蛋白质工程的定点突变
蛋白质工程的定点突变
20世纪80年代以来，基因克隆技术与DNA化学合成方法相结合，建立和发展了定点突变技术。
可以按照预定设计，在已知的DNA序列中增删或转换核苷酸，精确地是靶基因在特定位点发生碱基序列的变化，进而使基因表达及调控，基因产物发生相应改变。
这种快速精确的基因突变已经被广泛地应用与基因工程和蛋白质工程之中。
定点突变有多种方法，有的改变特定核苷酸，有的则是对一段最可能影响蛋白质功能的基因序列进行随机突变，产生一系列突变蛋白质。
寡核苷酸诱导的定点突变基本上分两类：一类是用单链噬菌体M13作载体的寡核苷酸介导的单链模板定点突变；另一类用双链质粒作载体，双引物法定点突变。
为了在体外导入特定的点突变，小的限制性片段可以切除，并被包含所需要突变的合成接头所替代（称为盒式诱变）。
如果不行，插入片段可以克隆到产生单链DNA的噬菌粒载体中，由所设计的错配引物指导DNA复制，产生异源双链的复制型，并在下面的复制循环中产生野生型和突变的复制型。
单链噬菌体作载体的定点突变的基本原理是，用已知序列的环状DNA变性后为模板，人工合成一段引物，将所要设计的定点突变寡核苷酸置于引物中，也就是说人工所合成的引物不是完全和模板互补，而是在某个位点有意识地让碱基突变，和模板上的碱基不能配对，由于其他的碱基是互补的，所以任然可以通过复性，使引物和模板特异性结合。
在M13单链环状模板上杂交一段寡核苷酸引物，利用DNA聚合酶和连接酶的作用，从引物延伸合成链，得到一个闭合环状的异源双链分子。
由于预先在寡核苷酸引物中人为地引入碱基的错配对，插入或缺失，然后在将杂合双环DNA转化到细菌中，因此异源双链DNA经转化和筛选就可以分离到带有相应突变的DNA克隆。
由于复制是半保留复制，经克隆后将有一半的后代环状DNA产生了定点突变，另一半和正常的亲代链一样。
环状双链质粒DNA作为载体进行基因的改造有它的优点。
待改造基因中如有两个适当的限制性内切酶切点，可以用人工合成双链DNA片段置换两切点之间原有序列，在人工合成的双链DNA片段中包含有突变的序列。
蛋白质工程定向进化
蛋白质工程定向进化一、前言蛋白质是生命体系中最基本的分子之一，也是生物学研究的重要对象。
随着现代生物技术的不断发展，蛋白质工程技术也得到了快速发展。
其中，蛋白质工程定向进化技术是一种重要的手段，可以用于改良蛋白质性质或者合成新的功能性蛋白质。
本文将对蛋白质工程定向进化技术进行详细介绍。
二、蛋白质工程定向进化技术概述1. 蛋白质工程简介蛋白质工程是指通过人为设计和改造来改变蛋白质的结构和功能，以满足特定需求的一种技术。
它主要包括两个方面：基因重组技术和突变策略。
基因重组技术主要通过DNA重组来改变目标基因序列从而实现目标蛋白表达；突变策略则主要通过引入突变来改变目标蛋白的结构和功能。
2. 定向进化简介定向进化（Directed Evolution）是一种利用自然选择原理加速分子优化的方法。
它通过在大量变异体中筛选出具有所需性质的分子，进而实现对分子性质的改良和优化。
定向进化可以应用于各种生物分子，如蛋白质、核酸等。
3. 蛋白质工程定向进化技术蛋白质工程定向进化技术是将蛋白质工程和定向进化结合起来的一种手段。
它通过引入随机突变和筛选来改变目标蛋白的结构和功能，从而实现对目标蛋白性质的改良和优化。
三、蛋白质工程定向进化技术原理1. 随机突变随机突变是指在目标基因序列中引入随机变异，使得产生大量具有不同性状的突变体。
随机突变可以通过多种方式实现，如自然突变、PCR扩增等。
2. 筛选筛选是指在大量随机突变体中选择具有所需性状的分子。
筛选方法包括：基于酶活性或者细胞生存能力等可测量特征进行筛选；利用选择压力诱导所需特征表达等。
3. 重复迭代重复迭代是指不断进行随机突变和筛选，以逐步优化分子性状。
这个过程需要进行多次，每一轮都会产生新的突变体，进而实现对分子性质的改良和优化。
四、蛋白质工程定向进化技术应用1. 蛋白质结构优化蛋白质工程定向进化技术可以用于优化蛋白质结构，从而提高其稳定性和活性。
例如，通过引入突变来改变酶的催化活性中心的位置和大小，从而提高酶的催化效率。
蛋白质工程复习要点
1.定点突变技术：它以单链的克隆基因为模板在一段含有一个或几个错配碱基的寡核苷酸引物存在下合成双链闭环DNA分子。
用该双链闭环DNA分子转入宿主细胞,可解链成两条单链,各自可进行复制,合成自己的互补链,从而可得到野生型和突变型两种环状DNA,分离出突变型基因, 并引入到表达载体中就可经转化利用宿主细胞获得突变型的目的蛋白质。
2.杂合蛋白技术：原理：将不同来源的功能结构域经过组合,产生具有新的生物学功能的杂合多肽举例：鼠源scFv＋大肠杆菌β-半乳糖苷酶N-末端3.易错PCR(error prone PCR, EP PCR)：利用低保真度TaqDNA 聚合酶，或者改变PCR 反应体系的条件，在新链DNA 聚合过程中随机引入错配碱基，经多轮PCR 扩增，构建序列多种多样的突变库。
特点：不改变基因长度，突变频率控制在适度范围，能有效地获得有益突变体举例：厌氧菌N. patriciarum 中，木聚糖酶4.DNA 改组技术(DNA shuffling)：原理：先切割产生随机大小的DNA 片段，再用无引物PCR 将其连接成为接近目的基因长度的DNA分子，最后进行扩增得全长基因举例：α-干扰素5.交错延伸( Stagger extension process)：原理：a.在PCR 反应中把常规的退火和延伸合并为一步，并大大缩短其反应时间(55 →5s)，从而只能合成出非常短的新生链，b.经变性的新生链再作为引物与体系内同时存在的不同模板退火而继续延伸。
c.此过程反复进行，产生间隔的含不同模板序列的新生DNA 分子。
酯酶KCTC1767稳定性和底物耐受性。
6.酶工程：是酶学基本原理与化学工程相结合而形成的一门新兴的技术科学。
研究酶制剂大规模生产及应用所涉及的理论与技术方法。
7.蛋白质工程：通过对蛋白质已知结构和功能的了解，借助计算机辅助设计，利用基因定位诱变等技术，特异性地对蛋白质结构基因进行改造，产生具有新的特性的蛋白质的技术，并由此深入研究蛋白质的结构与功能的关系,并使蛋白质更好地造福于人类。
蛋白质与酶的工程改造技术及其应用
蛋白质与酶的工程改造技术及其应用蛋白质是构成生物体细胞的基本结构单元，对于生命活动的各种过程都具有重要的作用。
酶则是生物体内催化反应的重要媒介，通过发挥催化活性加速生命过程，维持了细胞的生存。
传统的酶工程技术主要将重点放在酶的分离和纯化上，但是这种方法成本高、效率低，对于大规模生产和应用场景并不适用。
随着现代生物技术的不断发展，蛋白质与酶的工程改造技术不断更新，为生物制药、酶催化反应等领域提供了新的解决方案。
本文将介绍蛋白质与酶的工程改造技术及其应用。
一、蛋白质工程改造技术1.点突变技术点突变技术是将蛋白质基因的某个碱基或氨基酸序列进行改变，从而使其具有不同的功能、活性或特定的理化性质。
这种技术在人类疾病治疗、新型药物研发、工业酵素等领域有着广泛的应用。
例如，通过点突变技术可以将普通抗体转化为更强力、更稳定的人源化抗体，提高其在治疗上的效果；也可以将酵素的催化速率、热稳定性等进行调整，以适应特定的工业需求。
2.融合蛋白技术融合蛋白技术是将两个或多个不同蛋白质结构域进行连接，形成一个新的分子，从而具有多种不同的功能。
融合蛋白技术不仅可以产生新的蛋白质，还可以对原有蛋白质的稳定性、性质等进行调整。
例如，通过将大肠杆菌外膜蛋白（OmpA）与绿色荧光蛋白（GFP）进行融合，可以得到具有膜定位与荧光表达功能的融合蛋白，用于生物成像和药物靶向测定等领域。
3.点突变与融合蛋白技术的结合将点突变和融合技术相结合可以使得蛋白质的活性和稳定性得到双重提升。
例如，通过将发酵产物氨基酸脱羧酶（ADC）与乙醇磷酸酸转移酶（EPAT）进行融合，并进行点突变，可以得到具有更高催化效率和稳定性的蛋白质。
二、酶工程改造技术酶催化反应是生物科学和化学领域中的重要研究内容，具有广泛的应用前景。
酶工程改造技术可以通过改变酶的氨基酸组成、酶的整体结构、酶的环境条件等，调节酶的催化效率和稳定性，达到增强酶活性、改进反应过程、提高酶的选择性等目的。
蛋白质工程的原理应用领域
蛋白质工程的原理应用领域1. 引言蛋白质是生物体中最重要的分子之一，它在细胞的结构和功能中起着核心作用。
通过对蛋白质的研究和工程，可以改变蛋白质的结构、功能和特性，进而实现对生物过程的控制和应用。
蛋白质工程是一门跨学科的科学，结合了生物学、化学、物理学等多个领域的知识，广泛应用于许多领域。
2. 蛋白质工程的原理蛋白质工程的原理是通过对蛋白质的基因进行改变、重组或合成，以改变蛋白质的结构和功能。
常用的蛋白质工程方法包括定点突变、缺失和插入、融合蛋白、重组蛋白和人工设计等。
•定点突变：通过改变蛋白质基因中的一个或多个氨基酸残基，可以产生具有不同性质和功能的蛋白质。
•缺失和插入：通过删除或插入某些氨基酸残基，可以改变蛋白质的结构和功能。
•融合蛋白：将两个或多个不同的蛋白质基因的片段合并，形成一个新的蛋白质，具有合并蛋白质的性质和功能。
•重组蛋白：将不同物种的蛋白质基因进行重组，可以产生具有新的功能和特性的蛋白质。
•人工设计：根据已知的蛋白质结构和功能，通过计算机模拟和分析，设计并合成具有特定结构和功能的人工蛋白质。
3. 蛋白质工程的应用领域蛋白质工程的应用领域非常广泛，包括药物研发、生物工程、农业生产等。
3.1 药物研发蛋白质工程在药物研发中有着重要的应用。
通过对药物蛋白进行工程改造，可以提高药物的效果和稳定性，减少副作用和毒性。
常见的应用包括：•重组蛋白药物：通过基因工程技术合成的蛋白质药物，如重组人胰岛素。
•抗体药物：通过改变抗体的结构和功能，提高其药效和选择性。
•蛋白质药物的修饰：通过改变蛋白质的修饰模式，提高药物的稳定性和药效。
3.2 生物工程蛋白质工程在生物工程领域也有着广泛的应用。
通过对蛋白质的改造，可以改变生物体的性状、功能和特性。
常见的应用包括：•酶的改造：通过工程改变酶的结构和功能，提高其催化效率和特异性。
•转基因植物：通过改变植物中的蛋白质，使其具有抗病虫害、耐旱抗寒等特性。
•工业酶的生产：通过改变酶的结构和功能，生产具有特定工业应用的酶。
蛋白质工程介绍如何通过蛋白质工程改善蛋白质的性质和功能
蛋白质工程介绍如何通过蛋白质工程改善蛋白质的性质和功能蛋白质工程是一门旨在通过改变蛋白质的结构和功能来满足特定需求的科学领域。
通过蛋白质工程，可以改善蛋白质的性质和功能，从而应用于生物医药、工业生产等领域。
本文将介绍蛋白质工程的原理和方法，以及其在蛋白质性质和功能改善方面的应用。
一、蛋白质工程的原理和方法1.1 定点突变定点突变是蛋白质工程中常用的方法之一，通过人为改变蛋白质的氨基酸序列，使其具备新的性质和功能。
这种方法可以通过DNA重组技术来实现，即将目标蛋白质的编码基因进行特定修改，以获取所需的突变蛋白质。
1.2 蛋白质重组蛋白质重组是通过将目标蛋白质的基因导入到其他生物表达系统（如细菌、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞）中，利用其表达和大规模生产能力来制备目标蛋白质。
这种方法可以通过调节表达系统的条件来改善蛋白质的产量和纯度，从而实现对蛋白质性质和功能的调控。
1.3 结构改造结构改造是指通过人工设计和改变蛋白质的三维结构，从而改变其性质和功能。
这种方法可以通过模拟计算、蛋白质折叠和细胞内修饰等方式来实现。
结构改造可以使蛋白质具备新的结构域或功能模块，从而扩展其应用领域。
二、蛋白质工程对蛋白质性质和功能的改善2.1 增强稳定性蛋白质工程可以改变蛋白质的结构，从而增强其在不同环境条件下的稳定性。
例如，通过定点突变或结构改造，可以增加蛋白质的热稳定性或耐酸碱性，使其更适用于工业生产或医药应用中。
2.2 改善特异性蛋白质工程还可以改善蛋白质的特异性，使其更加准确地与目标分子结合。
通过定点突变或结构改造，可以调控蛋白质与底物或配体的亲和力，从而实现对特定分子的选择性识别。
2.3 提高活性蛋白质工程可以通过改变蛋白质的结构和氨基酸序列，提高其生物活性和催化能力。
例如，通过定点突变或结构改造，可以增加酶的催化效率、选择性和稳定性，从而推动相关生物反应的进行。
2.4 扩展功能蛋白质工程可以通过改变蛋白质的结构和功能模块，赋予其新的功能。
第9章 蛋白质工程中的基因突变方法
3)合成双链 合成双链DNA:将突变引物 端磷酸化 与 将突变引物5‘端磷酸化 合成双链 将突变引物 端磷酸化,与 正链混合退火,形成一小段错配的双链 形成一小段错配的双链. 正链混合退火 形成一小段错配的双链
寡核苷酸 引物
正链 正链
寡核苷酸 引物
4)用大肠杆菌 用大肠杆菌DNA聚合酶 延长形成 聚合酶I延长形成 用大肠杆菌 聚合酶 互补链,这条链称为负链.用 这条链称为负链 互补链 这条链称为负链 用T4DNA 连接酶封口. 连接酶封口
带有目的基因 寡核苷酸 的DNA
置换后的DNA 置换后的
置换出来的 片段
1. 盒突变
盒突变是这类方法的代表. 盒突变是这类方法的代表 所谓盒,就是指与目的基因的欲突 所谓盒 就是指与目的基因的欲突 变部位相应的、 变部位相应的、由化学合成的一系列 双链寡核苷酸。 双链寡核苷酸。这一系列双链寡核苷 酸可能带有各种可能选用的突变系列。 酸可能带有各种可能选用的突变系列。 当进行突变处理时， 当进行突变处理时，根据实际需要把 各种突变盒插入目的基因中， 各种突变盒插入目的基因中，就象把 盒式录音带插入录音机一样。 盒式录音带插入录音机一样。
（二）寡核苷酸置换的定点突变
上述的寡核苷酸诱导的定点突变只 适用于将蛋白质中的某一氨基酸转变 为预定的另一种氨基酸。 为预定的另一种氨基酸。但如果事先 不能确定转变产物， 不能确定转变产物，需要将每一种可 能的代替氨基酸逐一实验的时候， 能的代替氨基酸逐一实验的时候，就 要求同时进入某一点的多种突变。 要求同时进入某一点的多种突变。 适合这类要求的突变方法， 适合这类要求的突变方法，就是 寡核苷酸置换的定点突变法。 寡核苷酸置换的定点突变法。
这类方法的过程是， 这类方法的过程是，用带有各种所需 要突变序列的寡核苷酸， 要突变序列的寡核苷酸，在体外直接置换 目的基因中的欲突变部位而实现突变。 目的基因中的欲突变部位而实现突变。置 换过程需要限制性酶切和连接酶连接， 换过程需要限制性酶切和连接酶连接，所 以必须在双链DNA之间进行。寡核苷酸是 之间进行。 以必须在双链 之间进行 双链，目的基因也是双链。 双链，目的基因也是双链。
蛋白质工程的主要研究方法和进展
蛋白质工程的主要研究方法和进展李 强 施碧红* 罗晓蕾 左祖祯 邢佩佩 刘 璐(福建师范大学生命科学学院,福建福州 350108)摘 要:蛋白质工程是用分子生物学手段对蛋白质进行分子改造的技术。
介绍了蛋白质工程的几种常用方法及其基本原理和研究进展。
关键词:蛋白质工程;定点诱变;定向进化中图分类号 Q816 文献标识码 A 文章编号 1007-7731(2009)05-47-02Advances in The Techni q ues of P rotein EngineeringL i Q iang et al (Co llege o f L ife Sc iences,Fu jian N or m a lU n i versity,Fuzhou350108,Chi na)Ab strac t:P ro tein eng ineer i ng is a techn i que used to i m prove prote i n m o l ecular In th i s paper,seve ra l m ethods and t he ir pr i nci p les and their advantag es f o r m olecu lar m odifica ti on have been rev ie w edK ey words:P rote i n eng i neer i ng;site-d i rected m utag enesis;d irected evoluti on20世纪70年代以来,对蛋白质的分子改造渐渐进入研究领域,通过对蛋白质分子进行突变,得到具有新的表型和功能或者得到比原始蛋白相对活力更高的突变体,对蛋白质的分子改造技术逐渐纯熟。
蛋白质工程的主要技术分为理性进化和非理性进化,已经在农业、工业、医药等领域取得了较大的进展。
1 理性进化理性进化主要是利用定点诱变技术,通过在已知D NA序列中取代、插入或缺失一定长度的核苷酸片段达到定点突变氨基酸残基的目的。
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20世纪80年代以来，基因克隆技术与DNA化学合成方法相结合，建立和发展了定点突变技术。
可以按照预定设计，在已知的DNA序列中增删或转换核苷酸，精确地是靶基因在特定位点发生碱基序列的变化，进而使基因表达及调控，基因产物发生相应改变。
这种快速精确的基因突变已经被广泛地应用与基因工程和蛋白质工程之中。
定点突变有多种方法，有的改变特定核苷酸，有的则是对一段最可能影响蛋白质功能的基因序列进行随机突变，产生一系列突变蛋白质。
寡核苷酸诱导的定点突变基本上分两类：一类是用单链噬菌体M13作载体的寡核苷酸介导的单链模板定点突变；另一类用双链质粒作载体，双引物法定点突变。
为了在体外导入特定的点突变，小的限制性片段可以切除，并被包含所需要突变的合成接头所替代（称为盒式诱变）。
如果不行，插入片段可以克隆到产生单链DNA的噬菌粒载体中，由所设计的错配引物知道DNA复制，产生异源双链的复制型，并在下面的复制循环中产生野生型和突变的复制型。
(图）单链噬菌体作载体的定点突变的基本原理是，用已知序列的环状DNA变性后为模板，人工合成一段引物，将所要设计的定点突变寡核苷酸置于引物中，也就是说人工所合成的引物不是完全和模板互补，而是在某个位点有意识地让碱基突变，和模板上的碱基不能配对，由于其他的碱基是互补的，所以任然可以通过复性，使引物和模板特异性结合。
在M13单链环状模板上杂交一段寡核苷酸引物，利用DNA聚合酶和连接酶的作用，从引物延伸合成链，得到一个闭合环状的异源双链分子。
由于预先在寡核苷酸引物中人为地引入碱基的错配对，插入或缺失，然后在将杂合双环DNA转化到细菌中，因此异源双链DNA经转化和筛选就可以分离到带有相应突变的DNA克隆。
由于复制是半保留复制，经克隆后将有一半的后代环状DNA产生了定点突变，另一半和正常的亲代链一样。
环状双链质粒DNA作为载体进行基因的改造有它的优点。
待改造基因中如有两个适当的限制性内切酶切点，可以用人工合成双链DNA片段置换两切点之间原有序列，在人工合成的双链DNA片段中包含有突变的序列。
但是这种置换方法收到限制酶酶切位点的限制。
1.用M13DNA进行的寡核苷酸引物介导的定点突变：寡核苷酸引物介导的定点突变的步骤是用含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物，在聚合酶的作用下启动DNA分子进行复制。
主要过程是：（1）将待突变基因克隆到突变载体上；2.制备含突变基因的M13DNA单链模板；3.引物与模板与模板退火，5/端磷酸化的突变寡核苷酸引物与待突变的寡核苷酸引物与待突变的核苷酸形成一小段碱基错配的异源双链的DNA 4.合成突变链，在DNA聚合酶的催化下，引物以单链DNA为模板合成全长的互补连，而后由连接酶封闭缺口，产生闭环的异源双链的DNA分子； 5.转化和初步筛选异源双链DNA分子转化大肠杆菌后，产生野生型，突变型的同源双链DNA分子，可以用限制性酶切法，斑点杂交法和生物来初步筛选突变的基因； 6.对突变体基因进行序列分析。
改进型双引物诱变原理是将目的基因克隆到M13噬菌体载体中，提取M13单链DNA，作为PCR的模板；设计两个引物，这两个引物分别与M13同一条单链的不同DNA片段互补，其中一个引物（引物1）与目的基因的一部分互补，但是含有一个核苷酸的突变；另一个引物（引物2）中含有一个酶切位点，但该酶切位点的一个核苷酸被诱变。
对引物1的5/端进行磷酸化，引物2的新生链的3/端与引物1的磷酸化后5/端相遇，两端DNA在T4DNA连接酶的作用下连接。
这样引物1的磷酸二酯键起到封接作用，保护引物1不会被新生连所替换。
用未被引物2诱变时的限制性内切酶位点所对应的限制性酶解PCR产物，然后用该酶解产物转化修复缺陷型大肠杆菌。
由于不含有引物2诱变的DNA都被切割成线性，不能在大肠杆菌中稳定存在，所以得到的转化子都是同时含有1.2两个突变位点的。
通常引物2选择在抗性基因中，这样除用限制煤排除非突变体外，还可以抗性变化来进行进一步筛选。
这种方法较为简便易行，且得到突变体的机会较高，因此是现在较常用的一种获得突变体的方法。
PCR介导的定点突变法利用PCR技术进行定点突变，不仅可以使突变体大量扩增，还可以提高突变率。
以PCR为介导的定点突变为基因修饰和改造提供了另一条途径，例如通过改变引物中某些碱基而改变基因序列，达到有目的的改造蛋白质结构，研究蛋白质的结构与功能之间的关系的目的。
还可以在所设计的引物5/端加入合适的限制型内切酶酶位点，为PCR 扩增产物后续得分克隆提供方便。
寡核苷酸介导的PCR突变的一种常用方法是将目的基因克隆到质粒载体上，质粒分置于两管中，每管各加入两个特顶的PCR引物，一个引物与基因内部或其附近的一段序列完全互补，另一引物和另一段序列互补，但有一个核苷酸发生了突变；两管中不完全配对的引物与两条相反的链结合，两个突变引物是互补的。
由于两个反应中引物的位置不同，所以PCR扩增后，产物有不同的末端。
将两管PCR产物混合，变性，复性，则每条链会与另一管中的互补退火，形成有两个切口的环状DNA转入大肠杆菌后，这两个切口均可修复。
若同一管中的两条DNA链结合，会形成线性DNA分子，它不能在大肠杆菌中稳定存在。
只有环状DNA才能在大肠杆菌中稳定存在，而绝大多数的环状分子都含有突变基因。
这种方法不用将基因克隆到M13载体上，也不用特殊的载体系统，而且不用将M13上的突变基因在亚克隆到表达载体上，方法简单实用。
PCR介导的定点突变法，需要4种扩增引物，进行3次PCR反应。
前两次PCR反应中，应用两个互补的并在相同部位具有碱基突变的内侧引物，扩增形成两条双链DNA 片段，其中一段可以彼此重叠，去除未反应的多余引物之后，这两条双链DNA片段经过变性和退火可以形成具有3/凹末端的异源双链分子，在TaqDNA聚合酶的作用下，产生含有重叠序列的双链DNA分子。
这种DNA分子再用两个外侧寡核苷酸引物进行第三次PCR扩增，便产生突变体DNA.3.盒式突变盒式突变1985年Wells提出的一种基因修饰技术——盒式突变，一次可以在一个位点上产生20种不同氨基酸的突变体，可以对蛋白质分子中重要氨基酸进行“饱和性”分析。
利用定位突变在拟改造的氨基酸密码两侧造成两个原载体和基因上没有的内切酶切点，用该内切酶消化基因，再用合成的发生不同变化的双链DNA片段替代被消化的部分。
这样一次处理就可以得到多种突变型基因。
盒式突变具体是利用一段人工合成的含有基因突变序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中相应序列。
这种突变的寡核苷酸是由两条寡核苷酸组成的，当他们退火时，按设计要求产生克隆需要的粘性末端，由于不存在异源双链的中间体，因此重组质粒全部是突变体。
如果将简并的突变寡核苷酸插入到质粒载体分子上，在一次的实验中便可以获得数量众多的突变体，大大减少了突变需要的次数。
这种方法适合研究蛋白质分子中不同位点的氨基酸作用。
其方法是合成两套分别与靶DNA的两条链互补的寡核苷酸，其中一套由单一的与野生型靶DNA一条链的序列精确互补的寡核苷酸组成，另一套则由一系列互补于另一条链同一位置带有目标突变的寡核苷酸组成，这样在有利于形成错在片段的两端设计合适的突变末端，直接插入到重组质粒中置换同源的野生型序列，如果在重组质粒中目的序列两端无合适的限制性内切酶位点，可用前述定点突变的方法引入，要求引入酶切位点对载体质粒是单一的，而且对目的基因编码没有影响。
这样含有目的突变的一系列盒式双链片段可以按需要在目的基因上任意置换，引入需要的突变。
三种方法的比较：1.核苷酸引物介导的定点突变法，优点是保真度比PRC突变法高，经过改进后使该方法突变成功率大大提高；缺点是操作过程环节复杂，周期长，而且在克隆突变基因时会受到限制酶酶切位点的限制。
2.PCR介导定点突变其优点是操作比较简单，突变的成功率高，缺点是：后续工作较复杂，PCR扩增产物通常需要连接到载体分子上，然后才对突变基因进行转录，转译等方面的研究；TaqDNA聚合酶的保真性偏低。
3.盒式突变比前两者简单易行，突变效率高等优点，同时在一对限制酶酶切位点内一次性突变多个位点；缺点是合成多条引物的成本较高。
而且一般情况下，在靶DNA片段的两侧往往难以满足存在一对限制酶酶切位点的要求。
融合蛋白质的构建：重组DNA技术允许在体外进行不同基因或基因片段之间的融合，并通过融合基因产生融合蛋白。
最近融合蛋白已经被广泛用于生物研究，它可以被用于蛋白质的表达，检测，和纯化。
在两个不同的蛋白质融合时，一个蛋白质的融合位置可以是它的C端或者是N端，但是不同的融合方案可能导致融合蛋白质的性质不同。
融合蛋白的基因融合可根据需要采取如下方式：1.最常见和最简单的基因融合方式是将重组基因直接剪切于适当的信号序列之后，其优点在于如果在转用中信号肽被正确加工，那么产生的重组蛋白就可具备天然的N端。
但是应该指出的是并非任何外源基因加上信号肽序列后都可以分泌表达。
2.将外源基因本身按可读框架自我融合，这种方式对一些小肽的稳定高效表达尤为重要。
3.目标蛋白质和其伙伴蛋白直接融合在C端或者N端。
C端的优点是：启动子和翻译起始信号都处于基因的5/末端，因此3/末端所进行的不同基因片段的融合并不改变院启动子和翻译起始信号的原设计，目标基因的表达水平相对稳定。
N端融合的缺点是目标基因产物特异性的转录和翻译其实原件必须在目标基因的5/末端。
4.分泌-亲和融合，此种设计就是将分泌和纯化的优点结合起来，即N端为信号肽，然后是融合肽，再连接目标基因。
产物能分泌到培养基中，可以为以后的纯化，连续发酵和收集表达产物提供方便。
5.双亲和融合，将目的基因X同两个分别对不同配基有特异性亲和的异源结构域A,B以A-X-B的形式进行融合，为以后选择利用亲和层析进行纯化提供方便。
这一设计适用于表达对蛋白质水解酶高度敏感的蛋白质，通过两次连续的亲和分析，对即使表达量不高的蛋白质也可以很好地回收。
6.分泌-插入融合：将目的基因插入到信号肽序列和插入序列之间，次插入序列是为一种可插入到细胞膜或者细胞壁的蛋白质编码。
这种设计的目的是用以将受体或着抗原定位于细菌的外表面或装配成融合蛋白质进入类病毒颗粒。
系统适用于开发疫苗或者产生具有免疫原的复合物。
融合蛋白的应用集中表现在抗体领域。