蛋白质之间的相互作用ppt课件
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蛋白质蛋白质相互作用ppt课件
个物种的蛋白质进行交互 Blast，即利用一个物种的一 个蛋白质对第二个物种的所有 蛋白质进行Blast，再将在第 二个物种中得到的E值最小的 蛋白质序列对第一个物种的所 有蛋白质进行Blast，如在第 一个物种中E值最小的蛋白质 是原来用来对第二个物种进行 Blast的蛋白质，则这两个蛋 白质互为直系同源蛋白质。
在应用中，通常利用三个物种 进行交互Blast以便更好地确 定直系同源蛋白质。
Org A, Protein1 Blast Org B, All proteins P2 with smallest E value
IleS-MG345- MJ0947
Org B, Protein2 Blast Org A, All proteins P1 with smallest E value
基因位点的上下文 基因临近
聚集
分散
基因融合 (Rosetta-Stone method )
电子双杂交
系统发育上下文
系统发生谱方法 系统树相近 (Mirror tree)
基因表达: mRNA共表达
.
20
一些重要的概念
Ortholog: 直系同源，是指不同物种中来自同一个 祖先的基因和蛋白质。
.
35
Mirror Trees Method
该方法的假设前提是：相互作用的蛋白可能是共进化的。方法是：计算包含
不同物种的蛋白质家族间的进化距离，构建各自相应的进化树，在进化树之间相
似性距离的基础上，构建镜像树，然后由镜像树之间的相似性距离和蛋白质在镜
像树上的位置确定蛋白质之间的两两相互作用。
.
36
.
31
基因组临近/ 基因临近 (1)
在应用中，通常利用三个物种 进行交互Blast以便更好地确 定直系同源蛋白质。
Org A, Protein1 Blast Org B, All proteins P2 with smallest E value
IleS-MG345- MJ0947
Org B, Protein2 Blast Org A, All proteins P1 with smallest E value
基因位点的上下文 基因临近
聚集
分散
基因融合 (Rosetta-Stone method )
电子双杂交
系统发育上下文
系统发生谱方法 系统树相近 (Mirror tree)
基因表达: mRNA共表达
.
20
一些重要的概念
Ortholog: 直系同源，是指不同物种中来自同一个 祖先的基因和蛋白质。
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35
Mirror Trees Method
该方法的假设前提是：相互作用的蛋白可能是共进化的。方法是：计算包含
不同物种的蛋白质家族间的进化距离，构建各自相应的进化树，在进化树之间相
似性距离的基础上，构建镜像树，然后由镜像树之间的相似性距离和蛋白质在镜
像树上的位置确定蛋白质之间的两两相互作用。
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36
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31
基因组临近/ 基因临近 (1)
DNA与蛋白质的相互作用-生化课件
NA的普遍性结合 中DNA的特点
蛋白质与DNA主链骨架接触，大多数涉 及磷酸二酯键中的氧原子。 与DNA碱基序列特异性无关 结构的匹配性： 旋转对称性 特定距离的相反电荷 形成氢键基团排布上的匹配 形成足够大的范德华力
Pr-DNA特异性结合中DNA的特点
大沟内存在特异性识别信息 氨基酸与碱基对共平面 氨基酸和碱基对之间形成氢键
经典举例
• 操纵子（operon）：是指原核生物中由一个或多个相关 基因以及转录翻译调控元件组成的基因表达单元。 • 启动子（promoter）：与基因表达启动相关的顺式作用 元件，是结构基因的重要成分。它是一段位于转录起始位 点5’端上游区大约100~200bp以内的具有独立功能的DNA 序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地相结 合并具有转录起始的特异性。 • RNA聚合酶（polymerase）：以一条DNA链或RNA为模 板催化由核苷-5′-三磷酸合成RNA的酶。是催化以DNA为 模板（template）、三磷酸核糖核苷为底物、通过磷酸二 酯键而聚合的合成RNA的酶。因为在细胞内与基因DNA 的遗传信息转录为RNA有关，所以也称转录酶。
• 催化转录的RNA聚合酶是一种由多个蛋白亚基组 成的复合酶。全酶（holoenzyme）的组成是 α2ββ’δ。α亚基与RNA聚合酶的四聚体核心 （α2ββ’）的形成有关；β亚基含有核苷三磷酸的 结合位点；β’亚基含有与DNA模板的结合位点； 而Sigma因子只与RNA转录的起始有关，与链的 延伸没有关系，一旦转录开始，δ因子就被释放， 而链的延伸则由四聚体核心酶（core enzyme） 催化。所以，δ因子的作用就是识别转录的起始 位置，并使RNA聚合酶结合在启动子部位。
两个概念
• 顺式作用元件（cis-acting element）：存在于 基因旁侧序列中能够影响基因表达的序列，包括 启动子、增强子、调控序列和可诱导元件等。其 本身不编码任何蛋白质，它仅仅提供一个作用位 点，与反式作用因子相互作用参与基因表达调控。 • element反式作用因子（trans-acting ）：指能 直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元件核 心序列上参与调控靶蛋白基因转录效率的蛋白质。
蛋白质与DNA主链骨架接触，大多数涉 及磷酸二酯键中的氧原子。 与DNA碱基序列特异性无关 结构的匹配性： 旋转对称性 特定距离的相反电荷 形成氢键基团排布上的匹配 形成足够大的范德华力
Pr-DNA特异性结合中DNA的特点
大沟内存在特异性识别信息 氨基酸与碱基对共平面 氨基酸和碱基对之间形成氢键
经典举例
• 操纵子（operon）：是指原核生物中由一个或多个相关 基因以及转录翻译调控元件组成的基因表达单元。 • 启动子（promoter）：与基因表达启动相关的顺式作用 元件，是结构基因的重要成分。它是一段位于转录起始位 点5’端上游区大约100~200bp以内的具有独立功能的DNA 序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地相结 合并具有转录起始的特异性。 • RNA聚合酶（polymerase）：以一条DNA链或RNA为模 板催化由核苷-5′-三磷酸合成RNA的酶。是催化以DNA为 模板（template）、三磷酸核糖核苷为底物、通过磷酸二 酯键而聚合的合成RNA的酶。因为在细胞内与基因DNA 的遗传信息转录为RNA有关，所以也称转录酶。
• 催化转录的RNA聚合酶是一种由多个蛋白亚基组 成的复合酶。全酶（holoenzyme）的组成是 α2ββ’δ。α亚基与RNA聚合酶的四聚体核心 （α2ββ’）的形成有关；β亚基含有核苷三磷酸的 结合位点；β’亚基含有与DNA模板的结合位点； 而Sigma因子只与RNA转录的起始有关，与链的 延伸没有关系，一旦转录开始，δ因子就被释放， 而链的延伸则由四聚体核心酶（core enzyme） 催化。所以，δ因子的作用就是识别转录的起始 位置，并使RNA聚合酶结合在启动子部位。
两个概念
• 顺式作用元件（cis-acting element）：存在于 基因旁侧序列中能够影响基因表达的序列，包括 启动子、增强子、调控序列和可诱导元件等。其 本身不编码任何蛋白质，它仅仅提供一个作用位 点，与反式作用因子相互作用参与基因表达调控。 • element反式作用因子（trans-acting ）：指能 直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元件核 心序列上参与调控靶蛋白基因转录效率的蛋白质。
DNA蛋白质的相互作用
同细胞蛋白质提取物一道温育，形成DNA-蛋白质 复合物。 将它加样到非变性的聚丙烯酰胺凝胶中，进行电 泳分离。 应用放射自显影技术显现具放射性标记的DNA条 带位置
不存在与DNA结合的蛋白质时 存在与DNA结合的蛋白质时
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5
凝胶阻滞试验不仅可以用来鉴定在特殊类 型细胞的提取物中，是否存在着能够同某 一特定DNA片段结合的蛋白质分子(比如特 异的转录因子等)，而且还可以用来研究发 生此种结合作用之精确的DNA序列的特异 性
超量的非标记的竞争DNA (competitor DNA ）
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6
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7
材料及试剂：
2X结合缓冲液：
20 mM Tris pH 7.5 、100 mM NaCl、2 mM EDTA、10% 甘油、
poly(dI-dC) ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ5 mg/ml in TE)、 . 酵母单杂交技术广泛用DNA与蛋白相互作 用的研究。
1 原理： 在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA朝正电 极移动的距离与其分子量的对数成反比。 如果此时DNA分子与某种蛋白质结合， 由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞 在特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相应缩短了。
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4
2 主要步骤及内容： 制备探针DNA （P32放射性同位素标记DNA）
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9
如果在电泳时结合DNA化学测序，则可准确判断出结合区 的精确序列。
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10
三、甲基化干扰试验
根据DMS （二甲基亚蓝）能使G残基甲基化， 而六氢吡啶又能够特异切割甲基化的G残基这一原理而设计
不存在与DNA结合的蛋白质时 存在与DNA结合的蛋白质时
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凝胶阻滞试验不仅可以用来鉴定在特殊类 型细胞的提取物中，是否存在着能够同某 一特定DNA片段结合的蛋白质分子(比如特 异的转录因子等)，而且还可以用来研究发 生此种结合作用之精确的DNA序列的特异 性
超量的非标记的竞争DNA (competitor DNA ）
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材料及试剂：
2X结合缓冲液：
20 mM Tris pH 7.5 、100 mM NaCl、2 mM EDTA、10% 甘油、
poly(dI-dC) ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ5 mg/ml in TE)、 . 酵母单杂交技术广泛用DNA与蛋白相互作 用的研究。
1 原理： 在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA朝正电 极移动的距离与其分子量的对数成反比。 如果此时DNA分子与某种蛋白质结合， 由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞 在特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相应缩短了。
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2 主要步骤及内容： 制备探针DNA （P32放射性同位素标记DNA）
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如果在电泳时结合DNA化学测序，则可准确判断出结合区 的精确序列。
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三、甲基化干扰试验
根据DMS （二甲基亚蓝）能使G残基甲基化， 而六氢吡啶又能够特异切割甲基化的G残基这一原理而设计
蛋白质相互作用
荧光共振能量转移 (FRET)
原理：FRET在蛋白质相互作用研究的 基本原理是分别将bait蛋白、prey蛋 白与相应的供体荧光基团(如ECFP)和 受体荧光基团(如 EYFP)融合
优点：能检测到瞬时、较弱的蛋白质 相互作用；能同时检测到两蛋白的细 胞分布和作用位点。 缺点：光谱可能存在重叠，影响实验 结果
Interaction Domain-Structral basis for protein interaction
相互作用区域是蛋白质相互作用的结构基础
1. PDZ结构域
2. LIM结构域
Interaction Domain-Structral basis for protein interaction
免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation, Co-IP)
原理：利用抗体和抗原之间 特异性的识别和结合，通过亲 和纯化，分离出抗原蛋白和单 克隆抗体。 优点：保留蛋白质的修饰 和结合状态，同时所需的样本 量较少。 缺点：Co-IP特异性较低
双分子荧光互补 ( BiFC)
原理 ：将荧光蛋白分成两个无独 立功能的片段，分别与 bait 蛋白和 prey 蛋白融合表达。 优点：能简单方便地通过观察荧 光鉴定蛋白质相互作用 缺点：不能实时反应蛋白质的结 合和分离情况。
临界值内。如果两个结构域中至少有五个原子的距离在 5 Å 之内，那么这两个结构域之间存在相互作用。
Full Atom Contact (FAC) PSIMAP 方法 Sampled Atom Contact (SAC) PSIMAP
最精确
节约时间和搜索空间
Bounding Box Contact (BBC) PSIMAP
9
最新蛋白质分子间的相互作用教学讲义ppt
tran s fo rm e d yeast
X
yeast plasmid expression vector
predator
unknow
tis s u e
b a it
predator
X
Y
does X bind with a protein?
to ta l m R N A re v e rs etra n s c rip ta s e
DNAb in d in g d o m a in transfection
yeast plasmid expression vector
b a it
predator
X
Y
does X bind with a protein?
tran s fo rm e d yeast
X
W e ' l l s t a r t b y m a k i n g t r a n s f o r m e d y e a s t e x p r e s s i n g X
cDNAforX
DNAb in d in g d o m a in transfection
tran s fo rm e d yeast
X
yeast plasmid expression vector
tran s fo rm e d yeast
?Y
predator
unknow
tis s u e
b a it
• 3，细菌的抗药性
• AcrA, AcrB, Tol C • 乙酰螺旋霉素抗性
三，生物学对蛋白质相互作用 的研究方法
• 1，突变体系列和互补测验（遗传学）
•
突变体
X
yeast plasmid expression vector
predator
unknow
tis s u e
b a it
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• AcrA, AcrB, Tol C • 乙酰螺旋霉素抗性
三，生物学对蛋白质相互作用 的研究方法
• 1，突变体系列和互补测验（遗传学）
•
突变体
蛋白质相互作用PPT课件
蛋白质组学是应用各种技术研究蛋白质组 的一门新兴科学。
其目的是从整体的角度分析细胞内动态变 化的蛋白质组分、表达水平与修饰状态， 了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示 蛋白质功能与细胞生命活动规律。
9. 3 蛋白质相互作用网络
蛋白质的相互作用(PPI, Protein-protein interaction)是指蛋白质分子之间的相关性， 并从生物化学、信号转导和遗传网络的角 度研究这种相关性。
有一些蛋白质可以以单体 的形式发挥作用，但是大 部分的蛋白质都是和伴侣 分子或是与其他蛋白质一 起发挥作用的。
基因组计划--大量的新基因不断被发现，然而单纯的 基因组DNA序列尚不能解答许多生命问题。基因是相对静 态的，而基因编码的产物—蛋白质则是动态的，具有时空 性和调节性，是生物功能的主要体现者和执行者。蛋白质 的表达水平、存在方式以及相互作用等直接与生物功能相 关。
抵御外来细菌和病毒的抗体及免疫类物质，当蛋白质充足时， 一旦需要这些抗体和免疫物质在数小时内就可以增加数百倍。
参与细胞的信号转导，调控细胞的发育和凋亡，及至生物体的 命运。
形成生物体的渗透压，引发生物体的各种活动，例如肌肉的做 功等。
3.运输载体
蛋白质是生物体内很多重要的代谢物和营养素的载体。 氧、脂类、维生素、矿物质与微量元素都需要利用各种蛋白质运输到
5. 生物分子网络具有度的负关联 性
度的负关联性；
具有度大的节点趋向于连接度小的节点的特点
在蛋白质相互作用的网络中：
度非常大的蛋白质节点不直接相连 与度比较小的蛋白质节点相连接
6.生物分子网络具有一定的鲁棒性和适应性
生物分子网Biblioteka 具有鲁棒性： 即对于外界环境的变化或者内部个体之间的不相容有着一定的 承受能力，这与生物分子网络无标度的拓扑性质息息相关。拥 有不同度值的节点对移除表型的影响差异很大。当移除网络中 的多数非关键节点基因时，几乎没有明显的表型影响。
蛋白质与蛋白质作用
与G蛋白偶联的受体作用机理：
G-蛋白 的两种 构象 配体 + 受体 （-GDP） 非活化型
配体-受体复合物
（-GTP） + 活化型
GDP
配体-受体
（复合物）
GDP Pi
GTP
G蛋 白 循 环 示 意 图
效应分子：
腺苷酸环化酶
（adenylate cyclase, AC） 磷脂酰肌醇磷脂酶C （phosphatedyl inositol phospholipase, PI-PLC）
一、受体的分类、一般结构及功能
膜受体 —— 位于细胞质膜
胞内受体 —— 位于细胞浆和细胞核中
（一）膜受体
1、环状受体
配体依赖性离子通道（配体门控离子通道），
主要受神经递质的信息物质直接调节。
在神经冲动的快速传递中起作用。
2、七个跨膜 -螺旋受体（ 蛇型受体，serpentine
receptor） —— G-蛋白偶联受体 （1）结构：
1、维持染色质的结构稳定 2、对特定基因起阻遏作用——关闭基因 一、DNA与支架蛋白（原核） 支架蛋白与DNA结合后使染色体保持紧密状态。 二、DNA与蛋白质（真核） 染色体中DNA与蛋白质结合构成核小体 核小体中的蛋白质 组蛋白（Histone）：N端富含碱性氨基酸，C端富含酸性氨 基酸，共5种。 非组蛋白（Nohistone）：不均一，有种属和器官特异性
FGF——成纤维细胞生长因子
（2）非催化型受体 该类受体缺乏内在酶活性，但与配体
结合后可引起其同源二聚体形成，与酪氨酸
蛋白激酶偶联而表现激酶的活性。
（二）、胞内受体
由400-1000个残基组成的单体蛋白，多为反式作用因子。
蛋白质互作
SH2结构域
约100个氨基酸序列，识别磷酸化的酪氨 酸及相邻的3-6个氨基酸残基。
SH3结构域
由50个氨基酸残基组成，存在于各种蛋 白激酶和衔接蛋白中，识别富含脯氨酸 的序列R/KXXPXXP或PXXPXR/K，其亲和力 与脯氨酸残基及相邻氨基酸残基组成相 关。
PH结构域
100-120个氨基酸残基组成，存在于多种 细胞骨架蛋白，蛋白激酶、PLC超家族中。
兼具结合脂类和蛋白质的能力，参与细 胞信号转导。
WW结构域
30-40个氨基酸残基组成的三股反平行β 片层结构域，含两个高度保守的色氨酸 WW而得名，识别富含脯氨酸的序列XPPXY， 参与非受体信号转导、转录调节和蛋白 质降解等过程。
PDZ结构域
由80-100个氨基酸残基组成，包含2个 α-螺旋和6个β-折叠，常以串联重复拷 贝存在，是构成支架蛋白的重要结构， 在细胞膜蛋白质的聚集中发挥重要作用。
结构域是蛋白质中折叠较为紧密且具有 一定功能的球状和纤维状的结构，以模 块方式具有多种不同功能的分子。
蛋白质相互作用结构域专指那些可以识 别其他蛋白质的特殊结构，从而介导两 个蛋白之间发生相互作用的结构域，一 般由50-100个氨基酸组成。
结构域结构域相互作用 结构域-肽段模体相互作用
protein2) SH3-SH2-SH3 NCK(noncatalytic region of tyrosine
kinase) SH3-SH3-SH3-SH2 Scaffold protein JIP-1(JNK-interacting protein1)
PPI 研究的医学意义
PPI异常可导致细胞活动失控
相互作用能力的丧失可丧失原有的正常调节。 突变也可产生新的相互作用。
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若X、Y相互作用，BD、AD间接连 接，AD靠近转录起始位点激活下 游报告基因的转录； 反之X、Y之间没有相互作用，报 告基因不表达
.
优点
1. 双杂交技术不需尖端设备，几乎在任何实验室都可以实现 2.作用信号是在融合基因表达后， 在细胞内重建转录因子的作用而给出的， 省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。 3.检测在活细胞内进行， 可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。 4. 检测的结果可以是基因表达产物的积累效应， 因而可检测存在于蛋白质之 间的微弱的或暂时的相互作用。
2.易于纯化
重组噬菌体的纯化步骤简单、不要求昂贵的试剂与设
备。用于鉴定表位和受体所用的噬菌体载体为M13噬菌体。由于M13噬
菌体是温和型噬菌体，不裂解宿主菌，成熟的噬菌体可分泌到培养基中，
通过离心收集培养上清，再向其中加入沉淀剂即可将上清中大量噬菌体
粒子沉淀下来，从而富集得到含外源基因产物的重组噬菌体。
噬菌体肽库与靶分子的相互作用
洗涤去未结合的或非特异性
结合的噬菌体
将特异性结合的噬菌体洗脱下来
三轮淘
选后，克隆测序
.
优点
1.高通量的淘选 将靶标分子（抗体）固定在固相载体上，加入噬 菌体展示肽库，利用抗原-抗体的特异性亲和力将与抗体结合的噬菌体 吸附在固相载体上，不能结合的噬菌体仍在溶液中，可以通过洗涤去 除，再将特异结合的噬菌体洗脱下来，如此反复数轮扩增、淘选，即 可将有用的基因从多达百万以上的噬菌体克隆中分离出来
.
局限性
1.双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内， 而许多蛋白间的相互作 用依赖于翻译后加工， 而这些反应在核内无法进行。另外有些蛋白的正确折叠 和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助， 这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体 蛋白等的研究。 2.酵母双杂交系统的一个重要的问题是“假阳性”。由于某些蛋白本身具有激活 转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用， 使DNA结合结构域杂交蛋白在 无特异激活结构域的情况下可激活转录，即自激活。 3.另外，某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域， 能与其他蛋白形成 稳定的复合物， 从而引起报告基因的表达， 产生"假阳性"结果。 4.外源蛋白对酵母菌的毒性作用
蛋白质相互作用
20160222
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酵母双杂交用于检测两种蛋白质之间的相互作用
酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始的认识，真核生物完 整的转录因子是由：DNA结合结构域（DNA-Binding domain，BD）和转录激 活结构域（transcription-activating domain，AD）构成的，它们是结构上可以 分开的、功能上相互独立的结构域，BD识别DNA上的特异序列，并使AD定位 于基因的上游，从而激活转录
.
GST pull-down assay
其基本原理是将靶蛋白-GST（GST是谷胱甘肽巯基转移酶）融合蛋白亲和固化在 谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的 蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物 后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋 白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以 及体外转录翻译系统等方法获得。
.
局限性
（1）在噬菌体展示过程中必须经过细菌转化、噬菌体包装，有的展示系统还 要经过跨膜分泌过程，这就大大限制了所建库的容量和分子多样性。 （2）不是所有的序列都能在噬菌体中获得很好的表达，蛋白质功能的实现是 一个复杂的过程，部分未折叠的蛋白在细菌中很容易被降解，因此，必须，很难示系统依赖于细胞内基因的表达，所以，一些对细胞有毒 性的分子如生物毒素分子，很难得到有效表达和展示。
单独的DNA结合域或转录激活域不能激活下游基因的转录，它们之间只有 通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能
它的基本原理是转录因子通过结合上游激活序列（UAS）启动下 游报告基因的转录
.
通过因工程的方法，构建BD-X、AD-Y载体（X一般是已知启动子的下游构建了3 个报道基因——Ade，His，LacZ），可以通过营养缺陷筛选、X-α-gal显色和酵母 表型的改变来筛选或验证两个蛋白之间是否存在相互作用
.
蛋白质芯片
原理是对固相载体进行特殊的化学处理，再将已知的蛋白分子产物固定 其上，根据这些生物分子的特性，捕获能与之特异性结合的待测蛋白经 洗涤、纯化，再进行确认和生化分析
它具有以下优点： 1. 直接用粗生物样品（血清、尿、体液）进行分析 2. 同时快速发现多个生物标记物 3. 具有高通量的验证能力 4.可以发现低丰度蛋白质 5. 在同一系统中集发现和检测为一体 特异性高 利用单克隆抗体芯片，可鉴 定未知蛋白质，以减少测定蛋白质序列的工作量。
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可替代方法： 免疫共沉淀 噬菌体表面展示 GST pull-down assay 蛋白质芯片
.
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）
是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的，用于研究蛋白质之间的相互 作用，这种方法也常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于 确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
其原理是： 当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质之间的相 互作用被保留了下来。如果用一种蛋白质的抗体免疫沉淀该蛋白，那么与 该蛋白在体内结合的另一种蛋白也能沉淀下来。
优点为： （1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态； （2）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
缺点为： （1）可能检测不到低亲和力的蛋白质－蛋白质相互作用； （2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有其它蛋白在中间起桥 梁作用；
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噬菌体表面展示(phage display technology)
将外源蛋白与噬菌体的衣壳蛋白融合表达，融合蛋白表达在病毒颗粒的 表面，而编码该融合子的DNA则位于病毒粒子内，使大量多肽与其DNA 编码序列之间建立了直接联系，使各种靶分子的多肽配体通过淘选得以 快速鉴定。
若X、Y相互作用，BD、AD间接连 接，AD靠近转录起始位点激活下 游报告基因的转录； 反之X、Y之间没有相互作用，报 告基因不表达
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优点
1. 双杂交技术不需尖端设备，几乎在任何实验室都可以实现 2.作用信号是在融合基因表达后， 在细胞内重建转录因子的作用而给出的， 省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。 3.检测在活细胞内进行， 可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。 4. 检测的结果可以是基因表达产物的积累效应， 因而可检测存在于蛋白质之 间的微弱的或暂时的相互作用。
2.易于纯化
重组噬菌体的纯化步骤简单、不要求昂贵的试剂与设
备。用于鉴定表位和受体所用的噬菌体载体为M13噬菌体。由于M13噬
菌体是温和型噬菌体，不裂解宿主菌，成熟的噬菌体可分泌到培养基中，
通过离心收集培养上清，再向其中加入沉淀剂即可将上清中大量噬菌体
粒子沉淀下来，从而富集得到含外源基因产物的重组噬菌体。
噬菌体肽库与靶分子的相互作用
洗涤去未结合的或非特异性
结合的噬菌体
将特异性结合的噬菌体洗脱下来
三轮淘
选后，克隆测序
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优点
1.高通量的淘选 将靶标分子（抗体）固定在固相载体上，加入噬 菌体展示肽库，利用抗原-抗体的特异性亲和力将与抗体结合的噬菌体 吸附在固相载体上，不能结合的噬菌体仍在溶液中，可以通过洗涤去 除，再将特异结合的噬菌体洗脱下来，如此反复数轮扩增、淘选，即 可将有用的基因从多达百万以上的噬菌体克隆中分离出来
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局限性
1.双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内， 而许多蛋白间的相互作 用依赖于翻译后加工， 而这些反应在核内无法进行。另外有些蛋白的正确折叠 和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助， 这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体 蛋白等的研究。 2.酵母双杂交系统的一个重要的问题是“假阳性”。由于某些蛋白本身具有激活 转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用， 使DNA结合结构域杂交蛋白在 无特异激活结构域的情况下可激活转录，即自激活。 3.另外，某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域， 能与其他蛋白形成 稳定的复合物， 从而引起报告基因的表达， 产生"假阳性"结果。 4.外源蛋白对酵母菌的毒性作用
蛋白质相互作用
20160222
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酵母双杂交用于检测两种蛋白质之间的相互作用
酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始的认识，真核生物完 整的转录因子是由：DNA结合结构域（DNA-Binding domain，BD）和转录激 活结构域（transcription-activating domain，AD）构成的，它们是结构上可以 分开的、功能上相互独立的结构域，BD识别DNA上的特异序列，并使AD定位 于基因的上游，从而激活转录
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GST pull-down assay
其基本原理是将靶蛋白-GST（GST是谷胱甘肽巯基转移酶）融合蛋白亲和固化在 谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的 蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物 后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋 白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以 及体外转录翻译系统等方法获得。
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局限性
（1）在噬菌体展示过程中必须经过细菌转化、噬菌体包装，有的展示系统还 要经过跨膜分泌过程，这就大大限制了所建库的容量和分子多样性。 （2）不是所有的序列都能在噬菌体中获得很好的表达，蛋白质功能的实现是 一个复杂的过程，部分未折叠的蛋白在细菌中很容易被降解，因此，必须，很难示系统依赖于细胞内基因的表达，所以，一些对细胞有毒 性的分子如生物毒素分子，很难得到有效表达和展示。
单独的DNA结合域或转录激活域不能激活下游基因的转录，它们之间只有 通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能
它的基本原理是转录因子通过结合上游激活序列（UAS）启动下 游报告基因的转录
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通过因工程的方法，构建BD-X、AD-Y载体（X一般是已知启动子的下游构建了3 个报道基因——Ade，His，LacZ），可以通过营养缺陷筛选、X-α-gal显色和酵母 表型的改变来筛选或验证两个蛋白之间是否存在相互作用
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蛋白质芯片
原理是对固相载体进行特殊的化学处理，再将已知的蛋白分子产物固定 其上，根据这些生物分子的特性，捕获能与之特异性结合的待测蛋白经 洗涤、纯化，再进行确认和生化分析
它具有以下优点： 1. 直接用粗生物样品（血清、尿、体液）进行分析 2. 同时快速发现多个生物标记物 3. 具有高通量的验证能力 4.可以发现低丰度蛋白质 5. 在同一系统中集发现和检测为一体 特异性高 利用单克隆抗体芯片，可鉴 定未知蛋白质，以减少测定蛋白质序列的工作量。
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可替代方法： 免疫共沉淀 噬菌体表面展示 GST pull-down assay 蛋白质芯片
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免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）
是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的，用于研究蛋白质之间的相互 作用，这种方法也常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于 确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
其原理是： 当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质之间的相 互作用被保留了下来。如果用一种蛋白质的抗体免疫沉淀该蛋白，那么与 该蛋白在体内结合的另一种蛋白也能沉淀下来。
优点为： （1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态； （2）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
缺点为： （1）可能检测不到低亲和力的蛋白质－蛋白质相互作用； （2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有其它蛋白在中间起桥 梁作用；
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噬菌体表面展示(phage display technology)
将外源蛋白与噬菌体的衣壳蛋白融合表达，融合蛋白表达在病毒颗粒的 表面，而编码该融合子的DNA则位于病毒粒子内，使大量多肽与其DNA 编码序列之间建立了直接联系，使各种靶分子的多肽配体通过淘选得以 快速鉴定。