14d和21d的死亡情况,加入0.001%、0.01%、0.1%和1%几丁质酶的NPV比不加几丁质酶的LC50分别下降了1.3,2.0,3.2和5.4倍。
有人用带有烟草天蛾几丁质酶基因的AcMNPV病毒去注射草地贪夜蛾幼虫,发现死亡率明显高于单独使用野生型AcMNPV处理的对照组。
2.转昆虫几丁质酶基因植物的培育目前,转几丁质酶基因的研究主要集中在植物方面,其目的基因也主要来自于植物。
研究表明,一些细菌和植物几丁质酶对昆虫的影响很小,一般认为对昆虫防治以昆虫病原真菌和昆虫源几丁质酶为好。
目前已通过各种途径,将昆虫几丁质酶基因导入到植物以增强其抗虫能力。
据研究,烟草天蛾几丁质酶对市场锯谷盗Oryzaephilus mercator具有毒性。
当该基因被转入烟草后,能抑制烟蚜夜蛾Helicoverpa virescens幼虫的生长。
Gatehous Amk等将昆虫几丁质酶基因转入马铃薯,获得的转基因马铃薯增强了对蚜虫的抗性。
还有人将昆虫几丁质酶基因应用于抗病原真菌植物的转基因研究。
在植物转基因研究中,单个基因的转化易使昆虫产生抗性。
若同时把1个以上不同作用机制的基因导入植物中,将会减缓昆虫抗性的产生。
当把昆虫几丁质酶基因(chi)和蝎子毒素基因BmkIT(Bmk)同时转入Brassica napus时,2个基因的表达量都相对较高时,转基因植株表现出较高的杀虫活性。
而只有1种基因表达量较高时,转基因植株则表现出中等或更低的杀虫活性。
张志云等已成功构建了包含烟草天蛾几丁质酶和蝎特异性神经毒素2个基因的双价转化载体,并对棉花进行了转化。
昆虫几丁质酶基因可应用于植物转基因,扩充抗虫基因来源,构建多样的抗性系统。
但在应用中也存在问题,如昆虫几丁质酶基因mRNA 在转基因植物体内的转录水平低;目的基因对非靶标生物的副作用以及安全性问题等。
但随着研究的不断深入和抑制因素逐步解决,昆虫几丁质酶基因在植物保护中的应用将会更加广泛。
3.基于昆虫几丁质酶生物杀虫剂根据几丁质酶在昆虫蜕皮和变态中的作用机制,对昆虫几丁质酶时空表达及诱导表达做了深入研究,但通过扰乱围食膜或体壁中几丁质代谢而将几丁质酶用作生物杀虫剂的研究还未广泛开展。
由于昆虫几丁质酶能使几丁质水解成低分子、可溶和不可溶的低聚糖,因此有望作为一种潜在的生物杀虫剂。
将含有鳞翅目昆虫番茄灰夜蛾Lacanobia oleracea几丁质酶的重组酵母以及含有此几丁质酶的一种融合蛋白连接到雪花莲外源凝集素GNA的N端,这2种蛋白对番茄灰夜蛾都具有高的毒性。