第二章_紫外可见分光光度法
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2.紫外可见分光光度法
一均匀的、非散射的吸光物质溶液时，溶液的吸光
度与溶液浓度和厚度的乘积成正比。
21
（2）表达形式 （Ⅰ）
A = lg
I0 I
= abc
式中， A： 吸光度 , 反映了溶液对光的吸收程度，为
无因次量 ；
b：液层厚度(吸收光程长度)，单位为 cm ；
c：溶液的浓度，单位 g · L-１ ；
a：吸光系数，单位
答对了！
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43
课堂练习
7.常用作光度计中获得单色光的组件是 （ ）
A.光栅(或棱镜)+反射镜 C.光栅(或棱镜)+稳压器 B.光栅(或棱镜)+狭缝
D.光栅(或棱镜)+准直镜
很遗憾，您答错了 很遗憾，您答错了 很遗憾，您答错了
答对了！
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44
课堂练习
8. 某药物的摩尔吸光系数（）很大，则表 明（ ）
答对了！
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39
课堂练习
3.常见紫外-可见发光光度计的波长范围为 （ ）
B. 400～760 nm
A. 200～400 nm C. 200～760 nm 很遗憾，您答错了 很遗憾，您答错了 很遗憾，您答错了
D. 400～1000 nm
答对了！
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40
课堂练习
4. 在分光光度法中，运用朗伯－比尔定 律进行定量分析采用的入射光为（ ）
A.白光 C.可见光 B.单色光
D.紫外光
很遗憾，您答错了 很遗憾，您答错了 很遗憾，您答错了
答对了！
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41
课堂练习
5. 符合朗伯-比尔定律的有色溶液稀释 时，其最大吸收峰的波长位置 （ ）
紫外-可见分光光度法-N讲解
2.红移与蓝(紫)移 化合物结构及溶剂改变等，使吸收峰向长波长方向移动的现象 化合物结构及溶剂改变等，使吸收峰向短波长方向移动的现象
第一节 基本原理
一、紫外-可见吸收光谱与紫外-可见吸收光谱法 甲苯E h
二、紫外-可见吸收光谱的产生 吸收紫外-可见光产生分子能级跃迁
1. 有机化合物中的电子轨道及其跃迁 s键： s、s*轨道 p键： p、p*轨道
孤对电子：n轨道
σ~σ*跃迁 > n~σ*跃迁 >
σ*
π~π*跃迁 > n~π*物
En
含p键的有机物 共轭体系
π
含非键电子的不饱和有机物 杂原子 σ
第一节 基本原理
一、紫外-可见吸收光谱与紫外-可见吸收光谱法 E h
波长/nm 分区名称 波长/mm 分区名称
<0.005 g射线 0.8~2.5 近红外光
l=650nm =4.62×1014Hz E=3.06×10-19j=1.91eV
0.005~10 X射线 2.5~50
中红外光
10~200 真空紫外 50~1000 远红外光
200~400 近紫外光 1~300mm
微波
400~800 可见光 >300mm 无线电波
第一节 基本原理
一、紫外-可见吸收光谱与紫外-可见吸收光谱法
二、紫外-可见吸收光谱的产生 实现能量交换
1. 电磁波与电磁波的能量 c / l E h
2. 分子的能量
量子化
E 连续能 Ev Er Ee
E
n1
V3
V2
V1
n0
JJ12
第一节 基本原理
l、I0
l、I T I / I0 透光率
A lg T 吸光度
第一节 基本原理
一、紫外-可见吸收光谱与紫外-可见吸收光谱法 甲苯E h
二、紫外-可见吸收光谱的产生 吸收紫外-可见光产生分子能级跃迁
1. 有机化合物中的电子轨道及其跃迁 s键： s、s*轨道 p键： p、p*轨道
孤对电子：n轨道
σ~σ*跃迁 > n~σ*跃迁 >
σ*
π~π*跃迁 > n~π*物
En
含p键的有机物 共轭体系
π
含非键电子的不饱和有机物 杂原子 σ
第一节 基本原理
一、紫外-可见吸收光谱与紫外-可见吸收光谱法 E h
波长/nm 分区名称 波长/mm 分区名称
<0.005 g射线 0.8~2.5 近红外光
l=650nm =4.62×1014Hz E=3.06×10-19j=1.91eV
0.005~10 X射线 2.5~50
中红外光
10~200 真空紫外 50~1000 远红外光
200~400 近紫外光 1~300mm
微波
400~800 可见光 >300mm 无线电波
第一节 基本原理
一、紫外-可见吸收光谱与紫外-可见吸收光谱法
二、紫外-可见吸收光谱的产生 实现能量交换
1. 电磁波与电磁波的能量 c / l E h
2. 分子的能量
量子化
E 连续能 Ev Er Ee
E
n1
V3
V2
V1
n0
JJ12
第一节 基本原理
l、I0
l、I T I / I0 透光率
A lg T 吸光度
紫外-可见分光光度法 (2)全
第二章 紫外-可见分光光度法 (Ultraviolet and Visible Spectrophotometry, UV-Vis)
2.1 紫外-可见吸收光谱 2.2 紫外-可见光度计仪器组成 2.3 吸收光谱的测量-----Lambert-Beer 定律(新增) 2.4 分析条件选择(新增) 2.5 UV-Vis分光光度法的应用
的或者说将产生非连续谱。因此，分子的能量变化E为各种形式能量变
化的总和：
ΔΕ ΔΕe ΔΕv ΔΕr
其中Ee最大：1-20 eV; Ev次之：0.05-1 eV; Er最小：0.05 eV
可见，电子能级间隔比振动能级和转动能级间隔大1~2个数量级， 在发生电子能级跃迁时，伴有振-转能级的跃迁，形成所谓的带状光谱。
用于盛放样品。可用石英或玻璃两种材料制作，前者适于紫外区和 可见光区；后者只适于可见光区。有些透明有机玻璃亦可用作吸收池。
四、检测器：硒光电池、PMT、PDA
二、紫外可见光度计仪器 分光光度计分为单波
长和双波长仪器。
1. 单波长分光光度计 (a) 单光束 (b) 双光束（空间分隔） (c) 双光束（时间分隔）
如CH2=CH2的-*跃迁，max=165~200nm；而1,3-丁二烯， max=217nm 2）异构现象：使异构物光谱出现差异。
如 CH3CHO 含 水 化 合 物 有 两 种 可 能 的 结 构 ： CH3CHO-H2O 及 CH3CH(OH)2; 已烷中，max=290nm，表明有醛基存在，结构为前
不同物质结构不同或者说 其分子能级的能量(各种能级 能量总和)或能量间隔各异， 因此不同物质将选择性地吸收 不同波长或能量的外来辐射， 这是UV-Vis定性分析的基础。
定性分析具体做法是让不 同波长的光通过待测物，经待 测物吸收后，测量其对不同波 长 光 的 吸 收 程 度 ( 吸 光 度 A) ， 以吸光度A为纵坐标，辐射波 长为横坐标作图，得到该物质 的吸收光谱或吸收曲线，据吸 收曲线的特性(峰强度、位置 及数目等)研究分子结构。
2.1 紫外-可见吸收光谱 2.2 紫外-可见光度计仪器组成 2.3 吸收光谱的测量-----Lambert-Beer 定律(新增) 2.4 分析条件选择(新增) 2.5 UV-Vis分光光度法的应用
的或者说将产生非连续谱。因此，分子的能量变化E为各种形式能量变
化的总和：
ΔΕ ΔΕe ΔΕv ΔΕr
其中Ee最大：1-20 eV; Ev次之：0.05-1 eV; Er最小：0.05 eV
可见，电子能级间隔比振动能级和转动能级间隔大1~2个数量级， 在发生电子能级跃迁时，伴有振-转能级的跃迁，形成所谓的带状光谱。
用于盛放样品。可用石英或玻璃两种材料制作，前者适于紫外区和 可见光区；后者只适于可见光区。有些透明有机玻璃亦可用作吸收池。
四、检测器：硒光电池、PMT、PDA
二、紫外可见光度计仪器 分光光度计分为单波
长和双波长仪器。
1. 单波长分光光度计 (a) 单光束 (b) 双光束（空间分隔） (c) 双光束（时间分隔）
如CH2=CH2的-*跃迁，max=165~200nm；而1,3-丁二烯， max=217nm 2）异构现象：使异构物光谱出现差异。
如 CH3CHO 含 水 化 合 物 有 两 种 可 能 的 结 构 ： CH3CHO-H2O 及 CH3CH(OH)2; 已烷中，max=290nm，表明有醛基存在，结构为前
不同物质结构不同或者说 其分子能级的能量(各种能级 能量总和)或能量间隔各异， 因此不同物质将选择性地吸收 不同波长或能量的外来辐射， 这是UV-Vis定性分析的基础。
定性分析具体做法是让不 同波长的光通过待测物，经待 测物吸收后，测量其对不同波 长 光 的 吸 收 程 度 ( 吸 光 度 A) ， 以吸光度A为纵坐标，辐射波 长为横坐标作图，得到该物质 的吸收光谱或吸收曲线，据吸 收曲线的特性(峰强度、位置 及数目等)研究分子结构。
紫外可见分光光度法在食品检测中的应用
定，A-c曲线应为经过原点旳直线，但实际
工作中直线经常发生弯曲，这称为朗伯-比
尔定律旳偏离。
原因：
吸光物质浓度较高；非单色光引起；介质
不均匀引起；吸光物质不稳定引起。
摩尔吸收系数ε：
1mol/L浓度旳溶液，液层厚度为1cm时旳吸
收度。
强吸收：ε＞104；
中档强度吸收：102 ＜ ε ＜ 104；
度。（吸收池厚度为10.0mm)。
c.
4、紫外-可见分光光度计旳构成、类型和使用
（1）构成：光源、单色器、吸收池、检测器、
信号处理器、显示屏
可见光源：碘钨灯、钨灯：320-2500nm
紫外光源：氢灯、氘灯、汞灯：150-400nm
玻璃吸收池：仅用于可见光区
石英池：可用于紫外光区和可见光区
选择原则：
能完全溶解样品；
在所用旳波长范围内有很好旳透光性；
纯度为“光谱纯”或经检验其空白符合要求。
处理措施：
蒸馏水煮沸清除气泡；
乙醇清除醛类、苯等杂质；
环己烷、正己烷清除苯；
氯仿预防光和空气破坏；
乙醚清除过氧化物；
烃类吸附除杂
（3）参比溶液旳选择
1）. 溶剂参比：试样构成简朴、共存组份少（基体
注意事项：
粗酶液制备时根据目旳酶旳性质选择缓冲液、温度、
时间等条件；
酶和底物旳反应条件也要恰当；
一般以检测产物变化量居多。
二、紫外-可见分光光度法
在食品检测中旳应用
（一）、食品酶分析
1、-半乳糖苷酶（乳糖酶）
以ONPG（邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷）为
底物测定-半乳糖苷酶活力。
工作中直线经常发生弯曲，这称为朗伯-比
尔定律旳偏离。
原因：
吸光物质浓度较高；非单色光引起；介质
不均匀引起；吸光物质不稳定引起。
摩尔吸收系数ε：
1mol/L浓度旳溶液，液层厚度为1cm时旳吸
收度。
强吸收：ε＞104；
中档强度吸收：102 ＜ ε ＜ 104；
度。（吸收池厚度为10.0mm)。
c.
4、紫外-可见分光光度计旳构成、类型和使用
（1）构成：光源、单色器、吸收池、检测器、
信号处理器、显示屏
可见光源：碘钨灯、钨灯：320-2500nm
紫外光源：氢灯、氘灯、汞灯：150-400nm
玻璃吸收池：仅用于可见光区
石英池：可用于紫外光区和可见光区
选择原则：
能完全溶解样品；
在所用旳波长范围内有很好旳透光性；
纯度为“光谱纯”或经检验其空白符合要求。
处理措施：
蒸馏水煮沸清除气泡；
乙醇清除醛类、苯等杂质；
环己烷、正己烷清除苯；
氯仿预防光和空气破坏；
乙醚清除过氧化物；
烃类吸附除杂
（3）参比溶液旳选择
1）. 溶剂参比：试样构成简朴、共存组份少（基体
注意事项：
粗酶液制备时根据目旳酶旳性质选择缓冲液、温度、
时间等条件；
酶和底物旳反应条件也要恰当；
一般以检测产物变化量居多。
二、紫外-可见分光光度法
在食品检测中旳应用
（一）、食品酶分析
1、-半乳糖苷酶（乳糖酶）
以ONPG（邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷）为
底物测定-半乳糖苷酶活力。
仪器分析2(紫外可见光分光光度)
白光除了可由所有波长的可见光复 合得到外，还可由适当的两种颜色的 光按一定比例复合得到。能复合成白 光的两种颜色的光叫互补色光。
/nm 400-450 450-480 480-490 490-500 500-560 560-580 580-610 610-650 650-760
颜色 紫 蓝
绿蓝 蓝绿
改变溶剂的极性，会引起吸收带形状
的变化。改变溶剂的极性，还会使吸收带
的最大吸收波长发生变化。下表为溶剂
对一种丙酮紫外吸收光谱的影响。
正己烷 CHCl3 CH3OH H2O
* 230
238
237 243
n * 329
315
309 305
由于溶剂对电子光谱图影响很大， 因此，在吸收光谱图上或数据表中必 须注明所用的溶剂。与已知化合物紫 外光谱作对照时也应注明所用的溶剂 是否相同。在进行紫外光谱法分析时， 必须正确选择溶剂。
电子的跃迁吸收光的波长主要在
真空紫外到可见光区，对应形成的光 谱，称为电子光谱或紫外-可见吸收光 谱。
三．有机化合物的紫外—可见吸收 光谱
（一）、跃迁类型 主要有σ→σ*、n→σ*、n→π* 、 π→π*
n
E*
* n*
* n *
a.σ→σ* 跃迁主要发生在真空紫外区。 b. π→π* 跃迁吸收的波长较长，孤立
ε（480nm）=A/ cb
= -lg0.398/0.150×10-3 ×2.00 =1.33 ×103 ( L ·mol-1 ·cm-1)
由ε=aM , 得: a= ε/M
= ε /251=5.30(L ·g-1 ·cm-1)
三．实际溶液对吸收定律的偏离及原因： （一）偏离：被测物质浓度与吸光
比色分析和紫外可见分光光度法
1、紫外可见分光光度法 （1）紫外分光光度法：利用物质分子对紫外光的 选择性吸收，用紫外分光光度计测定物质对紫外光的 吸收程度来进行定型、定量分析的方法。 波长范围：200～400nm。 （2）可见分光光度法：利用物质分子对可见光的 选择性吸收特性，用可见分光光度计测量有色溶液对 可见光的吸收程度以确定组分含量的方法，则称为可 见分光光度法。 波长范围：400～800nm。 紫外分光光度法和可见分光光度的区别在于测定 波长范围不同，通常合称为紫外、可见分光光度法。
a
t
图2-2 溶液对光的作用
（1）透光率T 透过光强度与入射光强度之比，用“T”表示， 即： T=（It / I0）×100% T越大，透光程度越大，对光的吸收就越小； T越小，有色溶液透光程度越小，对光的吸收程度 就越大。 （2）吸光度A 入射光强度I0与透过光强度It之比的对数称为吸 光度，用“A”表示，即： A=lg（I0/ It）=lg（1/T） I0/ It越大，有色溶液透光程度越小，对光吸收 程度越大；反之，I0 / It越小，有色溶液透光程度越 大，对光吸收程度越小。
光谱中400 ~ 800nm 范围内的光作 用于人的眼睛，能引起颜色的感觉，故 称可见光。不同波长的可见光引起不同 的视觉效果，从而产生不同颜色。白光 是由不同颜色的光按一定的强度比例混 合而成的；如果将一束平行的白光通过 棱镜，则白光分解为红、成、黄、绿、 青、蓝、紫七种色光，各种颜色的色光 其波长范围如图表所示。
第三节 朗伯-比耳定律
一、朗伯、比耳定律 1、透光率、吸光度 溶液吸收光的程度与溶液的性质、浓度、入射光 的强度、波长以及溶液液层厚度等因素有关。 一束平行光（单色光）通过溶液（或固体、气体） 时，一部分光被溶液反射，一部分光被溶液吸收，一 部分光透过溶液，如果入射光强度为I0 ，吸收光强度 为Ia，透过光强度为It，反射光强度为Ir，那么， I0=Ia+It+Ir 在进行光度分析时，同一实验的各种溶液均采用 质料、大小、形状都相同的比色皿，故Ir相同，其影 响相互抵消，则： I0=Ia+It
a
t
图2-2 溶液对光的作用
（1）透光率T 透过光强度与入射光强度之比，用“T”表示， 即： T=（It / I0）×100% T越大，透光程度越大，对光的吸收就越小； T越小，有色溶液透光程度越小，对光的吸收程度 就越大。 （2）吸光度A 入射光强度I0与透过光强度It之比的对数称为吸 光度，用“A”表示，即： A=lg（I0/ It）=lg（1/T） I0/ It越大，有色溶液透光程度越小，对光吸收 程度越大；反之，I0 / It越小，有色溶液透光程度越 大，对光吸收程度越小。
光谱中400 ~ 800nm 范围内的光作 用于人的眼睛，能引起颜色的感觉，故 称可见光。不同波长的可见光引起不同 的视觉效果，从而产生不同颜色。白光 是由不同颜色的光按一定的强度比例混 合而成的；如果将一束平行的白光通过 棱镜，则白光分解为红、成、黄、绿、 青、蓝、紫七种色光，各种颜色的色光 其波长范围如图表所示。
第三节 朗伯-比耳定律
一、朗伯、比耳定律 1、透光率、吸光度 溶液吸收光的程度与溶液的性质、浓度、入射光 的强度、波长以及溶液液层厚度等因素有关。 一束平行光（单色光）通过溶液（或固体、气体） 时，一部分光被溶液反射，一部分光被溶液吸收，一 部分光透过溶液，如果入射光强度为I0 ，吸收光强度 为Ia，透过光强度为It，反射光强度为Ir，那么， I0=Ia+It+Ir 在进行光度分析时，同一实验的各种溶液均采用 质料、大小、形状都相同的比色皿，故Ir相同，其影 响相互抵消，则： I0=Ia+It
紫外可见分光光度法UltravioletVisible
A1 = 1bc1 A2 = 2bc2 A = 1bc1+ 2bc2
当物质中只有一种吸光组分，则上式简化 为：
A=bc
（3）定义2：若将I/I0称为透光度（亦称：透 射率），用T表示， T=I/I0 则 A= lgI0/I= - lgT= bc
2. 朗伯-比尔定律成立的条件及其偏离该定律 的因素 （1）成立的条件 (a) 适用于极稀的溶液(一般c<0.01molL-1)。 (b) 电磁波辐射和所讨论的吸光成分之间的 相互作用机制只是光被该成分吸收。 (c) 采用“单色光”。 (d) 吸收成分（分子或离子）的行为相互无 关，且不论其数量和种类如何。
iii) 分子络合物内部电荷转移 例如：在乙醇介质中，将醌与氢醌混 合，就可以得到美丽的醌氢醌暗绿色结晶， 它的吸收峰在可见光区。
特点：电荷转移吸收光谱的最大特点 是：吸收强度大，摩尔吸收系数一般超过 104L/ (mol cm)。
（3）两种吸收谱带的区别 这类光谱一般位于可见光区。 电荷迁移吸收带的谱带较宽，吸收强度 大，最大波长处的摩尔吸收系数max可大于 104 L cm-1mol-1。 与电荷迁移跃迁比较，配位场跃迁吸收 谱带的摩尔吸收系数小，一般max< 102L cm-1mol-1。
吸收峰红移，n→*跃迁所产生的吸收峰蓝移。
（3）除上述六种跃迁可产生紫外-可见吸收 谱带外，还有两种跃迁也可产生紫外-可见吸 收谱带，即电荷转移跃迁和配位场跃迁。
综上所述：发生在电磁光谱的紫外和可 见光区内的，由于电子的跃迁或转移而引起 的吸收光谱共有以上八种价电子跃迁类型。
3. 在有机物的紫外-可见谱解析中吸收带的分类 在有机物的紫外-可见谱解析中，通常将吸 收带分为以下四种类型。
而n→*、n→*和→*三种跃迁需要能
当物质中只有一种吸光组分，则上式简化 为：
A=bc
（3）定义2：若将I/I0称为透光度（亦称：透 射率），用T表示， T=I/I0 则 A= lgI0/I= - lgT= bc
2. 朗伯-比尔定律成立的条件及其偏离该定律 的因素 （1）成立的条件 (a) 适用于极稀的溶液(一般c<0.01molL-1)。 (b) 电磁波辐射和所讨论的吸光成分之间的 相互作用机制只是光被该成分吸收。 (c) 采用“单色光”。 (d) 吸收成分（分子或离子）的行为相互无 关，且不论其数量和种类如何。
iii) 分子络合物内部电荷转移 例如：在乙醇介质中，将醌与氢醌混 合，就可以得到美丽的醌氢醌暗绿色结晶， 它的吸收峰在可见光区。
特点：电荷转移吸收光谱的最大特点 是：吸收强度大，摩尔吸收系数一般超过 104L/ (mol cm)。
（3）两种吸收谱带的区别 这类光谱一般位于可见光区。 电荷迁移吸收带的谱带较宽，吸收强度 大，最大波长处的摩尔吸收系数max可大于 104 L cm-1mol-1。 与电荷迁移跃迁比较，配位场跃迁吸收 谱带的摩尔吸收系数小，一般max< 102L cm-1mol-1。
吸收峰红移，n→*跃迁所产生的吸收峰蓝移。
（3）除上述六种跃迁可产生紫外-可见吸收 谱带外，还有两种跃迁也可产生紫外-可见吸 收谱带，即电荷转移跃迁和配位场跃迁。
综上所述：发生在电磁光谱的紫外和可 见光区内的，由于电子的跃迁或转移而引起 的吸收光谱共有以上八种价电子跃迁类型。
3. 在有机物的紫外-可见谱解析中吸收带的分类 在有机物的紫外-可见谱解析中，通常将吸 收带分为以下四种类型。
而n→*、n→*和→*三种跃迁需要能
第二章 紫外-可见分光光度法
入射光通过溶液时，除一部分被吸光粒子吸收
外，还有部分因散射而损失，使透光度减小，
A实。所以往往发生正偏离。 • 化学因素引起的偏离 吸光物质常因离解、缔合而形成新化合物或 互变异构等化学变化而改变其浓度，导致了偏 离。例如 K2Cr2O7在水溶液中存在下列平衡：
2 2CrO4 Cr2O H 2O + 2 H 2 2 7 稀释或增大pH值 浓缩或减小pH值
如图所示，假设有一束强度为I0的单色平行
光，垂直通过一横面积为s的均匀介质。 当光强度为Ix的单色光通过
吸收层(db)后，光强度减弱
了dIx，则厚度为db的吸收
层对光的吸收率为-dIx/Ix，
另一方面，由于db为无限小，所以截面积上所有 吸光质点所占的面积之和(ds)与横截面积(s)之 比(ds/s)可视为该截面积上光子被吸收的几率， 即：-dIx/Ix=ds/s
降低由于单色光不纯造成负偏的方法： • 选择吸收曲线的max作入射光波长。因为吸收 曲线峰值顶部曲线较平坦，入射光谱带内各波长 的值相近。选择max，偏离光吸收定律较小。 只有当干扰物质存在并对待测物质的max产生
吸收时，才选择没干扰的其它波长作入射光波
长。
• 选择高分辨率仪器，使入射光波长范围尽可
5.传播速度c
c=· 单位：cm/s 二.微粒性 光的微粒性特征为：光由光子组成，而光子 具有能量，其能量与波长之间的关系为： E=h· =hc/ h—普朗克常数 6.626×10-34J· s 由上式可知，不同波长的光具有不同的能量， 波长愈长，光的能量愈低；反之，则愈高。
§2-2 分子光谱概述
若干个振动能级；在同一 电子能级和同一振动能级 中，因转动能量不同而分 为若干个转动能级。 若用E电、E振、E转分别表示三个能级， 则三者的关系为：E电＞E振＞E转。
外，还有部分因散射而损失，使透光度减小，
A实。所以往往发生正偏离。 • 化学因素引起的偏离 吸光物质常因离解、缔合而形成新化合物或 互变异构等化学变化而改变其浓度，导致了偏 离。例如 K2Cr2O7在水溶液中存在下列平衡：
2 2CrO4 Cr2O H 2O + 2 H 2 2 7 稀释或增大pH值 浓缩或减小pH值
如图所示，假设有一束强度为I0的单色平行
光，垂直通过一横面积为s的均匀介质。 当光强度为Ix的单色光通过
吸收层(db)后，光强度减弱
了dIx，则厚度为db的吸收
层对光的吸收率为-dIx/Ix，
另一方面，由于db为无限小，所以截面积上所有 吸光质点所占的面积之和(ds)与横截面积(s)之 比(ds/s)可视为该截面积上光子被吸收的几率， 即：-dIx/Ix=ds/s
降低由于单色光不纯造成负偏的方法： • 选择吸收曲线的max作入射光波长。因为吸收 曲线峰值顶部曲线较平坦，入射光谱带内各波长 的值相近。选择max，偏离光吸收定律较小。 只有当干扰物质存在并对待测物质的max产生
吸收时，才选择没干扰的其它波长作入射光波
长。
• 选择高分辨率仪器，使入射光波长范围尽可
5.传播速度c
c=· 单位：cm/s 二.微粒性 光的微粒性特征为：光由光子组成，而光子 具有能量，其能量与波长之间的关系为： E=h· =hc/ h—普朗克常数 6.626×10-34J· s 由上式可知，不同波长的光具有不同的能量， 波长愈长，光的能量愈低；反之，则愈高。
§2-2 分子光谱概述
若干个振动能级；在同一 电子能级和同一振动能级 中，因转动能量不同而分 为若干个转动能级。 若用E电、E振、E转分别表示三个能级， 则三者的关系为：E电＞E振＞E转。
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氘灯
钨灯 卤钨灯
185~400
320~2500 250~2000
紫外
可见，近红外 紫外，可见，近红外
单色器 作用:产生单色光 常用的单色器：棱镜和光栅
样品池（吸收池、比色皿）
厚度(光程): 0.5, 1, 2, 3, 5…cm 材质：玻璃比色皿－－可见光区 石英比色皿－－可见、紫外光区
检测器 作用：接收透射光，并将光信号转化为电信号 常用检测器： 光电管 光电倍增管 光二极管阵列
（二）偏离Lambert-Beer定律的原因
5. 浓度的限制
朗伯-比尔定律假定物质分子之间不发生相互作 用，因此只有稀溶液时才基本符合。 浓度较高时，物质分子间会互相影响对方的电 荷分布，吸光性能发生改变，必然导致偏离。朗 伯-比尔定律
三 吸光系数
吸光系数K物理意义：液层厚度为1cm的 单位浓度溶液的吸光度，它表示物质对特定 波长光的吸收能力。一个物质在一定条件下 的吸光系数为定值。通常有两种表示方法：
的有色化合物进行测定，选择具有最大ε值的波
长作入射光。
（2） 百分吸光系数
一定波长下，吸光物质的溶液浓度为 1g/100ml(1%)，液层厚度为1cm时， 溶液的吸光度。设吸光物质的摩尔质量为 M g/mol ，则：
1mol/L＝M g/1000ml＝M/10· 1g/100ml
∴
ε＝
×
例：将 1.00mg 维生素 B12（摩尔质量 为 1355）溶于 25.00ml 蒸馏水中，用 1.0cm 比色杯，在 361nm 波长下，测 得吸光度为 0.400，计算百分吸光系数。
三 吸光系数
例：用氯霉素（分子量为323.15）纯品配制 100mL含2.00mg的溶液，使用1.00cm的吸收池， 在波长为278nm处测得其透射率为24.3%，试计 算氯霉素278nm波长处的摩尔吸光系数和百分吸 光系数。
解：已知： M=323.15g/mol c=2.00×10-3% T=24.3%
物质对光的选择性吸收
1、单色光：同一波长的光 2、复合光：不同波长组成的光 3、互补色光：若两种光按适当的强度比 例混合而成白光，则这两种光称为互 补色光
引言：什么是紫外-可见分光光度法？
是根据溶液中物质分子或离子对波长为 200-760nm这一范围的电磁波（紫外和可见 光谱）的吸收特特点建立起来的一种定性、 定量和结构分析方法。
当一束单色光通过均匀的溶液时，光 的一部分被吸收，一部分透过溶液，还有 一部分被器皿表面反射。设入射光强度为 I0,吸收光强度为Ia，透射光强度为It，则：
I0 I a It
1. 透光率
透射光(It)占入射光（I0） 的比例的大小称为透光 率，用T表示：
It T I0
透光率越大，溶液对光的吸收越少； 反之，透光率越小，溶液对光的吸收 越多。
吸光度A
表示物质对光的吸收程度。 吸光度A公式：
I0 A lg T lg It
透光率的负对数称为吸光度，用A表示。 A越大，表示物质的吸光能力越强。
二、朗伯--比尔定律 分光光度法定量的依据
（一） 光的吸收定律 当一束平行的单色光通过某一均匀、无散射 的含有吸光物质的溶液时，在入射光的波长、 强度以及溶液的温度等因素保持不变的情况下， 该溶液的吸光度A与溶液的浓度C及溶液的厚度 b的乘积成正比关系，称为朗伯-比尔定律：
1、显色反应及其条件
可见光区的吸光光度法只能用于测定有色 溶液。
对无色溶液和颜色较浅的溶液进行测定时，必须将 被测组分转变成有色化合物(显色反应)。 能与被测组分反应使之生成有色化合物的试剂称为 显色剂。
显色剂必须满足下述条件：
（1）灵敏度要高：要求选择的显色剂能与待测组分生 成摩尔吸收系数较大的有色化合物。 （2）选择性要好。 （3）有色化合物稳定性好 。 （4）反应定量完成，否则再现性就较差。 （5）有色化合物与显色剂的最大吸收波长的差别要足 够大，一般要求相差 60 nm 以上。
第二节 紫外-可见分光光度计
吸光度与被测物质浓度的关系符合朗伯-比 尔定律，那么如何测量吸光物质的吸光度？应 该使用紫外-可见分光光度计来进行测量，其基 本结构有五部分组成：
分别为： 光源 单色器 吸收池 接受器 显示系统
光源
单色器
比色皿
检测器
显示系统
光源 ：提供入射光
常用光源
光源 氢灯 波长范围(nm) 185~375 适用于 紫外
结果显示记录系统
检流计、微安表，电位计、数字电压表、记录仪、
示波器及计算机等进行仪器自动控制和结果处理。
第三节 分析条件的选择
1、显色反应及其条件
2、测定波长的选择 3、吸光度范围的选择 4、参比溶液的选择
微量Fe3+、Cu2+的溶液，如何用可见分 光光度法进行测量？通过显色反应，使无色 或浅色的溶液转化成有色的溶液，借此进行 测量。
那么光的本质是什么？ 光具有波动性，用波长(λ)和频率(ν)表 示；光具有粒子性，用能量(E)表示不同波长 的光具有不同的能量。
既然太阳光可以色散成各种波长的有色光， 但为什么平时我们却看不到有色光？
把适当颜色的两种光按一定强度比例混合能 成为白光，这两种颜色的光称为互补光。太阳 光中各种色光两两互为互补，成为白光，所以 我们看到的太阳光是无色的。
互补色光示意图
为什么我们看到的物质具有不同的颜色？ 这是因为物质选择性吸收了某种颜色的光， 而呈显出被吸收光的互补光的颜色。
如: CuSO4溶液选择性地吸收白光中间的黄色 光，故CuSO4溶液呈蓝色。 [Fe(SCN)6]3-呈血红色，说明其溶液选择 性地吸收白光中的青色光。 如果溶液不吸收白色光，则溶液表现为 无色透明；如溶液对所有颜色的光全部吸收， 则溶液呈黑色。
（二）偏离Lambert-Beer定律的原因
4. 溶液本身发生化学变化的影响
溶液中待测组分发生了解离、缔合等作用， 造成物质光化学性质改变，偏离了偏离朗伯-比 尔定律。例如，铬酸盐在溶液中有如下平衡： 离解、缔合、异构等 如：Cr2O72-+H2O-=2HCrO4-=2H++2CrO42橙色 黄色 lnm=350nm lnm=375nm Cr2O72-呈橙色，而 CrO42- 呈黄色，二者对 不同波长 的光线的吸收性能完全不同。
四 吸收光谱
由高锰酸钾溶液吸收光谱曲线，我们可得到如 下信息： ⑴ 高锰酸钾溶液对不同波长的光的吸收程 度是不同的，对波长为525nm的绿色光吸收最多， 在吸收曲线上有一高峰（称为吸收峰），而对红色 光和紫色光吸收很少，几乎能完全透过，因此 KMnO4溶液呈紫红色。光吸收程度最大处的波长称 为最大吸收波长（常以λ max表示）。在进行光度 测定时，通常都是选取在λ max的波长处来测量， 因为这时可得到最大的测得灵敏度。
“十一五”国家规划教 材
第二章
紫外-可见分光光度法
学习目标
1. 掌握紫外-可见可见分光光度法的原理；
2. 熟悉紫外-可见可见分光光度计的结构及各部 分作用，了解不同类型分光光度计的结构； 3. 了解紫外-可见分光光度法实验条件的选择； 4. 掌握紫外-可见分光光度计的定性定量方法。
补充内容 --- 光的性质
主要内容
§2.1 §2.2 §2.3 §2.1 基本原理 紫外-可见分光光度计 分析条件的选择 紫外-可见分光光度法的应用
§4.1 基本原理
透光率和吸光度 光的吸收定律 偏离朗伯-比尔定律 的因素
基 本 原 理
Lambert-Beer定律 吸光系数
摩尔吸光系数
百分吸光系数
吸收光谱
一、透光率和吸光度
⑵ 不同浓度的高锰酸钾溶液，其吸收曲线的形状相
似，最大吸收波长也一样，不过峰高不相同。不同物质 的吸收曲线，其形状和最大吸收波长都各不相同。因此， 可利用吸收曲线来作为物质定性分析的依据。 ⑶ 不同浓度的同一种物质的溶液，若在相同的波长 处测量，其所测得的吸光度随浓度的增加而增大，吸收 峰也随之增高。这便是物质定量分析的理论依据。
M + R
lmax 溶剂 光 学 透 明
吸收 吸收 吸收 吸收
= M-R lmax 参比液组成
溶剂 不加显色剂的试液 显色剂+溶剂
显色剂
无吸收 无吸收 吸收 吸收
吸光物质
显色剂 + 试液 + 待测组分的 掩蔽剂
第四节 紫外-可见分光吸收光谱法的应用
1. 定量分析
定量依据：朗伯-比耳定律， 吸光度 A= b c 灵敏度高： max在104～105 之间 吸光度在0.2-0.8之间，误差较小，测定较准确。
摩尔吸光系数 吸光系数
百分吸光系数
K值的大小取决于吸光物质的性质、入射 光波长、溶液温度和溶剂性质等，与溶液浓 度大小和液层厚度无关。但K值大小因溶液
溶液的浓度以物质的量浓度（mol· L-1）表示，液层
厚度以厘米（cm）表示时，相应的比例常数K称为摩尔 吸光系数。以ε表示，其单位为L· mol-1· cm-1。这样，比
3、吸光度范围的选择
控制浓度
吸光度A：0.2～0.8
4. 参比液的选择
原则： 扣除比色皿、样品基体（非待测组分）和显色剂的吸收
A （样） = A （待测吸光物质） + A （干扰）+ A （池） A （参比） = A （干扰）+ A （池） 以显色反应为例进行讨论 若欲测 M-R 的吸收 试样
无吸收 基体吸收 无吸收 基体吸收
例：已知某化合物的相对分子质量为251，将此 化合物用乙醇作溶剂配制成浓度为0.150mmol· L－ 1的溶液，在480nm波长处用2.00cm吸收池测得透 光率为39.8％，求该化合物在上述条件下的摩尔 吸光系数ε解：由Lambert-Beer定律可得