植物组织培养中褐变机理和防治措施

植物组织培养中褐变机理和防治措施摘要：褐变现象是指组织培养诱导脱分化或再分化的过程中，外植体组织从表面向培养基释放褐色物质而使得培养基逐渐变成褐色，外植体随之褐变死亡的现象，褐变现象又称酚污染，在植物组织培养过程中经常出现。

对诱导外植体的脱分化和培再分化过程的影响非常大，甚至是影响某些植物组织培养成功与否的关键。

褐变主要发生在外植体、愈伤组织的继代、悬浮细胞培养、原生质体的分离与培养等。

褐变产物不仅使外植体、细胞、培养基等变褐，而且对许多酶有抑制作用，从而影响培养材料的生长与分化，严重时甚至导致死亡。

本文对褐变的影响因素和对策进行了研究。

关键词：组织培养，褐变，影响因素1. 影响褐变的因素因子是复杂的，随植物的种类、基因型、外植体部位及生理状态等的不同，褐变的程度也有所不同。

1.1褐变类型及基因型物种及其基因型对褐化的影响。

植物组织培养过程中外植体的褐化主要由多酚氧化酶作用于酚类物质而引起的。

不同植物品种、同种植物的不同类型因为外植体材料的基因型不同，在组织培养中褐化发生的频率和程度都存在着较大的差异[4]。

由于酚类的糖苷化合物是木质素、单宁和色素的合成前体，木本植物、单宁含量或色素含量高的植物酚类物质含量也很高，木质素、单宁或色素形成多，其组织培养就容易发生褐变。

因此，组织培养过程中，木本植物一般比草本植物易发生褐变。

目前报道发生褐变的植物中多数是木本植物[5]。

在木本植物中，核桃、板栗由于单宁含量很高，进行组织培养难度很大，不仅在接种后的初代培养期容易发生褐变，而且在形成愈伤组织以后也会因为褐变而引起死亡。

红豆杉愈伤组织的诱导及继代培养过程中，常常发生培养细胞褐变现象，轻者影响细胞生长和繁殖，重者导致细胞死亡。

豆科植物和芸苔属植物原生质体培养中容易褐化也是一个普遍的问题，橡胶的花药培养中，海垦2号花药的褐变较少，因而愈伤组织的诱导容易；而有些品系花药容易褐变，因而愈伤组织的诱导困难。

在组织培养中，有些品种、品系难以成功，而有些则容易成功。

油菜叶原生质体品种373褐化比品种94591、95386严重1.2外植体部位及生理状态褐化程度也因为外植体材料的生理状态不同存在差异。

分生组织细胞分裂频率高、生长速度快，所以分生部位外植体比分化部位外植体褐化程度轻。

范志强[6]在培养辣椒下胚轴及子叶组织时发现，下胚轴具有较强的分生能力，整个外植体组织生长旺盛，褐变程度比较低。

Chever对欧洲栗酚类含量变化的分析结果表明，幼龄材料酚类化合物含量低，而成龄材料含量较高[7]，因此培养过程中幼年型材料发生的褐变程度轻于成年型材料。

王异星[8]在荔枝无菌苗不同组织的诱导实验中发现，根部极大部分基本不能诱导愈伤组织，即使诱导出愈伤组织也全部褐变；多数叶片较难诱导愈伤组织，诱导出的愈伤组织多出现中度褐变；茎部最容易诱导愈伤组织，且组织生长良好。

荔枝茎的愈伤组织中度褐变，而根的愈伤组织全部褐变。

欧洲栗幼年型的材料培养时含醌类物质少，成年型材料培养时含醌类物质多，后者比前者褐变严重。

油棕幼嫩外植体(如胚)培养较少褐变，高度分化的叶片接种后则容易褐变。

1.3培养基成分及培养条件1.3.1无机盐浓度对褐化的影响。

初代培养时，培养基中无机盐浓度影响酚类分泌物的产生。

邱璐等发现，云桑组织培养过程中使用1/2MS培养基，降低无机盐浓度，能有效减轻褐化发生，降低褐变率。

张寒霜等在研究低酚陆地棉胚发生过程中发现，培养基成分中KNO3浓度增加时会引起继代愈伤组织褐化。

孔祥生等也发现，与改良MS培养基相比，使用MS 培养基，提高柿树组织培养中休眠芽的褐变死亡率9倍，分别降低增殖倍数、有效新梢率67%和55%。

1.3.2生长调节物质对褐化的影响。

细胞分裂素BA或KT不仅能促进酚类物质的合成，且能激活PPO的活性，增强酚类物质的氧化能力，从而加剧褐变的发生。

张卫芳等发现，随着培养基中6-BA浓度的升高，组织的褐变率增加，一年生薄壳核桃的茎尖培养中褐变反应时间也随之缩短；添加2，4-D、IAA的组合，褐变反应稍有推迟；较低浓度6-BA适宜茎尖分化生长，褐变反应慢，部分培养基无明显褐变现象。

加入BA，KT后甘蔗组织培养褐变更加明显。

此外，生长调节物质的浓度也会影响植物组织培养的褐变。

在荔枝组织培养的培，4-D+1mg/LBA，愈伤组织比较坚硬，增殖缓慢，易产生褐变，而培养养基中添加0.5mg/L2，4-D+1mg/LBA后，愈伤组织浅黄疏松，增殖也快。

基中添加1mg/L2硬紫草从长期继代培养且次生代谢物含量高引起培养物的褐变。

用B5培养基可有效地防止褐变。

茼蒿用甘露醇或蔗糖作为渗透压调节剂易发生褐变，不能或只能形成少量细胞团用葡萄糖作渗透压调节剂褐变较少，效果好。

柿树ZT 9.13μmol/L、IAA 0.57μmol/L减轻褐变程度。

BA或 KT 提高了褐变甘蔗组织培养中易产生褐变。

荔枝培养基添加1 mg/L6-BA +0.5 mg/L 2,4-D时，愈伤组织较硬、增殖缓慢、易褐变；培养基添加1 mg/ L 6-BA+1 mg/L2,4-D时，愈伤组织浅黄疏松、增殖快[4]。

D.pH值影响材料的褐变大白菜pH值至6.5，很大程度上可抑制褐变。

水稻pH值为4.5 ～5.0时，生长状态良好的，其表面呈黄白色，pH值为5.5 ～ 6.0时，愈伤组织严重褐变。

1.4培养条件不适宜1.4.1温度对褐变的影响。

一定程度的高温能激活PPO活性，促进酚类物质的氧化，加速组织培养的褐化。

在“薄壳香”核桃的组织培养中，刘兰英[14]等将外植体分别在高温(25士2)℃和低温(18士2)℃条件下培养，结果表明，高温条件能够明显促进褐化的发生，低温条件则不是特别明显。

1.4.2光照对植物组织培养褐变的影响。

光照能够促进多种植物组织培养中酚类物质的氧化，加速组织的褐变。

甘蔗胚性细胞在过强的光照(2500lx以上)下，细胞团表面容易褐变，弱光下出现绿色芽点。

光照条件对巨按叶片组织褐化的影响从高到低为：长日照、短日照、漫射光、黑暗。

刺五加腋芽组织培养过程中，暗培养能够有效抑制组织的褐变。

高浓度CO2也会促进褐变，其原因是环境中的CO2向细胞内扩散，使细胞内CO32+增多，产生褐变。

2褐变的机理正常细胞内，区域性分布使底物与PPO不能接触并不发生褐变，当细胞膜的结构发生变化和破坏时，酶和底物就结合在一块，在氧的作用下，生成醌，从而引起褐变。

引起褐变的条件：氧、引起褐变的酶、底物，缺一不可。

引起褐变的酶：多酚氧化酶(PPO是主要的)、过氧化物酶(POD)、、苯丙氨酸解氨酶等。

引起褐变的酶的底物：主要是酚类化合物，可分成3类：第一类是苯基羧酸，包括邻羟基苯酚、儿茶酚、没食子酸、莽草酸等；第二类是苯丙烷衍生物，包括肉桂酸、香豆酸、咖啡酸、单宁、木质素等；第三类是黄烷衍生物，包括花青素、黄酮、芸香苷等。

2.1外植体褐变机理引起外植体培物褐化的因素很多，褐化机理也非常复杂，到目前为之，尚未有统一的机理阐述。

一般认为，褐化是由于酚类物质被多酚氧化酶（PPO）氧化成醌类物质，抑制了相关酶的活性，从而阻碍培养材料的正常生长，甚至导致培养物死亡[2]。

褐化作用按发生机制分为酶促褐化与非酶促褐变。

多数研究认为外植体的褐化属于酶促褐化，机理可通过酚-酚酶的区域性分布与组织褐变和酚-酚酶假说两种假说来诠释。

2.1.1。

酚-酚酶的区域性分布假说由于正常的组织细胞内，多酚类物质与PPO呈区域性分布，多酚类物质分布在液泡内，PPO则分布在各种质体或细胞质内，PPO与底物不能接触。

因此，即使底物、PPO、氧气同时存在，正常发育的植物组织并不发生褐变。

在外植体建立时，切口附近的细胞受到伤害，PPO与底物的分隔被打破，酚类物质外溢。

细胞受到伤害会引起外植体酚类物质外溢的自我保护反应，为防止微生物侵染而诱导植保素或物理屏障的形成。

由于酚类物质非常不稳定，在外溢过程中与多酚氧化酶接触，迅速氧化形成褐色的醌类物质和水，醌类物质又在酪氨酸酶等酶的作用下发生脱水、聚合等反应，形成黑褐色物质，从而引起外植体的褐变。

2.1.2酚-酚酶假说该假说认为褐变过程主要是通过PPO及其底物进行作用的。

PPO作为普遍存在于植物体内的一类末端氧化酶，能够催化酚类物质形成醌和水，醌经过非酶促聚合作用形成深色物质并对外植体材料产生毒害作用，使之死亡。

褐变过程必须具备酶，底物和氧条件。

3.防止褐变的措施3.1 适宜培养基的选择、构建良好的培养条件选择适宜的培养基可以为外植体的快速分化和发育提供良好的营养基础和分化调控机制，保证外植体的正常代谢和分化，抑制组织培养的褐变。

植物不同对于培养基的需求也不相同：桑树茎尖接种于1/2MS(20%)比用MS(60%)时褐化程度轻得多；银杏培养使用MS和比其他培养基褐化程度轻，尤其是MS。

柿培养过程中适当降低无机盐浓度可明显降低褐N6化率，加入ZT和IAA时抗褐化效果明显[17]。

培养基的状态也是影响植物组织培养褐变的因素之一。

在几种不同的培养方式中，褐变程度顺序是：固体培养基>半固体培养基>液体培养基>纸桥培养基。

培养过程中还要注意适宜培养条件的构建。

因为组织培养过程中有许多酶系统参与酚类物质的合成和氧化，其中部分酶系统是光活性的，较强的光照会使酶活性加强，褐变程度加强。

所以可以进行初期的暗培养或者漫射光培养，同时注意降低培养室内的温度。

3.2选择适宜的外植体研究表明，选择合适的外植体并创造最佳的培养条件是克服组织培养褐变的主要途径。

处于生长旺盛期的外植体如芽、茎尖、幼嫩的茎段等，具有较强的分生能力，褐变程度低，是植物组织培养外植体的首选。

同一植物不同品种间的褐化存在明显差异，如牡丹品种金阁、赛雪塔、金阳与其他品种相比褐化程度比较轻[20]。

取材时间也会对褐变产生影响。

金冠苹果外植体褐变率在年周期中呈钟形变化曲线：生长季节（4-10月）达到褐变高峰，生长初期(2-3月)和生长末期(11-12月) 褐变率较低，休眠季节(12—2月) 褐变率最低。

因此选择适当时机取材可有效防止外植体褐变。

3.3 培养基中加入抗褐化剂、吸附剂抗氧化剂和其他抑制剂可有效抑制酶促的外植体褐变。

Vc是多羟基还原物质，一方面可以使多酚氧化酶失活而阻止酚类物质氧化；另一方面Vc在酶催化下能消耗溶解氧，使酚类物质因缺氧而无法氧化。

因此培养基中加入Vc能够有效的防止褐变。

研究表明抗氧化剂的类型及浓度在抑制银杏愈伤组织褐化中起关键作用[22]。

活性炭与Vc配合使用可有效地防止香蕉茎尖培养外植体的褐变[23]。

在继代培养培养基中添加0.1mg/LVc时，能有效减少愈伤组织褐变。

活性炭是一种可以吸附培养物分泌的酚、醌等有害物质的吸附剂，能有效地降低褐变。

培养基中添加AC0.5—1g/L和胰蛋白胨0.5—1g/L，能够降低褐变率[。