Cav1.2通道CT1片断突变体的质粒构建和蛋白表达
构建点突变质粒步骤
基因定点突变一、定点突变的目的把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。
二、定点突变的原理通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来,然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR 产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化,筛选阳性克隆,再测序确定就行了。
三、引物设计原则引物设计的一般原则不再重复.突变引物设计的特殊原则：（1）通常引物长度为25~45 bp,我们建议引物长度为30～35 bp.一般都是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为11—12 bp。
若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要11—12个bp才能与模板搭上，而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补的引物.（2）如果设定的引物长度为30 bp，接下来需要计算引物的Tm值，看是否达到78℃（GC含量应大于40％）。
（3）如果Tm值低于78℃，则适当改变引物的长度以使其Tm值达到78℃（GC含量应大于40％）。
（4）设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置。
(5）最好使用经过纯化的引物。
Tm值计算公式:Tm=0。
41×(% of GC)–675/L+81.5注：L：引物碱基数；% of GC:引物GC含量。
四、引物设计实例以G CG→A CG为例：5’—CCTCCTTCAGTA TGTAG G CGACTTACTTATTGCGG-3’（1）首先设计30 bp长的上下游引物，并将A (T）设计在引物的中央位置。
Primer #1: 5'-CCTTCAGTATGTAG A CGACTTACTTATTGC—3’Primer ＃2: 5’-GCAATAAGTAAGTCG T CTACATACTGAAGG-3’（2）引物GC含量为40%，L为30，将这两个数值带入Tm值计算公式,得到其Tm=75.5（Tm=0。
41×40-675/30+81.5）。
突变型PUMA质粒的构建及表达
研 究使 用 的 Ｐ Ｕ ＭＡ基 因来 源 于 ｐ Ｃ Ｅ Ｐ ４ 一 （ Ｈ Ａ） － Ｐ ｕ － ＭＡ质粒 ， 通 过野 生型 和 突变 型 质粒 的成 功 构 建 ， 旨 在 为 突变 型 Ｐ Ｕ ＭＡ对 肿 瘤 细胞 的促 凋 亡 功 能 研 究
奠定基 础 。
隆到 ｐ Ｉ Ｒ Ｅ Ｓ ２ ． Ｅ Ｇ Ｆ Ｐ载 体 上 ， 构建 Ｐ Ｕ Ｍ Ａ 真 核 表 达 载 体
ｐ Ｉ Ｒ Ｅ Ｓ ２ 一 Ｅ Ｇ Ｆ Ｐ 一 （ ＨＡ） ． Ｐ Ｕ Ｍ Ａ， 利 用 定 点 突 变 技 术 构 建 ｐ ｌ Ｒ Ｅ Ｓ ２ 一 Ｅ Ｇ Ｆ Ｐ 一 （ Ｈ Ａ） ， 一 Ｐ Ｕ Ｍ Ａ— Ｔ ２ ８ Ｇ， 行 Ｐ Ｃ Ｒ及 测 序 鉴 定 ； 脂 质体分别 将两种 质粒转 染 Ｈｅ ｌ ａ细胞 ， 同 时设 未转染 的 阴性 对照组及转染 空 载体 组 （ ４个 实 验组 ） ； Ｐ Ｉ 染 色观 察 Ｐ Ｕ Ｍ Ａ 对细胞的促凋亡作 用 ； 流式 细胞仪检测细胞 凋亡率 ； Ｒ Ｔ — Ｐ Ｃ Ｒ 检测 Ｐ Ｕ ＭＡ的表达 ； Ｗｅ ｓ ｔ ｅ ｒ ｎ ｂ ｌ ｏ ｔ 检测 突变 型 Ｐ Ｕ ＭＡ蛋 白和 标签蛋 白的表达 。结果 经Ｐ Ｃ Ｒ及 测序 结果 表 明 ， 正确 构 建野生型 、 突变 型 Ｐ Ｕ ＭＡ重组 质粒 ， Ｐ Ｕ ＭＡ基 因第 １ ０位氨基 酸的第 ２ ８～３ ０位 碱 基 由丝 氨 酸 （ Ｔ Ｃ Ｃ） 突 变 为 丙 氨 酸
Ａ ｃ ｔ ａ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ａ ｔ ｉ ｓ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ｉ ｎ ａ ｌ ｉ ｓ Ａ ｎ ｈ ｕ ｉ ２ ０ １ ３ Ａ ｐ ｒ ； ４ ８ （ ４ ）
・３ ４ １・
突变型 Ｐ Ｕ ＭＡ质粒 的构建及表达
pmCherry-C1-Argonaute1重组质粒的构建研究论文
pmCherry-C1-Argonaute1重组质粒的构建研究论文pmCherry-C1-Argonaute1重组质粒的构建研究论文应激蛋白Argonaute1是一种多功能蛋白，参与RNA干扰及应激颗粒(SGs)、加工体(PBs)形成等多种细胞生物学过程。
pmCherry-C1是一种可以编码红色荧光蛋白的真核表达载体。
2015年9～11月，本研究通过基因工程技术将Argonaute1基因片段连接至pmCherry-C1载体，构建pmCherry-C1-Argonaute1重组质粒，旨在为深入研究Argonaute1蛋白的细胞生物学功能提供便利工具。
1材料与方法1.1材料质粒、菌株及细胞:pmCherry-C1载体由JohanPerane博士馈赠，感受态大肠杆菌Trans1购自天津科仪嘉欣科技有限公司，HeLa细胞来自本实验室。
酶类及主要生化试剂:限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ及T4DNA连接酶均购自ThermoFisherScientific公司，Taq 酶购自北京鼎国昌盛生物技术公司，T/A载体(pEASY-T1)购自北京全式金生物技术有限公司，B型小量DNA快速回收试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限公司，质粒快速提取试剂盒购自北京索来宝科技有限公司，去内毒素质粒提取试剂盒购自Promega公司，Lipofectamine2000购自Invitrogen公司，BCA蛋白检测试剂盒购自Pierce公司，LumiGLo化学发光底物购于KPL公司。
抗体:兔抗人Argonaute1单克隆抗体购自CST公司，鼠抗人G3BP单克隆抗体和兔抗人DCP1α抗体购自abcam公司，鼠抗人樱桃红蛋白(Cherry)单克隆抗体购自MBL公司，蓝色荧光(AlexaFluor350)标记的驴抗鼠荧光二抗和绿色荧光(AlexaFluor488)标记的驴抗兔荧光二抗购自Invitrogen公司，辣根过氧化物酶标记的抗鼠和抗兔IgG二抗购自KPL公司。
突变蛋白结构域构建
突变蛋白结构域构建英文回答：Protein domain construction is a crucial step in understanding the structure and function of mutated proteins. A protein domain is a distinct and independently folding structural unit within a protein. It often performs a specific function and can be found in multiple proteins across different species. Constructing a mutated protein domain involves identifying the specific region of the protein that is affected by the mutation and then designing a modified version of that domain.To begin with, I would analyze the amino acid sequence of the mutated protein and compare it to the wild-type protein sequence. This comparison would help me identify the specific region or domain that is affected by the mutation. Once I have identified the domain, I can proceed with constructing a modified version of it.There are several methods that can be used for protein domain construction. One common approach is to use computational modeling techniques, such as homologymodeling or molecular dynamics simulations, to predict the three-dimensional structure of the mutated domain. These techniques utilize known protein structures to generate a model of the mutated domain based on its sequencesimilarity to other proteins.Another approach is to use experimental methods, suchas X-ray crystallography or nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy, to determine the structure of the mutated domain. These techniques provide high-resolution structural information and can help in understanding the impact of the mutation on the domain's structure and function.Once the structure of the mutated domain is determined, I can then design and construct a modified version of it. This can involve introducing specific amino acid substitutions or deletions to mimic the effects of the mutation. For example, if the mutation leads to a loss of function in the domain, I can design a modified versionthat retains the essential structural features but lacksthe specific functional elements affected by the mutation.In addition to structural modifications, I can also introduce additional mutations or modifications to the domain to study their effects on its structure and function. This can help in understanding the functional consequencesof different mutations and their potential implications in disease.Overall, protein domain construction is a complex process that requires a combination of computational and experimental techniques. By understanding the structure and function of mutated protein domains, we can gain valuable insights into the molecular mechanisms underlying diseases and develop targeted therapies.中文回答：蛋白结构域构建是理解突变蛋白的结构和功能的关键步骤。
原核表达步骤
实验方法与步骤1 表达质粒的构建及测序分析1.1 cofilin-1的片段的准备1.1.1 引物设计根据在GenBank上查找人源cofilin-1的基因序列，用Primer Premier 5.0软件进行上下游引物的设计，并送往上海生物工程技术服务有限公司合成的PCR 引物。
引物如下：引物名称序列F-cofilin-1 5′-AAGTCGACATATGGCCTCCGGTGTG-3′R-cofilin-1 5′-TCTCTCGAGGGCTCACAAAGGCTTG-3′将以上引物用灭菌的三蒸水稀释成10μmol/L，分装于Eppendorf管中，-20℃冰箱中保存备用。
1.1.2 cofilin-1片段PCR1 反应体系：2.5μlKOD polymerase(3’-5’核酸外切酶活性)KOD polymerase buffer 5μlMgSO4 2.5μlDMSO（“万能溶剂”） 2.5μldNTPMixture 5μlPrimerF（底物） 1.5μlPrimerR 1.5μlTemplate（模板）5μlddH2O 25μlTotal 50μl2PCR反应条件：①94℃预变性3min②94℃退火30s③65℃延伸40s④68℃40s⑤go to②30个循环⑥68℃5min⑦4℃forever3 琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测（1）配置浓度为1%的凝胶。
称取琼脂糖0.3g，加入30ml 1×TAE电泳缓冲液（Tris-乙酸电泳缓冲液）中，用微波炉加热2min，待凝胶稍冷却，加入2μl EB（溴化乙锭，荧光染色剂）混匀后倾入凝胶铸槽中，插入梳子，并用玻璃棒驱除气泡，待凝胶完全凝结后拔除梳子。
（2）把凝胶置于1×TAE电泳缓冲液的电泳槽中，加样孔置于负极一侧，然后依次在加样孔中加入50μl Marker、50μl样品＋10μl loading buffer(上样缓冲液，可以显示两条带，前面的蓝色的条带是溴酚蓝，代表的片段大小是300bp，后面的有点绿色的条带是二甲苯青，代表的片段大小在4000bp左右)，盖上电泳盖，以100V电压进行电泳。
小窝蛋白-1重组慢病毒载体的构建及鉴定
小窝蛋白-1（caveo的结构和功能性标志蛋白，在细胞信 号转导、胆固醇转运、细胞内吞等方面发挥重要作用[1]。 Cav-1 广泛存在于肺泡玉型上皮细胞膜上。近年研究发 现 Cav-1 在急性肺损伤肺水肿发病始动机制中起重要 作用，与肺泡上皮细胞通透性、钠水转运有关[2]。本课题
组前期研究结果也表明 Cav-1 在小鼠急性肺损伤时的 表达水平明显高于正常小鼠[3]，这提示 Cav-1 在急性肺 损伤发病中起重要作用。本研究试图构建 Cav-1 重组慢 病毒 ，并 验 证 其 在 293T 细 胞 中 的 表 达，以 期 为 构 建 Cav-1 高表达的急性肺损伤动物模型提供实验材料。
浙江医学 2019 年第 41 卷第 14 期
小窝蛋白 -1 重组慢病毒载体的 构建及鉴定
董雷 马春芳 蔡宛如
●论 著
【 摘要 】 目的 构建小窝蛋白 -1（Cav-1）重组慢病毒载体，并在 293T 细胞和小鼠中验证 Cav-1 过表达。 方法 将 Cav-1 基因克隆至慢病毒载体 GV287，然后利用酶切、PCR 扩增鉴定、阳性克隆鉴定及测序验证构建 Cav-1 重组慢病毒。将 Cav-1 重组慢 病毒转染至 293T 细胞，通过荧光检测慢病毒转染效果，采用 Western blot 法检测 Cav-1 蛋白表达情况，同时转染 C57BL6 小鼠，免 疫组化法检测小鼠肺组织中 Cav-1 的表达情况。 结果 经酶切、PCR 扩增鉴定以及阳性克隆测序，提示 Cav-1 重组慢病毒构建正 确。荧光检测显示转染 Cav-1 重组慢病毒后的 293T 细胞可见强荧光，Western blot 法检测结果显示目的基因可表达，小鼠肺组织中 Cav-1 呈强阳性表达，且实时定量 PCR 检测 Cav-1 重组慢病毒滴度为 1.3×1012copies/ml，达到可利用标准。 结论 采用本研究方 法可成功构建 Cav-1 重组慢病毒载体。
汉坦病毒包膜糖蛋白糖基化位点突变体的构建
汉坦病毒包膜糖蛋白糖基化位点突变体的构建【摘要】目的构建汉坦病毒糖基化位点的突变体。
方式利用基因定点突变的方式构建了5个糖蛋白突变体，即将G一、G2上的天冬酰胺置换为丙氨酸，按照被替换的位置，突变体别离命名为N134A、N235A、N347A、N399A、N928A。
结果构建的5个N-联糖基化位点的突变体，经测序图谱显示原序列中的天冬酰胺（N）均被置换为丙氨酸（A）。
结论成功构建了5个糖基化位点的突变体，为进一步研究N-联糖基化的缺失对细胞融合的影响奠定了基础。
【关键词】汉坦病毒；糖基化位点；突变体构建Abstract：Objective To construct N-linked glycosylation site mutants of hantavirus. Methods Site-directed mutagenesis was used to construct five glycoprotein gene mutants which were designed as N134A, N235A, N347A, N399A and N928A according to the substitution sites of asparagine with alanine on G1 and G2. Results Five N-linked glycosylation site mutants were constructed and their sequencing showed the asparagine (N) residues at the N-linked glycosylation sites on G1 and G2 were replaced by alanine (A). Conclusion N-linked glycosylation site mutants were successfully constructed and laid the foundation for study on the roles ofN-linked glycosylation of HTNV glycoproteins in cell fusion.Key words: hantavirus; glycosylation site; construction of mutants汉坦病毒(hantavirus，HV)是布尼亚病毒科(bunyaviridae)汉坦病毒属(genus hantavirus)的一员，是肾综合征出血热和汉坦病毒肺综合征的一路病原体。
小窝蛋白-1重组慢病毒载体的构建及鉴定
小窝蛋白-1重组慢病毒载体的构建及鉴定董雷; 马春芳; 蔡宛如【期刊名称】《《浙江医学》》【年(卷),期】2019(041)014【总页数】4页(P1477-1479,1485)【关键词】小窝蛋白-1; 重组慢病毒载体; 急性肺损伤【作者】董雷; 马春芳; 蔡宛如【作者单位】310005杭州浙江中医药大学附属第二医院呼吸内科【正文语种】中文小窝蛋白-1（caveolin-1，Cav-1）是细胞膜上膜内陷型胞膜囊泡-小窝的结构和功能性标志蛋白，在细胞信号转导、胆固醇转运、细胞内吞等方面发挥重要作用[1] 。
Cav-1广泛存在于肺泡Ⅰ型上皮细胞膜上。
近年研究发现Cav-1在急性肺损伤肺水肿发病始动机制中起重要作用，与肺泡上皮细胞通透性、钠水转运有关[2] 。
本课题组前期研究结果也表明Cav-1在小鼠急性肺损伤时的表达水平明显高于正常小鼠[3] ，这提示Cav-1在急性肺损伤发病中起重要作用。
本研究试图构建Cav-1重组慢病毒，并验证其在293T细胞中的表达，以期为构建Cav-1高表达的急性肺损伤动物模型提供实验材料。
1 材料和方法1.1 材料1.1.1 细胞和质粒 293T细胞购于上海ATCC细胞库，大肠杆菌DH5α、GV287慢病毒载体购自上海吉凯基因公司。
1.1.2 实验动物清洁级雄性C57BL6小鼠24只购于上海斯莱克公司。
1.2 主要试剂和仪器 1kp DNA ladder Marker（批号：#SM0311）购于加拿大Fermentas公司，250bp DNA ladder Marker（批号：DL250+，100T）购于上海捷瑞公司，琼脂糖（批号：GA4-100）购于上海赛百盛基因技术有限公司，Taq酶、dNTP、内切酶等购于大连TAKARA公司，In-FusionTMPCR Cloning Kit（批号：63962）购于美国Clontech公司，质粒抽提试剂盒（批号：A1460）购于美国Promega公司，FBS、DMEM细胞培养试剂购于美国Gibco公司，invitrogen lipofectamine 2000转染试剂购于美国 invitrogen公司，Cav-1（D46G3）X 兔单抗和β-actin抗体购于美国CST公司。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Cav1.2通道CT1片断突变体的质粒构建和蛋白表达 雷明;赵美眯;封瑞;王红梅;毛楠;朱彤;郝丽英 【摘 要】目的 构建心肌Cav1.2通道CT1片段及其突变体与谷胱甘肽转移酶(GST)重组的融合蛋白原核表达载体,并进行蛋白表达和纯化.方法 以豚鼠Cav1.2通道CT1质粒(pGEX?6p?3/CT1)为模板,采用定点突变技术构建CT1 T1603A和CT1 T1603D两种突变体质粒.转化大肠杆菌BL21感受态细胞,大量培养后用IPTG诱导GST融合蛋白表达,分离纯化后采用SDS?PAGE检测CT1及其突变体蛋白的相对分子量和纯度.结果 CT1片段及其突变体融合蛋白得到了正确、大量表达,提取纯化后的CT1片段及其突变体融合蛋白具有较高的纯度.结论 成功构建了Cav1.2通道CT1片断及其突变体融合蛋白原核表达载体,获得了CT1突变体融合蛋白,为深入研究CT1片断在Cav1.2通道调节中的作用和机制奠定基础.%Objective To construct prokaryotic expression vectors of the CT1 fragment of Cav1.2 channel and its mutants for CT1?GST fusion pro?tein expression and purification. Methods Taking plasmid of pGEX?6p?3/CT1 as template,two mutational plasmids(CT1?T1603A and CT1?T1603D)with site directed mutagenesis were constructed. The plasmids were then transformed to E.coli BL21 competent cells,and the transfor?mants were induced with IPTG for the expression of GST fusion proteins of CT1 fragment and its mutants. SDS?PAGE was performed to determine the relative molecular weight and purity. Results Mutated bases corresponding to the target amino acid site were confirmed by cDNA sequence. High purity of GST?CT1 fusion protein and its mutants were successfully obtained. Conclusion Prokaryotic expression vectors of CT1 fragment and its mutants were constructed,and the fusion proteins were successfully expressed were obtained. These results provided a basis for further studies of the function of CT1 fragment in the regulation for Cav1.2 channel and its mechanism.
【期刊名称】《中国医科大学学报》 【年(卷),期】2015(044)009 【总页数】4页(P837-839,843) 【关键词】融合蛋白;CT1;突变体 【作 者】雷明;赵美眯;封瑞;王红梅;毛楠;朱彤;郝丽英 【作者单位】中国医科大学药学院药物毒理学教研室,沈阳 110122;中国医科大学药学院药物毒理学教研室,沈阳 110122;中国医科大学药学院药物毒理学教研室,沈阳 110122;中国医科大学药学院药物毒理学教研室,沈阳 110122;中国医科大学药学院药物毒理学教研室,沈阳 110122;东北大学环境生物学教研室,沈阳 110004;中国医科大学药学院药物毒理学教研室,沈阳 110122
【正文语种】中 文 【中图分类】R966 电压依赖性钙通道（voltage-dependent Ca2+channel，VDCC）按照电生理特性分为低电压依赖型及高电压依赖型2种，按照药理学及生物物理学特性分为T、L、N、P/Q和R型［1，2］，其中L型钙通道（L-type Ca2+channel，LTCC）可以被二氢吡啶类药物硝苯地平所阻断，也称为二氢吡啶受体。LTCC是研究最为广泛的高电压依赖型钙通道之一，存在于大多数可兴奋细胞膜上，如骨骼肌、心脏、脑、内分泌细胞、神经元及其他组织。在心肌细胞中，L型钙通道介导的钙离子内流触发肌浆网钙释放通道ryanodine受体开放，肌浆网存储的钙离子大量释放，这种级联效应称为“钙致钙释放”（Ca-induced Ca2+release，CICR），在心脏的兴奋收缩耦联（excitationcontraction couple，EC）中起着关键性作［3］，LTCC的调节方式多种多样，异常复杂［4，5］。 前期研究［6～8］发现，钙离子、钙调蛋白（calmodulin，CaM）、钙离子/钙调蛋白依赖的蛋白激酶Ⅱ（Ca/ calmodulin-dependent protein kinasesⅡ，CaMKⅡ）等都是通过与LTCC C末端的CT1（1 509～1 789）片段特定的氨基酸或氨基酸序列相互作用发挥调节功能。CaM可直接与心肌细胞Cav1.2钙通道CT1片段结合，从而对钙通道钙离子依赖性易化作用进行调节［9，10］，CaMKⅡ通过磷酸化CT1片段上的1 603位苏氨酸以调节钙通道的功能［11］。为了更好研究1 603位苏氨酸在Cav1.2钙通道调节中的作用，本研究以豚鼠Cav1.2通道CT1为模板，采用定点突变技术将1 603位苏氨酸分别突变为丙氨酸（CT1 T1603A）和天门冬氨酸（CT1 T1603D），模拟其去磷酸化和磷酸化状态，制备纯化蛋白并进行相应的活性鉴定，为研究Cav1.2钙通道的磷化调节奠定基础。 1.1 材料 原核表达质粒pGEX-6p-3/CT1和BL21菌株由本实验室保存。异丙基硫代-β-D半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG）、溶菌酶（1ysozvme，LYS）、二硫苏糖醇（dithiothreitol，DDT）、N-十二烷基肌氨酸钠（N-laurylsarcosine，N-Lau）、氨苄西林（ampicillin，Amp）均购自美国Sigma公司；PreScission Pmtease和GS-4B beads购自德国GE Healthcare公司；胰蛋白胨、酵母提取物购自英国OXOID公司；其他试剂均购自美国BIOSHARP公司。CT1定点突变由本研究组提供原始质粒作为模板和突变位置信息，由上海生工生物工程股份有限公司代为完成突变和序列测定。 1.2 BL21感受态细胞的转化 应用42℃精确热激法进行感受态细胞的转化，将CT1及其突变体质粒导入BL21感受态细胞，构建相应的原核表达系统。具体方法如下：分别量取pGEX-6p-3/CT1、pGEX-6p-3/CT1 T1603A和pGEX-6p-3/CT1 T1603D质粒各5 ng，加入到50 μL E.coli BL21感受态细胞，轻轻混匀后冰浴30 min，再放入42℃水浴锅热击45 s，快速转移至冰浴中，冷却2 min。加入1 mL SOC培养基（不含抗生素），混匀后37℃、120 r/min水浴振荡培养l h。3 000 r/min、2 min离心后去除600 μL上清，剩余沉淀的菌体约轻轻混匀后加在含Amp 0.1 g/L的LB固体琼脂培养板上，无菌条件下涂抹均匀。晾干后转移至37°C电热恒温培养箱中，倒置培养12～16 h。取单克隆菌种接种于装有3 mL含Amp 0.1 g/L的LB培养液的15 mL离心管中，37℃、120 r/min培养12～16 h。菌液按菌液∶50%甘油比例为4∶1冻存于-80℃备用。 1.3 融合蛋白的诱导表达及提取纯化 各取10 μL菌种加入到装有200 mL含0.1 g/L Amp的LB培养液的锥形瓶中，37℃、120 r/min振荡培养12～16 h。当A600在0.8左右时，加入IPTG至终浓度1 mmol/L，37℃、120 r/min振荡培养4 h，诱导融合蛋白表达。菌液经4 000 r/min离心8 min后弃上清，用10 mL PBS重悬细菌，加入1 mol/L LYS和1 mol/L DTT各100 μL、15%N-Lau 1 mL，混匀后放置于冰上30 min，然后用超声法粉碎细菌（超声3 s停7 s，共20 min，冰上进行）。再加入30%TritonX-100 335 μL，冰上放置30 min，充分破碎细菌释放融合蛋白。16 000 g、8 min离心后将10 mL上清液加入到含200 μL GS-4B beads的15 mL离心管，4℃旋转结合过夜（GS-4B beads用PBS洗3遍，每次800 r/min离心2 min）。第2天用PBS温柔清洗beads 3次，每次5 mL，800 r/min离心2 min，去除杂蛋白，4℃保存备用。 1.4 CT1及其突变体蛋白的鉴定 用15%SDS-PAGE电泳检测纯化的CT1及其突变体蛋白的相对分子量和纯度。 2.1 CT1及其突变体质粒的测序结果 DNA测序结果显示CT1及其突变体质粒均是含有843 bp的DNA片断，CT1片断中位于285 bp处的密码子ACG（图1A）分别突变为GCT（图1B）和GAC（图1C）。这3个密码子编码的氨基酸依次为苏氨酸（T）、丙氨酸（A）和天门冬氨酸（D），该位点氨基酸在Cav1.2通道氨基酸序列全长中对应为第1 603位。因此，结果表明已成功获得CT1突变体质粒CT1 T1603A和CT1 T1603D。 2.2 CT1及其突变体蛋白的表达与纯化 实验中表达提取的蛋白均为GST-CT1融合蛋白。其中，CT1片断共有281个氨基酸，分子量约为17.6 kDa，GST分子量约为26 kDa。采用15%SDSPAGE电泳检测该融合蛋白及其突变体蛋白。如图2所示：CT1及其突变体蛋白分子量大约为43.6 kDa，与理论值基本一致。表明该方法构建并表达所得的CT1及其突变体蛋白均能正常表达。 Cav1.2通道的磷酸化调节是其重要的调节途径之一，许多调控因子都是通过对通道的磷酸化和去磷酸化实现调节功能［12，13］。基于氨基酸序列结构，豚鼠Cav1.2通道C末端有17个潜在的磷酸化位点，其中相当一部分位于CT1片段（1 509～1 789）。Erxleben等［14］报道了CaMKⅡ磷酸化Ⅰ～Ⅱ环上的439位丝氨酸和CT1上的1 517位丝氨酸，引起兔心肌细胞Cav1.2通道2型开放。Lee等［15］也报道了CaMKⅡ磷酸化兔平滑肌钙通道C末端的1 512和1 570位丝氨酸，促进电压依赖性易化。前期研究发现，1 603位苏氨酸可以被CaMKⅡ磷酸化，并且对Cav1.2起着重要的调节作用［11］。CT1片断及其突变体的构建表达有利于进一步研究CT1上各个调节位点对Cav1.2通道的调节作用和机制，具有十分重要的意义。 原核表达系统发展日趋完善、操作流程简单快速、成本低、产量高，尤其适宜于表