高效液相色谱使用方法
高效液相色谱仪操作说明书
高效液相色谱仪操作说明书一、引言高效液相色谱仪（HPLC）是一种广泛应用于化学、生物医药、环境监测等领域的分析仪器。
本操作说明书旨在帮助用户正确有效地操作HPLC仪器，以获得准确可靠的分析结果。
二、仪器概述1. 主要组成：HPLC仪器主要包括进样系统、色谱柱、流动相装置、检测器及数据分析系统等组成部分。
2. 基本原理：HPLC利用流动相在高压下通过色谱柱，样品分离后再由检测器进行检测和信号记录，通过数据分析系统生成分离效果图谱或定量结果。
三、操作步骤1. 准备工作a) 确保仪器电源已接通，并检查各部分连接是否牢固。
b) 打开相关软件并进行系统初始化。
c) 根据待分析样品的特性，选择适宜的色谱柱和流动相。
2. 进样系统操作a) 将待测样品通过合适的方法制备成溶液。
b) 打开进样系统的相关开关，将样品通过进样针注入进样口。
c) 调整进样量和进样速度，确保样品完全被进样器吸取。
3. 色谱柱操作a) 将色谱柱连接到系统中，并确保连接处密封良好。
b) 根据样品性质选择合适的流动相和梯度条件，设置柱温以提高分离效果。
c) 在柱前和柱后设置适当的减压阀，调节流量和压力，确保色谱柱正常运行。
4. 流动相装置操作a) 根据检测要求准备合适的流动相溶液。
b) 将流动相溶液通过流动相装置输送至色谱柱，确保流速和流量稳定。
5. 检测器操作a) 打开检测器并进行相关参数设置，如波长选择、灵敏度调节等。
b) 将流经色谱柱的样品原液通过检测器进行检测，并记录信号。
6. 数据分析与结果生成a) 使用相应的数据分析软件，导入检测到的信号数据。
b) 根据需求进行峰面积积分、峰高浓度定量等相关数据分析。
c) 生成分析图谱或报告，并保存结果。
四、故障排除在操作过程中，可能会遇到一些故障情况，以下列举一些常见故障及其排除方法：1. 柱堵塞：检查柱前和柱后的减压阀是否打开和调整流量。
2. 波峰异常：检查流动相和检测器参数设置是否正确。
3. 信号丢失：检查进样系统是否正常工作，检查柱连接是否存在泄漏。
hplc高效液相色谱仪使用方法
hplc高效液相色谱仪使用方法HPLC高效液相色谱仪是一种常用的色谱分析仪器，广泛应用于药物、环境、食品、化妆品等领域。
下面将详细介绍HPLC高效液相色谱仪的使用方法。
一、仪器准备：1.检查仪器的状态，确认各个部件是否正常运行，如高压泵、进样器、检测器等。
2.开机预热：打开主机电源，按照仪器操作手册上的指示，进行仪器的预热操作。
一般要求预热时间为30分钟到1小时。
二、工作站设置：1.打开工作站软件，点击新建分析方法。
根据分析需求选择不同的方法类型，如梯度洗脱、等温洗脱等。
2.设置流动相组成：根据分析物的性质和目标，选择合适的流动相，并设置其浓度和比例。
可以通过试错法或者文献参考来确定最佳流动相组成。
3.设置进样器参数：选择合适的进样方式，如全自动进样、微量进样等。
设置进样量和进样速度，根据分析物的浓度、检测器灵敏度等因素进行调整。
4.设置检测器参数：选择合适的检测器类型和波长。
一般情况下，紫外检测器是最常用的检测器，波长选择通常在200-400nm之间。
5.设置柱温：根据分析物的性质和目标，选择合适的柱温。
柱温对分离性能和分析速度有着明显的影响。
三、样品处理：1.样品制备：根据分析目标和方法要求，对样品进行处理，包括固相萃取、溶解、过滤等。
2.进样器设置：将样品注入进样器，确保进样量与方法要求相符。
3.进样：点击工作站软件上的进样按钮，开始进行进样。
进样过程中要确保无气泡进入柱。
四、开展分析：1.开始分析：点击工作站软件上的开始按钮，运行分析方法。
监控色谱图，观察峰的形状和分离度。
根据需要可以对分析方法进行优化，如调整流速、洗脱程序等。
2.数据处理：完成分析后，保存并导出色谱图和数据。
进行数据处理和结果分析。
五、仪器维护：1.使用完毕后，关闭泵和检测器，将柱中流动相完全排空，以免柱内残留物引起污染。
2.保养柱：每次使用后，要清洗柱和重新平衡柱。
柱的清洗和保养要根据具体的柱类型和使用情况进行。
3.保持仪器干燥和清洁：定期清洁仪器，尤其是注射器、透射比色噪声汇丰牌等易受污染的部件，以保证仪器的正常运行。
高效液相色谱仪的操作步骤 液相色谱解决方案
高效液相色谱仪的操作步骤液相色谱解决方案高效液相色谱仪操作步骤：1）．过滤流动相，依据需要选择不同的滤膜.2）．对抽滤后的流动相进行超声脱气10—20分钟。
3）．打开hplc工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。
4）．进入hplc掌控界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。
5）．有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。
冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。
冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10 ml/min。
6）．调整流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000、点击injure，选用合适的流速，点击on，走基线，察看基线的情况。
7）．设计走样方法。
点击file，选取se—lect users and methods，可以选取现有的各种走样方法。
若需建立一个新的方法，点击new method。
选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，依据需要而不同。
选完后，点击protocol。
一个完整的走样方法需要包括：a.进样前的稳流，一般2—5分钟；b.基线归零；c.进样阀的loading—inject转换；d.走样时间，随不同的样品而不同。
8）．进样和进样后操作。
选定走样方法，点击start。
进样，全部的样品均需过滤。
方法走完后，点击postrun，可记录数据和做标记等。
全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。
9）．关机时，先关计算机，再关液相色谱。
10）．填写登记本，由负责人签字。
注意事项：11）．流动相均需色谱纯度，水用20m的去离子水。
脱气后的流动相要当心振动尽量不引起气泡。
12）．柱子是特别脆弱的，第一次做的方法，先不要让液体过柱子。
13）．全部过柱子的液体均需严格的过滤。
14）．压力不能太大，可以不要超过2000 psi。
液相色谱流动相说明流动相相当于液相的血液，可以想象对液相的紧要程度。
高效液相色谱仪使用说明
高效液相色谱仪使用说明1.准备工作-确保仪器处于良好的工作状态，包括液相泵、进样器、检测器等。
-检查液相系统的压力，确保其正常运转，防止发生泄漏。
-配制样品溶液，根据实验要求合理选择溶剂，并进行适当的预处理（如过滤、稀释等）。
2.仪器开机-打开HPLC主机电源，并等待其自检完成。
-检查HPLC控制软件是否正常运行，确保能够与仪器进行连接。
-点击仪器上的电源按钮，启动液相泵和检测器。
3.参数设置-在HPLC控制软件上设置分离柱类型、柱温、流速、梯度时间等参数，根据具体分析需求进行调整。
-设置进样器类型、进样量、进样方式等参数。
对于自动进样器，可以根据需求选择自动取样量和进样模式（如全自动、自动稀释等）。
4.样品进样-将样品注射器浸入样品溶液中，吸取适量的溶液。
-将注射器插入进样器，并按照设定的参数进行进样。
-如果使用自动进样器，将样品放置在样品托盘上，设置好进样量和进样模式，然后启动自动进样程序。
5.进行分离-点击HPLC控制软件上的“运行”按钮，启动色谱分离程序。
-观察检测器的信号和色谱图，确保分离效果良好。
-如有需要，可以对实时结果进行记录，以便后续的数据分析和处理。
6.清洗仪器-在实验结束后，关闭色谱柱，避免柱材料干燥堵塞。
-关闭液相泵和检测器，将废液排空。
-按照要求进行液相系统的清洗和保养，包括冲洗柱子、清洗进样器、检测器等。
7.数据处理-将HPLC分析得到的数据导出到计算机中。
-使用相关的数据处理软件进行数据处理和分析，如峰面积计算、定量分析、质谱图的解释等。
-如有需要，可以生成报告或结果图表，以备后续参考。
注意事项：-严格按照操作规程操作仪器，避免操作失误导致意外事故和数据异常。
-定期维护和保养仪器，确保其长期有效运行。
-注意安全使用有毒、易燃、易爆的溶剂和试剂，如有需要应采取相应的安全措施。
-遵守实验室规章制度，切勿滥用仪器，保证仪器的正常使用和他人使用的权益。
总结起来，高效液相色谱仪的使用说明主要包括准备工作、仪器开机、参数设置、样品进样、分离操作、仪器清洗和数据处理。
高效液相色谱的使用流程
高效液相色谱的使用流程简介高效液相色谱（High-Performance Liquid Chromatography，简称HPLC）是一种用于分离、鉴定和定量化分析化学物质的常用技术。
本文将介绍高效液相色谱的使用流程。
使用流程1.准备工作–检查仪器：确保HPLC仪器处于正常工作状态，检查进样器、流动相泵、柱温箱和检测器等部件。
–准备试剂：根据需要，准备好所需的溶剂、标样溶液和样品溶液，并确保它们纯净、稳定且符合实验要求。
–校准仪器：进行必要的仪器校准，包括流速校准、进样器校准和检测器校准等。
2.设置分离条件–选择合适的柱：根据需要选择合适的固定相柱，例如反相柱、离子交换柱或手性柱等。
–设置流速：根据柱的要求和分离物的性质，设置合适的流速，一般为0.5-2.0 mL/min。
–选择合适的流动相：根据待分离物的性质，选择合适的流动相体系，包括溶剂和缓冲液等。
–设置柱温：根据实验要求和分离物的性质，设置适当的柱温，一般常温即可。
–设置检测器：选择合适的检测器，如紫外检测器、荧光检测器或质谱检测器，根据需要设置检测器的波长、激发波长等参数。
3.进样与分析–进样方式：根据需求和样品性质，选择适合的进样方式，包括自动进样器、手动进样器或固相萃取柱等。
–进样量：根据样品的浓度和分析要求，设置合适的进样量，一般范围为1-20 μL。
–开始分析：点击软件界面上的“开始”按钮，启动HPLC运行，此时仪器开始运行，进行样品分离和检测。
–数据记录：在分离过程中，系统会实时记录和显示数据，包括峰面积、保留时间和峰高等结果。
4.数据分析与解读–峰面积计算：根据检测器记录的峰面积数据，通过内置的计算公式，计算出目标化合物的峰面积。
–保留时间测定：根据检测器记录的保留时间数据，可以获得目标化合物的保留时间，用于鉴定和定量分析。
–峰高测定：根据峰高数据，可以了解化合物的峰高大小，用于比较不同样品或条件下的分离结果。
–结果解读：根据数据分析结果，判断样品中所含化合物种类和含量，并与已知标准进行对比验证。
高效液相色谱的使用方法
高效液相色谱的使用方法高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种用于分离、分析和测定混合物中组分的技术。
以下是高效液相色谱的使用方法：1. 样品制备：根据需要，样品可以通过溶解、浸提、纯化等方法进行前处理。
确保样品是均匀的，并且符合HPLC分析要求。
2. 选择合适的色谱柱：根据分析目标，选择合适的色谱柱，包括固定相（C18、C8、氨基、芳基等）和柱型（反相、离子交换、排除等）。
色谱柱质量对分离和分析结果至关重要。
3. 准备移动相：根据色谱柱要求和分析目标，选择合适的移动相。
移动相通常由溶剂和缓冲液组成，可以通过改变溶剂的组成和比例来调节色谱条件。
4. 设定色谱条件：根据需要，设定合适的色谱条件，包括流动相速度、柱温、检测波长等。
这些条件将直接影响分离的效果和分析的准确性。
5. 校准仪器：在开始分析之前，校准色谱仪和检测器，确保其准确性和稳定性。
校准通常包括检测器灵敏度、波长、流速等参数。
6. 注样和运行：将样品注入色谱柱，启动色谱仪，使移动相通过柱子，分离出样品中的各组分。
根据需要，通过改变运行时间、流速等参数，调节分离和分析的效果。
7. 数据分析：通过检测器检测样品中各组分的吸光度或荧光强度，并记录数据。
可以使用特定的色谱软件对数据进行处理和解析，以获得准确的分析结果。
8. 数据解释：根据分析结果，对样品中的各组分进行定量或定性的解释。
可以使用标准品进行定量分析，或者与已知数据进行比对，以确认各组分的身份和浓度。
9. 清洗和维护：在完成分析后，及时清洗色谱柱和仪器，以保持其性能和寿命。
根据需要，使用适当的溶剂进行清洗，并使仪器处于良好的工作状态。
总之，高效液相色谱的使用方法包括样品制备、色谱柱选择、移动相准备、色谱条件设定、校准仪器、注样和运行、数据分析、数据解释以及清洗和维护等步骤。
熟练掌握这些方法能够有效地进行高效液相色谱的分离和分析。
高效液相色谱仪操作步骤(精)
本文由北京SEO整理发布高效液相色谱仪操作步骤：1)．过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜(0.45um)。
2)．对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。
3)．打开HPLC工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。
4)．进入HPLC控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。
5)．有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。
冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。
冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10 ml/min。
6)．调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000。
点击injure，选用合适的流速，点击on，走基线，观察基线的情况。
7)．设计走样方法。
点击file，选取select users and methods，可以选取现有的各种走样方法。
若需建立一个新的方法，点击new method。
选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。
选完后，点击protocol。
一个完整的走样方法需要包括：a.进样前的稳流，一般2-5分钟；b.基线归零；c.进样阀的loading-inject转换；d.走样时间，随不同的样品而不同。
8)．进样和进样后操作。
选定走样方法，点击start。
进样，所有的样品均需过滤。
方法走完后，点击postrun，可记录数据和做标记等。
全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。
9)．关机时，先关计算机，再关液相色谱。
10)．填写登记本，由负责人签字。
注意事项：1)．流动相均需色谱纯度，水用20M的去离子水。
脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。
2)．柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要让液体过柱子。
3)．所有过柱子的液体均需严格的过滤。
4)．压力不能太大，最好不要超过2000 psi。
液相色谱法简介【我要发表论文】--------------------------------------------------------------------------------作者：dujinx正文气相色谱不能由色谱图直接给出未知物的定性结果，而必须由已知标准作对照定性。
高效液相色谱仪的操作步骤及注意事项
高效液相色谱仪的操作步骤及注意事项一、操作步骤：1.开机前先将流动相过滤和超声：水流动相用混合滤膜（0.2μm）过滤,有机流动相用有机滤膜过滤，之后超声脱气15-20分钟。
（过滤的目的是除去流动相里的杂质，以免杂质进入色谱柱堵塞色谱柱；超声的目的是排除流动相里面的气体，以防气体进入色谱柱损害色谱柱，影响柱效能）注：试验过程中由于只有0.45μm的混合滤膜，第一次使用时感觉效果不好，于是过滤水时同时使用两张混合滤膜过滤水流动相。
2.超声结束后，将流动相放置到规定位置（1号泵接水流动相，2号泵接有机流动相），开机逐个排气（先启动泵，排气结束后再打开检测器）。
3.排气结束后，关闭所有排气阀。
先用纯有机流动相冲洗色谱柱20-30分钟，基线走稳之后，再打开水流动相（注意：水流动相和有机流动相流速之和为1ml/min），继续走基线，直到基线平稳。
注意：实验结束后，再用纯有机流动相冲洗色谱柱20-30分钟，冲出色谱柱内残留的样品物质，预防长时间不使用仪器样品的残留物质沉积在色谱柱内，导致下次使用难以冲出，色谱柱柱压偏高，基线不稳，出现大量鬼峰。
（不同规格的色谱柱其所允许的最大流速之和不同）4.走基线时，应将进样阀处于Load状态，用注射器进样时应快速进样，进样后将进样阀立即扳回到Inject状态，此时液相系统开始进入采样状态。
采样结束后，可在数据分析里面查看分析结果并可进行编辑，也可以在脱机状态下查看样品的分析结果并编辑。
二、使用中常见的问题及注意事项1.过滤时有时会出现流动相漏液。
可能的原因是滤膜放置不正确（有点偏）和接头有点错位，导致流动相从缝隙中漏出。
注意：操作时，应先向滤瓶内倒入少量流动相，观察是否漏液并开始过滤，若未漏液，再向滤瓶中添加流动相。
2.超声时，瓶外液体的液面应高于瓶内流动相的液面，否则流动相内的气体可能无法排出液体，气体仍然残留在流动相内，以致开机排气时无气泡排出。
3.开机排气结束后，应先将流动相流量调小，再关闭排气阀，否则会导致柱压瞬间升高超过压力上限，致使泵停止工作。
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高效液相色谱使用方法
一、流动相准备
将流动相按比例混合，注意混合的流动相必须相互溶解，最好能将流动相混合在一起，若相互溶解性不好，可分成两种。
流动相配好后，将管路放入，注意不要将瓶口密封。
二、开机
首先将真空泵打开，待泵的指示灯由黄变绿打；
打开600泵开关，按Direct键，进入操作菜单。
三、抽气
抽取管路A液体：先将注射器旋转插入，将旋钮由Run转至 Draw,抽液，完成后将旋钮由Draw至Run，再将注射器旋转取下，反复1-2次，抽至管路内无气泡。
抽取管路B液体：在泵操作菜单上将B设为100%，给0.2ml/min的流速，听到泵转换的声音后，将流速设为0，以抽取管路A的步骤进行抽气。
四、调节流动相比例与流速
在泵操作菜单上设定流动相比例，并以0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml/min的速度逐步升高流速，每次间隔3-5分钟。
五、2410示差检测器的使用
1、打开2410示差检测器开关
2、调整检测器内、外温度
3、实验前一天晚上，使用“purge”状态平衡过夜，若第二天还要做实验，结束工作后不关机，节省第二天的平衡时间，保持0.2ml/min的流速。
六、2487紫外检测器的使用
1、打开2487示差检测器开关，机器自动进入自检过程，约需7分钟。
2、设置检测波长
3、预热30分钟左右，即可注样测定。
试验四、番茄内源激素高效液相色谱法测定
一、样品准备
取新鲜番茄根、茎、叶5克左右，液氮冷冻，放入冰箱储存。
配80％甲醇，冰箱冷冻。
二、提取
样品放入预冷研钵，加l0ml 80％的冰冻甲醇研磨至匀浆，转入小烧杯中，再用甲醇清洗研钵2次，每次l0ml，转入小烧杯中。
小烧杯放入冰箱(0～4℃)冷藏14小时以上。
三、过滤
取出用漏斗滤纸过滤，并用10m180％甲醇清洗残渣，合并滤液；如果提取液中沉淀物或色素多，则用10000g离心l0~12min，上清液转入冻干瓶中。
四、浓缩
将冻干瓶中的液体用减压蒸干机蒸干(至瓶中液体结冰)，然后用2m1 80％的甲醇冲洗，如果有浑浊物，再次用离心机12000g离心l0min，倒入带有刻度的试管中，为保证试管中的液体有5ml左右，将不足5ml的试管中再加入一些甲醇。
五、萃取
提取液中加入等量石油醚萃取，用力振荡，待静止分层后，用胶头滴管吸取上层液体弃去，此过程反复进行，直至醚层不再有颜色。
六、过柱纯化
萃取脱色后液体吸入针管，通过C18小柱滤除色素，用1~2m1甲醇清洗小柱一次，若滤出色素，将液体吸回，用新小柱重新滤一次（小柱使用前要用甲醇浸泡，用后再用甲醇反复冲洗，再浸泡）。
七、二次浓缩
液体转入蒸发皿中，60℃蒸干，用lml甲醇洗脱。
八、过滤
0．45um滤膜过滤，滤液收集到小瓶中，冷冻待测定。
九、测定与计算
用标样做标准曲线，分别为10，50，100，200，500mg／ml。
进样量为20ul。
测定条件：流速为lml／min，柱温设定为35℃，测定波长为260nm，流动相甲醇：3％乙醇＝45：55
计算：通过曲线计算样品中激素浓度。
试验五、葡萄糖、果糖、蔗糖含量的HPLC测定
一、取样
称取样品（番茄(甜瓜)果肉重1～2 g、叶肉（无大叶脉）2g）→置于试管（带玻璃试管塞）→倒入80％乙醇，浸没样品约1cm→80℃水浴1h→冷却后封存。
二、提取
倒出乙醇提取液入25ml容量瓶→再向试管中加入80％乙醇，80℃水浴1h，如此反复提取次→合并提取液后定容
三、浓缩
取10-25ml溶液，加入蒸发皿中，放置在水溶锅上蒸干备用。
四、过滤
用1ml超纯水将蒸发皿中的糖全部溶解，吸入1ml注射器，过0.45μm滤膜。
若样品色素较多，需通过C18小柱进行脱色，然后再过滤。
C18小柱使用方法：
C18柱：甲醇（5ml）-----乙醚（5ml）-------80%乙醇（5ml）-----样品--------80%乙醇（样品量的二倍）------乙醚-------80%乙醇-----样品--------80%乙醇
五、HPLC测定
测定方法及色谱条件为：Water 600E高效液相色谱，碳水化合物柱，柱温30-35℃，2410示差检测器，流动相比例为75％乙腈：25％超纯水，流速为1.0ml min-1,Water Millennium软件控制及数据处理。
试验六：蔗糖代谢酶的测定
一、试剂的配置（先溶解、快到1升时调PH值）
1、50m M HePes—NaOH(PH7.5)缓冲液体系配置(1升)
50 m M HePes：11.9150g
NaCl:16.0 g
kCl::0.74
Na2HPO4.12H2O:0.543
葡萄糖：2
1m M EDTA:0.3722
10 m M MgCl:2.0330
2.5 m M DTT :0.3856 ()
10 m M Vc 1.7614
2 、PVPP:固体
3、0.1M NaHPO4-柠檬酸（PH4.8）
0.2M NaHPO4（35.8/500ml 9.86ml ）
0.1M柠檬酸(21.01g/L 10.14ml )
4、0.1M NaHPO4-柠檬酸PH：7.2
0.2M NaHPO4 17.39 ml
0.1M柠檬酸 2.61 ml
5、0.1M蔗糖：3.4229g定容至100 ml
6、2N NaOH:8g NaOH定容至100 ml
7、30%HCl:39.5ml浓HCL加入到10.5 ml 水中
8、0.1%间苯二酚：95%乙醇+0.1 g 间苯二酚定容至100 ml
9、0.05M F-6-P
0.2020g F-6-P+5 ml0.1 N HCl + 数滴10%K2SO4至白色沉淀不在形成，10000g离心10分钟，弃沉淀，上清夜+1N NaOH调PH=7.0 10 ml
10、UDPG：0.205g/25ml
11、Tris:0.1M ,仅是Tris，无盐酸
12、5 nM MgCl2
13、0.1N HCl:0.862 ml HC定容至100 ml
14、0.05M 果糖。
15、DNS试剂
将6.3 gDNS和262ml 2 M NaOH溶液，加到500 ml含有185g酒石酸钾钠的热水混液中，在加5g 结晶酚和5g 亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000 ml，贮于棕色瓶中备用。
二、样品测定
.1g样品冰浴研磨(加少量石英沙) 匀浆四层纱
+ 0.5g pvpp + 3mlHePES + 3mlHEPES + 4mlHepes
布过滤12000g(4℃) 弃沉淀上清夜+6.0g硫酸铵(放置15分钟)
20分钟
使之完全溶解12000g(4℃) 弃上清夜 3mlHepes溶解沉淀移到透析
20分钟
袋中用稀释10倍的Hepes(不含pvpp )4℃培养箱中透析20小时(以上操作均在
0～4℃下进行)
㈠、酸性,中性转化酶的测定(μmol Glucos e·h-1·g-1FW)
⒈①酸性转化酶
0.6ml(0.1M Na2HPO4柠檬酸PH4.8 + 0.2ml(0.1M蔗糖) + 0.2ml酶提取液(透析后的)
②中性转化酶
0.6ml(0.1M K2HPO4柠檬酸PH7.2 + 0.2ml(0.1M蔗糖) + 0.2ml酶提取液(透析后的)
⒉总体积为1ml(放在小离心管中)
37℃孵育30分钟后转到试管中+1ml蒸馏水+1.5ml 3,5-二硝基水杨酸（DNS）
空白2ml蒸馏水
沸水浴5分钟流水冷却每管中加21。
5ml蒸馏水520nm比色。
㈡、蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶的活性测定(μmol Sucros e·h-1·g-1FW)
⒈①蔗糖合成酶
0.1ml(0.05M F6P)+0.1ml(0.0082 g/ml UDPG)+0.1ml(0.1M Tris)+0。
1ml(5mM MgCl2)+0.2ml酶液
②蔗糖磷酸合成酶
0.1ml(0.05M F6P)+0.1ml UDPG+0.1ml(0.1M Tris)+0。
1ml(5mM MgCl2)+0.2ml酶液
⒉上述反应在37℃保温30分钟 100℃水浴1分钟定容至1ml
调零1ml蒸馏水
+0.1ml(2N NaOH) 沸水浴10分钟流水冷却转到试管中+3.5ml(30%HCl)
+1ml(0.1%间苯二酚)（用95%乙醇溶液）摇匀80℃水浴10分钟流水冷却480nm比色
蔗糖标准曲线配制
每支试管中+0.1ml(2N NaOH) 沸水浴10分钟流水冷却+3.5ml(30% HCl) 1ml(0.1%间苯二酚) 摇匀80℃水浴10分钟流水冷却540nm比色。