病毒保存液和细胞保存液的区别
新冠病毒是如何用病毒保存液进行过程保存的
病毒保存液在核酸标本保存过程中起到了什么作用？核酸检测假阳性、假阴性的问题一直是专家们的心头病，而核酸标本的采集和保存成为影响检测结果的重中之重，很多专家从实践工作中总结出的经验认为，鼻咽拭子标本2019-nCoV核酸检测阳性率高于口咽拭子，下呼吸道采集的痰、肺泡灌洗液标本阳性率高于上呼吸道的口、鼻咽拭子采集的标本，为了提高检测阳性率，建议采集同一病人多部位标本，合并进行检测，下面我们来看看标本在采集、运输、保存过程中应该注意哪些问题。
口、咽拭子采集注意事项1.不要从鼻孔或扁桃体上采样2.不建议雾化导痰3. 下呼吸道标本（相对于上呼吸道标本）更可能呈阳性4.对于怀疑患感染新型冠状病毒的患者，特别是肺炎或严重疾病的患者，单个上呼吸道标本不能排除诊断，建议增加上呼吸道和下呼吸道标本。
病毒保存液标本采集方法：用于2019-nCoV核酸检测标本主要是口咽拭子，采集时让患者张大嘴后用特制棉签或小刷头刮取其咽部采集带病毒标本。
如果平时医护人员咽拭子取样不多，刮取标本时患者的反应又比较大，往往导致刮取标本的位置不对，或力度和时间不够，没有刮取到带病毒的标本或刮取到的带病毒标本量少，最后导致检测结果阴性。
标本运输及保存条件:2019-nCoV为RNA病毒，很容易被外源性或细胞破坏后所释放的RNA酶降解，而影响最后的检测效率。
严格来讲标本采集后应及时送到实验室（疾控中心、医院检验科、第三方实验室），尽快完成检测。
标本在常温条件下放置时间过长，也可能是造成最后检测结果假阴性的原因，如果因为特殊需要需要长时间保存的话，可以用病毒保存液来保存RNA病毒样本，此外还可以使用防止病毒核酸降解的标本采集管，但目前此类产品数量少、成本高、实际应用效果也需要进一步评价。
总的来说，标本采集后应及时送检，及时检测，如因某些原因标本采集后不能及时送检或及时检测，应将采样后的拭子放入病毒保存液中,病毒保存液是病毒采样管内添加的用于保护病毒样本的保护性液体！。
病毒毒价的测定
1.病毒毒价的测定（微量法）(1) 病毒的制备将病毒接种于单层细胞，37℃吸附1h后加入维持液，置温箱培养；逐日观察，待细胞病变（CPE）达75%以上，收获病毒悬液冻融或超声波处理，以3 000r/min离心10min，取上清液，定量分装成1ml小瓶置-70℃保存备用，选用的病毒必须是对细胞有较稳定的致病力。
(2) 病毒毒价测定取置-70℃冰箱保存的病毒一瓶，将病毒在96孔培养板上作10倍递进稀释即10-1，10-2，10-11……，每孔病毒悬液量为50μl，每个稀释度作8孔，每孔加入100细胞悬液，每块板的最后一行设8孔细胞对照，制备细胞悬液的浓度以使细胞在24h内长满单层为度。
把培养板置5%CO2温箱37℃培养，从48-14h逐日观察细胞病变，记录结果。
按Reed和Muench两氏法计算TCID50。
56%-50%距离比例 = ────────56%-33%本例高于50%病毒稀释度的对数为－6，距离比例为0.26，稀释系数的对数为－1。
IgTCID50 = －6＋0.26×(－1)= －6.3则TCID50=10-6.3，50即病毒作10-6.3稀释，每孔接种50μl，可使半数组织细胞管发生病变。
2.中和试验(1) 血清的处理动物血清中，含有多种蛋白质成分对抗体中和病毒有辅助作用，如补体、免疫球蛋白和抗补体抗体等。
为排除这些不耐热的非特异性反应因素，用于中和试验的血清须经加热灭活处理。
各种不同来源的血清，须采用不同温度处理，猪、牛、猴、猫及小鼠血清为60℃；水牛、狗及地鼠血清为62℃；马兔血清为65℃；人和豚鼠血清为56℃。
加热时间为20-30min，60℃以上加热时，为防止蛋白质凝固，应先以生理盐水作适当稀释。
(2) 稀释血清取已灭活处理的血清，在96孔微量细胞培养板上，用稀释液作一系列倍比稀释，使其稀释度分别为原血清的1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64，每孔含量为50μl，每个稀释度作4孔。
细胞培养的四个步骤
细胞培养的四个步骤细胞是组成生物体的基本单位，生物体由各种类型的细胞组成。
在显微镜下不同的细胞有不同的形态。
利用免疫荧光、流式荧光标记、免疫组化都能进行细胞观察。
培养细胞的最终目的：拿到细胞进行后续的下游实验WB、ELISA等蛋白检测DNA、RNA等分子检测凋亡、增殖、周期等功能检测原代细胞培养、冻存等细胞实验细胞培养几乎是所有细胞生物学实验的基础，细胞养得好，实验没烦恼！原代细胞培养，细胞的传代，冻存、复苏，细胞污染的防与治，我们的经验都在这篇文章里！一、细胞培养相关设备和试剂1、细胞培养的相关设备生物安全柜的安全保护等级>超净工作台，当涉及到病毒，需要使用生物安全柜。
生物安全柜：对柜内外的安全保护超净工作台：对工作台内部的安全保护超净工作台/生物安全柜的工作流程：2、细胞培养用相关试剂①培养基作用：人工模拟细胞体内生长的营养环境，维持细胞生长的营养物质，提供细胞营养和促进细胞生长增殖的物质基础。
不完全培养基：直接购买或者配置的培养基。
完全培养基：不完全培养基+血清（提供营养物质）+双抗（保证无菌环境）+其他。
由于细胞种类和培养条件不同，适宜的合成细胞培养基也不同，在动物细胞培养中最常用基础细胞培养基有6～7种，如BME、MEM、DMEM、HAMF12、RPMI1640、199等。
②血清血清的功能：生长、分化必须的物质：生长因子、激素、基础培养基中没有的微量物质、小分子营养物转运维生素、脂类、金属离子和微量元素等；促进细胞贴壁、铺展；毒素灭活，蛋白质与有毒金属和热源物质结合；提供蛋白酶抑制剂；起酸碱度缓冲液作用。
血清的分类最常用的是胎牛血清。
胎牛还未接触外界，免疫系统激活最少，血清中所含的抗体、补体等对外来物质排斥最小，对细胞有害的成分最少。
③胰酶常用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA胰酶：胰脏中分离，选择性的水解蛋白质中有赖氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽链，最佳作用温度37℃，PH=8.0，常用浓度0.1%—0.25%，一般用不含Ca2+、Mg2+的平衡盐缓冲液配制（PBS或Hanks），可用含有血清培养基终止胰酶对细胞的作用（观察细胞的剥离状态确定终止时间）。
病毒保存液出现的红色对检测结果有影响吗
病毒保存液用酚红还是甲基红样本保存液或病毒保存液是病毒采样管里添加的用于采集病毒样本的溶液，有无色的灭活型保存液和有色的非灭活型保存液。
非灭活保存液之所以有颜色是因为其中含有有颜色的成分，那么它用的是用的酚红还是甲基红呢？
非灭活型病毒保存液与灭活型不同，它不需要对样本中的病毒进行灭活，相反它还有尽可能让病毒在采样管的保存液中存活时间增长，这样有利于保证病毒的完整性状，以便提高后续的核酸检测准确率或用于其它研究实验。
非灭活病毒保存液添加酚红
而病毒在采样管中是无法直接存活的，需寄生在细胞内，因此非灭活病毒保存液中含有Hank’s液基础，相当于细胞保存液的成分，可以延长病毒及其宿主细胞的存活时间。
保存液
显红色是因为Hank’s液基础中含有酚红，而并非是甲基红。
酚红在保存液中被作为pH值指示剂，在酸性时显黄色，中性时显红色，碱性时显紫色。
这一类与常见的指示剂类似，如无色酚酞碱性时变红，溴酚蓝（常做电泳指示染料）在pH 3.0~4.6范围颜色由黄变蓝。
酚红可以模拟固醇类激素的作用（特别是雌激素），为避免固醇类反应，哺乳动物的细胞保存液中不添加酚红。
甲基红也是一种酸碱指示剂，pH变色范围4.4（红）～6.2（黄），但水溶性差，在乙醇中长时间保存灵敏度降低，一般用于原生动物活体染色。
而酚红显红色也可以指示病毒保存液pH接近7（中性）则比较适合。
酚红在非灭活病毒保存液中主要作用还是作为pH指示剂，并不是一个必须添加的成分，因此根据不同厂家需要。
病毒保存液和细胞保存液的区别
病毒保存液和细胞保存液的区别一、病毒保存液病毒保存液适用于新型冠状病毒、流感病毒、手足口病毒等常见病毒样本采集保存运输工作，是采样管内浸末采样拭子病毒样本一种保护病毒的被检测物质的液体，可采集咽拭子、鼻拭子或特定部位组织样本,储存的样本可用于后续的核酸提取或纯化等临床实验。
通常分为两种，一种是非灭活型，能够保护病毒的蛋白和核酸，另一种是灭活型，通常含有灭活病毒的裂解盐，裂解蛋白而保护核酸。
1、灭活型：添加有裂解盐的病毒保存液就是灭活型的病毒保存液，里面含有的Tris、裂解盐、EDTA等主要目的是裂解核酸而释放出核酸，从而通过后续的实时荧光RT-PCR进行核酸检测，以此判断样本是否含有病毒特征核酸，即是否感染病毒。
核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两类，是生命的最基本物质之一。
病毒结构单一，就只含有一种核酸和蛋白质，因此检测出特征核酸就检测除了病毒。
病毒属于寄生生物，采样后体外无法存活，如果不能及时检测，就需要放入病毒保存液中。
为了保护病毒检测环境的安全性，就需要加入裂解盐来灭活病毒，释放出可以被检测的核酸即可。
2、非灭活型：除了灭活型的病毒保存液，德晟研发生产的还有非灭活型病毒保存液，不含裂解盐，但是保存的病毒完整性更好，检出率更高，除了核酸检测外还可以用于其他研究。
灭活型病毒保存液则使用上更安全，操作环境要求也不用那么严格，各有各的优势，目前研究的非灭活病毒保存液的成分主要为Hank's液基础，在Hank's液基础之上，德晟还添加了诸如庆大霉素、真菌抗生素、BSA（牛血清白蛋白第五组分）、生物缓冲剂HEPES、氨基酸、冷冻保护剂、甘油等多种组分：3、病毒样本采集方法：a .鼻拭子：将1根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。
取另一根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子以同样的方法釆集另一侧鼻孔。
上述两根拭子浸入同一含3成釆样液的管中，尾部弃去，旋紧管盖。
病毒学检验
病毒的特点是：1、形体微小，能通过细菌滤器，用电子显微镜才能观察到。
2、无细胞结构，其主要成分是核酸和蛋白质3、每种病毒只含有一种类型的核酸（RNA或DNA）4、因缺乏完整的酶系统和能源，故只能寄生于活细胞内，依靠宿主细胞的代谢系统合成蛋白质和核酸5、病毒以其基因为模板，在宿主细胞内复制出新的病毒颗粒6、为了在生物界保存其种属，病毒具备从一个宿主转移到另一个宿主的能力，并具有对敏感宿主的侵染性和复制性7、在宿主体外，能以大分子状态存在，并可长期保持其侵染能力8、有些病毒的核酸能整合到宿主细胞的基因组中，并能诱发潜伏感染细胞培养技术：是对由组织分散成的单个细胞或某一型细胞群进行的体外培养方法，即模拟体内的生理环境条件，提供细胞适宜的营养条件和温度，在无菌操作的基础上，使离体组织细胞生长增殖并进行传代的技术二、单层细胞培养：用于培养病毒的细胞有原代细胞、传代细胞（二倍体细胞株和传代细胞系）三、鸡胚的接种途径：1、羊膜腔接种2、绒毛尿囊膜接种3、尿囊腔接种4、卵黄囊接种四、间接计数在病毒检验过程中较为常用，是判定病毒感染性的定量方法，常用的有：空斑形成单位法，50%终点法，血凝试验和干扰测定空斑形成单位（PFUs）试验：是将不同稀释倍数的动物病毒与平铺于平板表面的宿主细胞混合，当病毒颗粒在一大片宿主细胞上引发感染时，会造成细胞被溶解而形成空斑，每个空斑系由一个病毒颗粒所造成，计算空斑数目再乘以稀释倍数，即可得知原来的病毒感染单位的浓度凡事能在细胞培养物中产生CPE的病毒都可用空斑技术来测定其滴度。
50%终点法：是将病毒悬浮液经一系列稀释后，接种至动物、鸡胚或培养成单层的细胞，将每个稀释度造成的动物、鸡胚致死量或细胞病变做曲线，找出造成50%动物、鸡胚死亡或病变的终点稀释度。
LD50：为造成50%动物或鸡胚死亡的病毒含量ID50：即是指可造成50%动物或鸡胚感染的剂量CCID50：造成50%细胞培养产生病变效应的剂量五、病毒纯化的一般原则：1、释放病毒至细胞外2、去除细胞碎块3、病毒悬液浓缩六、病毒的保存：1、用低温（-60~25℃）、超低温（-70以下）冰箱或液氮罐（-196~150）保存2、冷冻干燥保存七、血清学实验的方法很多，最常用的是中和试验、补体结合试验、红细胞凝集及红细胞凝集抑制试验中和试验：是在体外适当条件下孵育病毒与特异性抗体的混合物，使病毒与抗体相互反应，再将混合物接种到敏感的宿主体内，然后测定残存的病毒感染力的一种方法。
病毒滴度测定
病毒滴度测定有很多名词都用来描述病毒溶液的滴度。
1．VP（病毒颗粒）或OPV（光学颗粒单位）2．GTU（基因转移单位）或转导颗粒（BFU即蓝点形成单位，与GTU类似）3．PFU（空斑形成单位）4．TCID50（50%组织培养感染剂量）不同的概念缘于不同的滴度测定方法，这些方法包括2类：物理方法（VP）和生物学方法（GTU、PFU、TCID50）。
1．测定VP的方法是测定病毒颗粒在260nm处的吸光度（病毒DNA和蛋白的总吸光度中主要为DNA），1个OD值相当于1.1×1012个病毒颗粒。
用这种方法进行测定在各个实验室中都较为稳定，但它不能区分感染性和缺陷性病毒颗粒。
因此这种方法只能提供病毒的量，至于质，比如是否含有缺陷性颗粒则没有考虑在内。
2．GTU则测定感染后能表达报告基因的细胞数量。
这个过程中，病毒将DNA转入细胞，在一个感染周期结束前立即测定表达报告基因的细胞。
如果重组腺病毒含有报告基因如GFP或LacZ等则可以用这种方法进行测定，病毒保存液通常不用这种方法来进行描述。
3．PFU是测定腺病毒滴度最早的标准方法，主要测定单层细胞培养中病毒裂解空斑的形成。
空斑形成需要许多个感染周期，得到最终结果通常需要三个星期。
一般来说，这种方法得到的结果很少能在其它实验室重复，即使在同一实验室内，不同技术员操作也很少能得到相同的结果。
4．TCID50已被用于测定许多种病毒的滴度，但以前并不用于腺病毒。
病毒稀释液与细胞在96孔板进行培养，然后监测每孔是否CPE。
TCID50方法相对PFU方法而言有几个优点，如速度是PFU的2倍，结果更具预料性，在不同操作个体间也更稳定。
所有生物学方法所得到的结果在不同实验室之间往往有所差异，它主要与病毒感染方法有关。
许多因素如加入的病毒储存液的量、管子的类型、培养的时间、细胞和培养液的量等都会影响结果。
最近，出现了两种测定病毒滴度的改良方法。
一种是用更小体积的病毒液进行感染并在感染过程中不断晃动培养板（Mittereoler等，1996）；另一种方法则在感染时将培养板进行离心（1000 RCF90分钟）（Nyberg-Hoffman等，1997）。
流感病毒分离标准操作规程
流感病毒分离标准操作规程(SOP)病毒分离分离病毒是诊断病毒性疾病最常用,并且高度敏感的方法之一。
分离出的病毒须经免疫学、基因分析或电子显微镜等进一步鉴定确诊。
病毒可长期保存,亦可用来作抗原性、基因特性或药物敏感性等分析。
病毒分离亦受一定限制。
目前用于分离病毒的组织细胞种类有限,每种细胞只能用来分离培养一或数种病毒。
MDCK(狗肾细胞)是目前用于分离培养流感病毒最常用的细胞系。
分离流感病毒最常用的活体是鸡胚,目前有些实验室用MDCK细胞代替鸡胚分离培养流感病毒。
由于MDCK细胞属肿瘤细胞系,故用该细胞分离的病毒不能用于疫苗生产。
各实验室应同时采用鸡胚和MDCK两种方法分离病毒,不应放弃用鸡胚分离病毒的方法。
流感病毒细胞分离标准操作规程材料:1、细胞瓶或细胞管培养成片的MDCK细胞2、TPCK处理胰酶(牛胰腺来源XIII型)Sigma Cat. # T-86423、HEPES 缓冲液, 1 M 母液GIBCO BRL Cat. # 15630-0234、D-MEM培养基,GIBCO BRL Cat. # 11965-0925、青、链霉素母液(10,000 U/ml 青霉素G; 10,000 μg/ml 硫酸链霉素) ,GIBCO BRL Cat. # 15140-0236、牛血清白蛋白组分V, 7.5%溶液,GIBCO BRL Cat. # 15260-0117、放置于2ml wheaton 小瓶中的临床样品8、T-25培养瓶用于病毒培养,(组织培养管也可被应用,若样本量大的话应选用培养瓶,细胞数量按规定调整。
)9、1ml 滴管10、10ml 滴管培养基和试剂的准备:(建议:要求经常检查试剂使用的有效期)500 ml D-MEM液中加入:青、链霉素母液5 ml (终浓度达: 100 U/ml 青霉素and 100 μg/ml 链霉素) 牛血清白蛋白12.5 ml (终浓度: 0.2 %)HEPES缓冲液12.5 ml (终浓度: 25 mM)病毒生长液:每500毫升不含血清的D-MEM液之中加0.5 ml of TPCK-胰酶(母液浓度为2mg/ml )使TPCK-胰酶的浓度为2 μg/ml。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
病毒保存液和细胞保存液的区别
一、病毒保存液
病毒保存液适用于新型冠状病毒、流感病毒、手足口病毒等常见病毒样本采集保存运输工作，是采样管内浸末采样拭子病毒样本一种保护病毒的被检测物质的液体，可采集咽拭子、鼻拭子或特定部位组织样本,储存的样本可用于后续的核酸提取或纯化等临床实验。
通常分为两种，一种是非灭活型，能够保护病毒的蛋白和核酸，另一种是灭活型，通常含有灭活病毒的裂解盐，裂解蛋白而保护核酸。
1、灭活型：添加有裂解盐的病毒保存液就是灭活型的病毒保存液，里面含有的Tris、裂解盐、EDTA等主要目的是裂解核酸而释放出核酸，从而通过后续的实时荧光RT-PCR进行核酸检测，以此判断样本是否含有病毒特征核酸，即是否感染病毒。
核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两类，是生命的最基本物质之一。
病毒结构单一，就只含有一种核酸和蛋白质，因此检测出特征核酸就检测除了病毒。
病毒属于寄生生物，采样后体外无法存活，如果不能及时检测，就需要放入病毒保存液中。
为了保护病毒检测环境的安全性，就需要加入裂解盐来灭活病毒，释放出可以被检测的核酸即可。
2、非灭活型：除了灭活型的病毒保存液，此外还有非灭活型病毒保存液，不含裂解盐，但是保存的病毒完整性更好，检出率更高，除了核酸检测外还可以用于其他研究。
灭活型病毒保存液则使用上更安全，操作环境要求也不用那么严格，各有各的优势，目前研究的非灭活病毒保存液的成分主要为Hank's液基础，在Hank's液基础之上，还添加了诸如庆大霉素、真菌抗生素、BSA（牛血清白蛋白第五组分）、生物缓冲剂HEPES、氨基酸、冷冻保护剂、甘油等多种组分：
3、病毒样本采集方法：
a .鼻拭子：将1根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。
取另一根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子以同样的方法釆集另一侧鼻孔。
上述两根拭子浸入同一含3成釆样液的管中，尾部弃去，旋紧管盖。
b.咽拭子：用2根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子同时擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，将拭子头浸入含3ml病毒保存液（也可使用等渗盐溶液、组织培养液或磷酸盐缓冲液）的管中，尾部弃去，旋紧管盖。
c.鼻咽抽取物或呼吸道抽取物：用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取粘液或从气管抽取呼吸道分泌物。
将收集器头部插入鼻腔或气管，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出，收集抽取的粘液，并用3ml采样液冲洗收集器1次（亦可用小儿导尿管接在50ml注射器上来替代收集器）。
二、细胞保存液：
通常所说的细胞保存液是一种通用型的细胞冻存液，可用于冻存人和各种动物细胞株；细胞冻存是细胞培养、引种、保种和保证实验顺利进行的重要技术手段。
在细胞建株和建系中，及时冻存原始细胞是十分重要的。
在杂交瘤单克隆抗体的制备过程中，杂交瘤细胞、每次克隆化得到的亚克隆细胞的冻存保种常常是必不可少的实验操作。
因为在没有建立一个稳定的细胞系或稳定分泌抗体的细胞系的时候，细胞的培养过程中随时可能因细胞的污染、分泌抗体能力的丧失或遗传变异等等导致实验失败，如果没有原始细胞的冻存，则因为上述的意外而前功尽弃。
细胞保存液优点：目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，
从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。
复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤；非程序降温，-80℃低温冰箱冻存长达5年，可以确保冻存细胞安全；可孔板（细胞培养板）冻存，可用于杂交瘤细胞的冻存液.细胞保存液具有稀释作用，能分离出大量包埋在粘液中的有效细胞，使更多有检验价值的细胞被保存下来，提供充足的细胞数量，为检验结果的准确提供保证；同时，处理后的样品经低速离心过滤后能彻底清除样本中的粘液，有效防止粘液对样品检验结果的干扰。
细胞保存液经过低速离心后可制成均匀单层的细胞薄片，达到检验要求。