蛋白质之间的相互作用ppt课件
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若X、Y相互作用，BD、AD间接连 接，AD靠近转录起始位点激活下 游报告基因的转录； 反之X、Y之间没有相互作用，报 告基因不表达
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优点
1. 双杂交技术不需尖端设备，几乎在任何实验室都可以实现 2.作用信号是在融合基因表达后， 在细胞内重建转录因子的作用而给出的， 省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。 3.检测在活细胞内进行， 可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。 4. 检测的结果可以是基因表达产物的积累效应， 因而可检测存在于蛋白质之 间的微弱的或暂时的相互作用。
2.易于纯化
重组噬菌体的纯化步骤简单、不要求昂贵的试剂与设
备。用于鉴定表位和受体所用的噬菌体载体为M13噬菌体。由于M13噬
菌体是温和型噬菌体，不裂解宿主菌，成熟的噬菌体可分泌到培养基中，
通过离心收集培养上清，再向其中加入沉淀剂即可将上清中大量噬菌体
粒子沉淀下来，从而富集得到含外源基因产物的重组噬菌体。
噬菌体肽库与靶分子的相互作用
洗涤去未结合的或非特异性
结合的噬菌体
将特异性结合的噬菌体洗脱下来
三轮淘
选后，克隆测序
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优点
1.高通量的淘选 将靶标分子（抗体）固定在固相载体上，加入噬 菌体展示肽库，利用抗原-抗体的特异性亲和力将与抗体结合的噬菌体 吸附在固相载体上，不能结合的噬菌体仍在溶液中，可以通过洗涤去 除，再将特异结合的噬菌体洗脱下来，如此反复数轮扩增、淘选，即 可将有用的基因从多达百万以上的噬菌体克隆中分离出来
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局限性
1.双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内， 而许多蛋白间的相互作 用依赖于翻译后加工， 而这些反应在核内无法进行。另外有些蛋白的正确折叠 和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助， 这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体 蛋白等的研究。 2.酵母双杂交系统的一个重要的问题是“假阳性”。由于某些蛋白本身具有激活 转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用， 使DNA结合结构域杂交蛋白在 无特异激活结构域的情况下可激活转录，即自激活。 3.另外，某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域， 能与其他蛋白形成 稳定的复合物， 从而引起报告基因的表达， 产生"假阳性"结果。 4.外源蛋白对酵母菌的毒性作用
蛋白质相互作用
20160222
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酵母双杂交用于检测两种蛋白质之间的相互作用
酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始的认识，真核生物完 整的转录因子是由：DNA结合结构域（DNA-Binding domain，BD）和转录激 活结构域（transcription-activating domain，AD）构成的，它们是结构上可以 分开的、功能上相互独立的结构域，BD识别DNA上的特异序列，并使AD定位 于基因的上游，从而激活转录
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GST pull-down assay
其基本原理是将靶蛋白-GST（GST是谷胱甘肽巯基转移酶）融合蛋白亲和固化在 谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的 蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物 后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋 白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以 及体外转录翻译系统等方法获得。
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局限性
（1）在噬菌体展示过程中必须经过细菌转化、噬菌体包装，有的展示系统还 要经过跨膜分泌过程，这就大大限制了所建库的容量和分子多样性。 （2）不是所有的序列都能在噬菌体中获得很好的表达，蛋白质功能的实现是 一个复杂的过程，部分未折叠的蛋白在细菌中很容易被降解，因此，必须，很难示系统依赖于细胞内基因的表达，所以，一些对细胞有毒 性的分子如生物毒素分子，很难得到有效表达和展示。
单独的DNA结合域或转录激活域不能激活下游基因的转录，它们之间只有 通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能
它的基本原理是转录因子通过结合上游激活序列（UAS）启动下 游报告基因的转录
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通过因工程的方法，构建BD-X、AD-Y载体（X一般是已知启动子的下游构建了3 个报道基因——Ade，His，LacZ），可以通过营养缺陷筛选、X-α-gal显色和酵母 表型的改变来筛选或验证两个蛋白之间是否存在相互作用
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蛋白质芯片
原理是对固相载体进行特殊的化学处理，再将已知的蛋白分子产物固定 其上，根据这些生物分子的特性，捕获能与之特异性结合的待测蛋白经 洗涤、纯化，再进行确认和生化分析
它具有以下优点： 1. 直接用粗生物样品（血清、尿、体液）进行分析 2. 同时快速发现多个生物标记物 3. 具有高通量的验证能力 4.可以发现低丰度蛋白质 5. 在同一系统中集发现和检测为一体 特异性高 利用单克隆抗体芯片，可鉴 定未知蛋白质，以减少测定蛋白质序列的工作量。
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可替代方法： 免疫共沉淀 噬菌体表面展示 GST pull-down assay 蛋白质芯片
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免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）
是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的，用于研究蛋白质之间的相互 作用，这种方法也常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于 确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
其原理是： 当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质之间的相 互作用被保留了下来。如果用一种蛋白质的抗体免疫沉淀该蛋白，那么与 该蛋白在体内结合的另一种蛋白也能沉淀下来。
优点为： （1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态； （2）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
缺点为： （1）可能检测不到低亲和力的蛋白质－蛋白质相互作用； （2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有其它蛋白在中间起桥 梁作用；
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噬菌体表面展示(phage display technology)
将外源蛋白与噬菌体的衣壳蛋白融合表达，融合蛋白表达在病毒颗粒的 表面，而编码该融合子的DNA则位于病毒粒子内，使大量多肽与其DNA 编码序列之间建立了直接联系，使各种靶分子的多肽配体通过淘选得以 快速鉴定。
若X、Y相互作用，BD、AD间接连 接，AD靠近转录起始位点激活下 游报告基因的转录； 反之X、Y之间没有相互作用，报 告基因不表达
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优点
1. 双杂交技术不需尖端设备，几乎在任何实验室都可以实现 2.作用信号是在融合基因表达后， 在细胞内重建转录因子的作用而给出的， 省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。 3.检测在活细胞内进行， 可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。 4. 检测的结果可以是基因表达产物的积累效应， 因而可检测存在于蛋白质之 间的微弱的或暂时的相互作用。
2.易于纯化
重组噬菌体的纯化步骤简单、不要求昂贵的试剂与设
备。用于鉴定表位和受体所用的噬菌体载体为M13噬菌体。由于M13噬
菌体是温和型噬菌体，不裂解宿主菌，成熟的噬菌体可分泌到培养基中，
通过离心收集培养上清，再向其中加入沉淀剂即可将上清中大量噬菌体
粒子沉淀下来，从而富集得到含外源基因产物的重组噬菌体。
噬菌体肽库与靶分子的相互作用
洗涤去未结合的或非特异性
结合的噬菌体
将特异性结合的噬菌体洗脱下来
三轮淘
选后，克隆测序
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优点
1.高通量的淘选 将靶标分子（抗体）固定在固相载体上，加入噬 菌体展示肽库，利用抗原-抗体的特异性亲和力将与抗体结合的噬菌体 吸附在固相载体上，不能结合的噬菌体仍在溶液中，可以通过洗涤去 除，再将特异结合的噬菌体洗脱下来，如此反复数轮扩增、淘选，即 可将有用的基因从多达百万以上的噬菌体克隆中分离出来
.
局限性
1.双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内， 而许多蛋白间的相互作 用依赖于翻译后加工， 而这些反应在核内无法进行。另外有些蛋白的正确折叠 和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助， 这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体 蛋白等的研究。 2.酵母双杂交系统的一个重要的问题是“假阳性”。由于某些蛋白本身具有激活 转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用， 使DNA结合结构域杂交蛋白在 无特异激活结构域的情况下可激活转录，即自激活。 3.另外，某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域， 能与其他蛋白形成 稳定的复合物， 从而引起报告基因的表达， 产生"假阳性"结果。 4.外源蛋白对酵母菌的毒性作用
蛋白质相互作用
20160222
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酵母双杂交用于检测两种蛋白质之间的相互作用
酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始的认识，真核生物完 整的转录因子是由：DNA结合结构域（DNA-Binding domain，BD）和转录激 活结构域（transcription-activating domain，AD）构成的，它们是结构上可以 分开的、功能上相互独立的结构域，BD识别DNA上的特异序列，并使AD定位 于基因的上游，从而激活转录
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GST pull-down assay
其基本原理是将靶蛋白-GST（GST是谷胱甘肽巯基转移酶）融合蛋白亲和固化在 谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的 蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物 后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋 白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以 及体外转录翻译系统等方法获得。
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局限性
（1）在噬菌体展示过程中必须经过细菌转化、噬菌体包装，有的展示系统还 要经过跨膜分泌过程，这就大大限制了所建库的容量和分子多样性。 （2）不是所有的序列都能在噬菌体中获得很好的表达，蛋白质功能的实现是 一个复杂的过程，部分未折叠的蛋白在细菌中很容易被降解，因此，必须，很难示系统依赖于细胞内基因的表达，所以，一些对细胞有毒 性的分子如生物毒素分子，很难得到有效表达和展示。
单独的DNA结合域或转录激活域不能激活下游基因的转录，它们之间只有 通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能
它的基本原理是转录因子通过结合上游激活序列（UAS）启动下 游报告基因的转录
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通过因工程的方法，构建BD-X、AD-Y载体（X一般是已知启动子的下游构建了3 个报道基因——Ade，His，LacZ），可以通过营养缺陷筛选、X-α-gal显色和酵母 表型的改变来筛选或验证两个蛋白之间是否存在相互作用
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蛋白质芯片
原理是对固相载体进行特殊的化学处理，再将已知的蛋白分子产物固定 其上，根据这些生物分子的特性，捕获能与之特异性结合的待测蛋白经 洗涤、纯化，再进行确认和生化分析
它具有以下优点： 1. 直接用粗生物样品（血清、尿、体液）进行分析 2. 同时快速发现多个生物标记物 3. 具有高通量的验证能力 4.可以发现低丰度蛋白质 5. 在同一系统中集发现和检测为一体 特异性高 利用单克隆抗体芯片，可鉴 定未知蛋白质，以减少测定蛋白质序列的工作量。
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可替代方法： 免疫共沉淀 噬菌体表面展示 GST pull-down assay 蛋白质芯片
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免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）
是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的，用于研究蛋白质之间的相互 作用，这种方法也常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于 确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
其原理是： 当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质之间的相 互作用被保留了下来。如果用一种蛋白质的抗体免疫沉淀该蛋白，那么与 该蛋白在体内结合的另一种蛋白也能沉淀下来。
优点为： （1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态； （2）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
缺点为： （1）可能检测不到低亲和力的蛋白质－蛋白质相互作用； （2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有其它蛋白在中间起桥 梁作用；
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噬菌体表面展示(phage display technology)
将外源蛋白与噬菌体的衣壳蛋白融合表达，融合蛋白表达在病毒颗粒的 表面，而编码该融合子的DNA则位于病毒粒子内，使大量多肽与其DNA 编码序列之间建立了直接联系，使各种靶分子的多肽配体通过淘选得以 快速鉴定。
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蛋白质蛋白质相互作用ppt课件
个物种的蛋白质进行交互 Blast，即利用一个物种的一 个蛋白质对第二个物种的所有 蛋白质进行Blast，再将在第 二个物种中得到的E值最小的 蛋白质序列对第一个物种的所 有蛋白质进行Blast，如在第 一个物种中E值最小的蛋白质 是原来用来对第二个物种进行 Blast的蛋白质，则这两个蛋 白质互为直系同源蛋白质。
在应用中，通常利用三个物种 进行交互Blast以便更好地确 定直系同源蛋白质。
Org A, Protein1 Blast Org B, All proteins P2 with smallest E value
IleS-MG345- MJ0947
Org B, Protein2 Blast Org A, All proteins P1 with smallest E value
基因位点的上下文 基因临近
聚集
分散
基因融合 (Rosetta-Stone method )
电子双杂交
系统发育上下文
系统发生谱方法 系统树相近 (Mirror tree)
基因表达: mRNA共表达
.
20
一些重要的概念
Ortholog: 直系同源，是指不同物种中来自同一个 祖先的基因和蛋白质。
.
35
Mirror Trees Method
该方法的假设前提是：相互作用的蛋白可能是共进化的。方法是：计算包含
不同物种的蛋白质家族间的进化距离，构建各自相应的进化树，在进化树之间相
似性距离的基础上，构建镜像树，然后由镜像树之间的相似性距离和蛋白质在镜
像树上的位置确定蛋白质之间的两两相互作用。
.
36
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31
基因组临近/ 基因临近 (1)
在应用中，通常利用三个物种 进行交互Blast以便更好地确 定直系同源蛋白质。
Org A, Protein1 Blast Org B, All proteins P2 with smallest E value
IleS-MG345- MJ0947
Org B, Protein2 Blast Org A, All proteins P1 with smallest E value
基因位点的上下文 基因临近
聚集
分散
基因融合 (Rosetta-Stone method )
电子双杂交
系统发育上下文
系统发生谱方法 系统树相近 (Mirror tree)
基因表达: mRNA共表达
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20
一些重要的概念
Ortholog: 直系同源，是指不同物种中来自同一个 祖先的基因和蛋白质。
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35
Mirror Trees Method
该方法的假设前提是：相互作用的蛋白可能是共进化的。方法是：计算包含
不同物种的蛋白质家族间的进化距离，构建各自相应的进化树，在进化树之间相
似性距离的基础上，构建镜像树，然后由镜像树之间的相似性距离和蛋白质在镜
像树上的位置确定蛋白质之间的两两相互作用。
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36
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基因组临近/ 基因临近 (1)
DNA与蛋白质的相互作用-生化课件
NA的普遍性结合 中DNA的特点
蛋白质与DNA主链骨架接触，大多数涉 及磷酸二酯键中的氧原子。 与DNA碱基序列特异性无关 结构的匹配性： 旋转对称性 特定距离的相反电荷 形成氢键基团排布上的匹配 形成足够大的范德华力
Pr-DNA特异性结合中DNA的特点
大沟内存在特异性识别信息 氨基酸与碱基对共平面 氨基酸和碱基对之间形成氢键
经典举例
• 操纵子（operon）：是指原核生物中由一个或多个相关 基因以及转录翻译调控元件组成的基因表达单元。 • 启动子（promoter）：与基因表达启动相关的顺式作用 元件，是结构基因的重要成分。它是一段位于转录起始位 点5’端上游区大约100~200bp以内的具有独立功能的DNA 序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地相结 合并具有转录起始的特异性。 • RNA聚合酶（polymerase）：以一条DNA链或RNA为模 板催化由核苷-5′-三磷酸合成RNA的酶。是催化以DNA为 模板（template）、三磷酸核糖核苷为底物、通过磷酸二 酯键而聚合的合成RNA的酶。因为在细胞内与基因DNA 的遗传信息转录为RNA有关，所以也称转录酶。
• 催化转录的RNA聚合酶是一种由多个蛋白亚基组 成的复合酶。全酶（holoenzyme）的组成是 α2ββ’δ。α亚基与RNA聚合酶的四聚体核心 （α2ββ’）的形成有关；β亚基含有核苷三磷酸的 结合位点；β’亚基含有与DNA模板的结合位点； 而Sigma因子只与RNA转录的起始有关，与链的 延伸没有关系，一旦转录开始，δ因子就被释放， 而链的延伸则由四聚体核心酶（core enzyme） 催化。所以，δ因子的作用就是识别转录的起始 位置，并使RNA聚合酶结合在启动子部位。
两个概念
• 顺式作用元件（cis-acting element）：存在于 基因旁侧序列中能够影响基因表达的序列，包括 启动子、增强子、调控序列和可诱导元件等。其 本身不编码任何蛋白质，它仅仅提供一个作用位 点，与反式作用因子相互作用参与基因表达调控。 • element反式作用因子（trans-acting ）：指能 直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元件核 心序列上参与调控靶蛋白基因转录效率的蛋白质。
蛋白质与DNA主链骨架接触，大多数涉 及磷酸二酯键中的氧原子。 与DNA碱基序列特异性无关 结构的匹配性： 旋转对称性 特定距离的相反电荷 形成氢键基团排布上的匹配 形成足够大的范德华力
Pr-DNA特异性结合中DNA的特点
大沟内存在特异性识别信息 氨基酸与碱基对共平面 氨基酸和碱基对之间形成氢键
经典举例
• 操纵子（operon）：是指原核生物中由一个或多个相关 基因以及转录翻译调控元件组成的基因表达单元。 • 启动子（promoter）：与基因表达启动相关的顺式作用 元件，是结构基因的重要成分。它是一段位于转录起始位 点5’端上游区大约100~200bp以内的具有独立功能的DNA 序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地相结 合并具有转录起始的特异性。 • RNA聚合酶（polymerase）：以一条DNA链或RNA为模 板催化由核苷-5′-三磷酸合成RNA的酶。是催化以DNA为 模板（template）、三磷酸核糖核苷为底物、通过磷酸二 酯键而聚合的合成RNA的酶。因为在细胞内与基因DNA 的遗传信息转录为RNA有关，所以也称转录酶。
• 催化转录的RNA聚合酶是一种由多个蛋白亚基组 成的复合酶。全酶（holoenzyme）的组成是 α2ββ’δ。α亚基与RNA聚合酶的四聚体核心 （α2ββ’）的形成有关；β亚基含有核苷三磷酸的 结合位点；β’亚基含有与DNA模板的结合位点； 而Sigma因子只与RNA转录的起始有关，与链的 延伸没有关系，一旦转录开始，δ因子就被释放， 而链的延伸则由四聚体核心酶（core enzyme） 催化。所以，δ因子的作用就是识别转录的起始 位置，并使RNA聚合酶结合在启动子部位。
两个概念
• 顺式作用元件（cis-acting element）：存在于 基因旁侧序列中能够影响基因表达的序列，包括 启动子、增强子、调控序列和可诱导元件等。其 本身不编码任何蛋白质，它仅仅提供一个作用位 点，与反式作用因子相互作用参与基因表达调控。 • element反式作用因子（trans-acting ）：指能 直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元件核 心序列上参与调控靶蛋白基因转录效率的蛋白质。
DNA蛋白质的相互作用
同细胞蛋白质提取物一道温育，形成DNA-蛋白质 复合物。 将它加样到非变性的聚丙烯酰胺凝胶中，进行电 泳分离。 应用放射自显影技术显现具放射性标记的DNA条 带位置
不存在与DNA结合的蛋白质时 存在与DNA结合的蛋白质时
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5
凝胶阻滞试验不仅可以用来鉴定在特殊类 型细胞的提取物中，是否存在着能够同某 一特定DNA片段结合的蛋白质分子(比如特 异的转录因子等)，而且还可以用来研究发 生此种结合作用之精确的DNA序列的特异 性
超量的非标记的竞争DNA (competitor DNA ）
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6
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7
材料及试剂：
2X结合缓冲液：
20 mM Tris pH 7.5 、100 mM NaCl、2 mM EDTA、10% 甘油、
poly(dI-dC) ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ5 mg/ml in TE)、 . 酵母单杂交技术广泛用DNA与蛋白相互作 用的研究。
1 原理： 在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA朝正电 极移动的距离与其分子量的对数成反比。 如果此时DNA分子与某种蛋白质结合， 由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞 在特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相应缩短了。
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4
2 主要步骤及内容： 制备探针DNA （P32放射性同位素标记DNA）
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9
如果在电泳时结合DNA化学测序，则可准确判断出结合区 的精确序列。
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10
三、甲基化干扰试验
根据DMS （二甲基亚蓝）能使G残基甲基化， 而六氢吡啶又能够特异切割甲基化的G残基这一原理而设计
不存在与DNA结合的蛋白质时 存在与DNA结合的蛋白质时
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5
凝胶阻滞试验不仅可以用来鉴定在特殊类 型细胞的提取物中，是否存在着能够同某 一特定DNA片段结合的蛋白质分子(比如特 异的转录因子等)，而且还可以用来研究发 生此种结合作用之精确的DNA序列的特异 性
超量的非标记的竞争DNA (competitor DNA ）
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7
材料及试剂：
2X结合缓冲液：
20 mM Tris pH 7.5 、100 mM NaCl、2 mM EDTA、10% 甘油、
poly(dI-dC) ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ5 mg/ml in TE)、 . 酵母单杂交技术广泛用DNA与蛋白相互作 用的研究。
1 原理： 在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA朝正电 极移动的距离与其分子量的对数成反比。 如果此时DNA分子与某种蛋白质结合， 由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞 在特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相应缩短了。
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2 主要步骤及内容： 制备探针DNA （P32放射性同位素标记DNA）
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如果在电泳时结合DNA化学测序，则可准确判断出结合区 的精确序列。
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三、甲基化干扰试验
根据DMS （二甲基亚蓝）能使G残基甲基化， 而六氢吡啶又能够特异切割甲基化的G残基这一原理而设计
蛋白质相互作用
荧光共振能量转移 (FRET)
原理：FRET在蛋白质相互作用研究的 基本原理是分别将bait蛋白、prey蛋 白与相应的供体荧光基团(如ECFP)和 受体荧光基团(如 EYFP)融合
优点：能检测到瞬时、较弱的蛋白质 相互作用；能同时检测到两蛋白的细 胞分布和作用位点。 缺点：光谱可能存在重叠，影响实验 结果
Interaction Domain-Structral basis for protein interaction
相互作用区域是蛋白质相互作用的结构基础
1. PDZ结构域
2. LIM结构域
Interaction Domain-Structral basis for protein interaction
免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation, Co-IP)
原理：利用抗体和抗原之间 特异性的识别和结合，通过亲 和纯化，分离出抗原蛋白和单 克隆抗体。 优点：保留蛋白质的修饰 和结合状态，同时所需的样本 量较少。 缺点：Co-IP特异性较低
双分子荧光互补 ( BiFC)
原理 ：将荧光蛋白分成两个无独 立功能的片段，分别与 bait 蛋白和 prey 蛋白融合表达。 优点：能简单方便地通过观察荧 光鉴定蛋白质相互作用 缺点：不能实时反应蛋白质的结 合和分离情况。
临界值内。如果两个结构域中至少有五个原子的距离在 5 Å 之内，那么这两个结构域之间存在相互作用。
Full Atom Contact (FAC) PSIMAP 方法 Sampled Atom Contact (SAC) PSIMAP
最精确
节约时间和搜索空间
Bounding Box Contact (BBC) PSIMAP
9
最新蛋白质分子间的相互作用教学讲义ppt
tran s fo rm e d yeast
X
yeast plasmid expression vector
predator
unknow
tis s u e
b a it
predator
X
Y
does X bind with a protein?
to ta l m R N A re v e rs etra n s c rip ta s e
DNAb in d in g d o m a in transfection
yeast plasmid expression vector
b a it
predator
X
Y
does X bind with a protein?
tran s fo rm e d yeast
X
W e ' l l s t a r t b y m a k i n g t r a n s f o r m e d y e a s t e x p r e s s i n g X
cDNAforX
DNAb in d in g d o m a in transfection
tran s fo rm e d yeast
X
yeast plasmid expression vector
tran s fo rm e d yeast
?Y
predator
unknow
tis s u e
b a it
• 3，细菌的抗药性
• AcrA, AcrB, Tol C • 乙酰螺旋霉素抗性
三，生物学对蛋白质相互作用 的研究方法
• 1，突变体系列和互补测验（遗传学）
•
突变体
X
yeast plasmid expression vector
predator
unknow
tis s u e
b a it
predator
X
Y
does X bind with a protein?
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DNAb in d in g d o m a in transfection
yeast plasmid expression vector
b a it
predator
X
Y
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DNAb in d in g d o m a in transfection
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X
yeast plasmid expression vector
tran s fo rm e d yeast
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b a it
• 3，细菌的抗药性
• AcrA, AcrB, Tol C • 乙酰螺旋霉素抗性
三，生物学对蛋白质相互作用 的研究方法
• 1，突变体系列和互补测验（遗传学）
•
突变体
蛋白质相互作用PPT课件
蛋白质组学是应用各种技术研究蛋白质组 的一门新兴科学。
其目的是从整体的角度分析细胞内动态变 化的蛋白质组分、表达水平与修饰状态， 了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示 蛋白质功能与细胞生命活动规律。
9. 3 蛋白质相互作用网络
蛋白质的相互作用(PPI, Protein-protein interaction)是指蛋白质分子之间的相关性， 并从生物化学、信号转导和遗传网络的角 度研究这种相关性。
有一些蛋白质可以以单体 的形式发挥作用，但是大 部分的蛋白质都是和伴侣 分子或是与其他蛋白质一 起发挥作用的。
基因组计划--大量的新基因不断被发现，然而单纯的 基因组DNA序列尚不能解答许多生命问题。基因是相对静 态的，而基因编码的产物—蛋白质则是动态的，具有时空 性和调节性，是生物功能的主要体现者和执行者。蛋白质 的表达水平、存在方式以及相互作用等直接与生物功能相 关。
抵御外来细菌和病毒的抗体及免疫类物质，当蛋白质充足时， 一旦需要这些抗体和免疫物质在数小时内就可以增加数百倍。
参与细胞的信号转导，调控细胞的发育和凋亡，及至生物体的 命运。
形成生物体的渗透压，引发生物体的各种活动，例如肌肉的做 功等。
3.运输载体
蛋白质是生物体内很多重要的代谢物和营养素的载体。 氧、脂类、维生素、矿物质与微量元素都需要利用各种蛋白质运输到
5. 生物分子网络具有度的负关联 性
度的负关联性；
具有度大的节点趋向于连接度小的节点的特点
在蛋白质相互作用的网络中：
度非常大的蛋白质节点不直接相连 与度比较小的蛋白质节点相连接
6.生物分子网络具有一定的鲁棒性和适应性
生物分子网Biblioteka 具有鲁棒性： 即对于外界环境的变化或者内部个体之间的不相容有着一定的 承受能力，这与生物分子网络无标度的拓扑性质息息相关。拥 有不同度值的节点对移除表型的影响差异很大。当移除网络中 的多数非关键节点基因时，几乎没有明显的表型影响。
蛋白质与蛋白质作用
与G蛋白偶联的受体作用机理：
G-蛋白 的两种 构象 配体 + 受体 （-GDP） 非活化型
配体-受体复合物
（-GTP） + 活化型
GDP
配体-受体
（复合物）
GDP Pi
GTP
G蛋 白 循 环 示 意 图
效应分子：
腺苷酸环化酶
（adenylate cyclase, AC） 磷脂酰肌醇磷脂酶C （phosphatedyl inositol phospholipase, PI-PLC）
一、受体的分类、一般结构及功能
膜受体 —— 位于细胞质膜
胞内受体 —— 位于细胞浆和细胞核中
（一）膜受体
1、环状受体
配体依赖性离子通道（配体门控离子通道），
主要受神经递质的信息物质直接调节。
在神经冲动的快速传递中起作用。
2、七个跨膜 -螺旋受体（ 蛇型受体，serpentine
receptor） —— G-蛋白偶联受体 （1）结构：
1、维持染色质的结构稳定 2、对特定基因起阻遏作用——关闭基因 一、DNA与支架蛋白（原核） 支架蛋白与DNA结合后使染色体保持紧密状态。 二、DNA与蛋白质（真核） 染色体中DNA与蛋白质结合构成核小体 核小体中的蛋白质 组蛋白（Histone）：N端富含碱性氨基酸，C端富含酸性氨 基酸，共5种。 非组蛋白（Nohistone）：不均一，有种属和器官特异性
FGF——成纤维细胞生长因子
（2）非催化型受体 该类受体缺乏内在酶活性，但与配体
结合后可引起其同源二聚体形成，与酪氨酸
蛋白激酶偶联而表现激酶的活性。
（二）、胞内受体
由400-1000个残基组成的单体蛋白，多为反式作用因子。
蛋白质互作
SH2结构域
约100个氨基酸序列，识别磷酸化的酪氨 酸及相邻的3-6个氨基酸残基。
SH3结构域
由50个氨基酸残基组成，存在于各种蛋 白激酶和衔接蛋白中，识别富含脯氨酸 的序列R/KXXPXXP或PXXPXR/K，其亲和力 与脯氨酸残基及相邻氨基酸残基组成相 关。
PH结构域
100-120个氨基酸残基组成，存在于多种 细胞骨架蛋白，蛋白激酶、PLC超家族中。
兼具结合脂类和蛋白质的能力，参与细 胞信号转导。
WW结构域
30-40个氨基酸残基组成的三股反平行β 片层结构域，含两个高度保守的色氨酸 WW而得名，识别富含脯氨酸的序列XPPXY， 参与非受体信号转导、转录调节和蛋白 质降解等过程。
PDZ结构域
由80-100个氨基酸残基组成，包含2个 α-螺旋和6个β-折叠，常以串联重复拷 贝存在，是构成支架蛋白的重要结构， 在细胞膜蛋白质的聚集中发挥重要作用。
结构域是蛋白质中折叠较为紧密且具有 一定功能的球状和纤维状的结构，以模 块方式具有多种不同功能的分子。
蛋白质相互作用结构域专指那些可以识 别其他蛋白质的特殊结构，从而介导两 个蛋白之间发生相互作用的结构域，一 般由50-100个氨基酸组成。
结构域结构域相互作用 结构域-肽段模体相互作用
protein2) SH3-SH2-SH3 NCK(noncatalytic region of tyrosine
kinase) SH3-SH3-SH3-SH2 Scaffold protein JIP-1(JNK-interacting protein1)
PPI 研究的医学意义
PPI异常可导致细胞活动失控
相互作用能力的丧失可丧失原有的正常调节。 突变也可产生新的相互作用。
蛋白质相互作用ppt课件
8
• 从蛋白质相互作用到生物学功能。运用蛋白 质直接相互作用，发现相互作用蛋白质，再 分析这些作用的生物学意义。
容易犯的错误：研究一大堆的蛋白相互作用， 却不知道这些相互作用有什么生物学意义。
• 从物学功能到蛋白质相互作用。通过改变生 物学现象，分析蛋白质间的遗传相互作用， 进一步研究相关蛋白质的相互作用。
精选课件PPT
18
Affinity interaction（亲和作用）
GST pull down：已知蛋白质和GST融合，与细胞或 组织的“蛋白质汤”混合，用谷胱甘肽亲和层析分离 和已知蛋白质结合的新蛋白质。GST tag。
Biotin－Avidin结合：Biotin标记已知蛋白质，通过 Avidin结合biotin标记的蛋白质，从而得到与biotin 标 记蛋白结合的新蛋白质。优点是biotin－avidin的结 合是最牢靠的；缺点是细胞内结合biotin的蛋白质很 多。
1
2
3
1. 抗体很差， 2. Western blot问题 3. Loading比例不对 4. 样品太多 5. 正确
4
5
精选课件PPT
17
蛋白质-蛋白质直接相互作用
•Co-immunoprecipitation and antigen-antibody interaction（免疫共沉淀和抗原抗体结合） •Affinity interaction（亲和作用） •Yeast two-hybrid and phage display（酵母双 杂交和噬菌体展示） •Surface Plasmon Resonance •FRET •Proteomic analysis（蛋白质组学技术）
寻找受体的配体 7肽：8x1016
蛋白质的相互作用研究方法课件.ppt
蛋白质的相互作用研究方法课件
四、Bimolecular Fluorescent Complementation
蛋白质的相互作用研究方法课件
蛋白质的相互作用研究方法课件
五、Yeast Two－Hybrid Systerm
蛋白质的相互作用研究方法课件
1.原理 酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真
蛋白质的相互作用研究方法课件
蛋白质的相互作用研究方法课件
2008年诺贝尔化学奖
蛋白质的相互作用研究方法课件
GFP主要应用: • 对活细胞中的蛋白质进行准确定位及动态观察
可实时原位跟踪特定蛋白在细胞生长、分裂、分化过 程中或外界刺激因子的作用下的时空表达, 如某种转录因 子的核转位、蛋白激酶C的膜转位等。
GFP基因与分泌蛋白基因连接后转染细胞, 可动态观察 该分泌蛋白分泌到细胞外的过程
GFP基因与定位于某一细胞器特殊蛋白基因相连,就能 显示活细胞中细胞核、内质网、高尔基体、线粒体等细胞 器的结构及病理过程。
膜蛋白的移动 （Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP ） • 蛋白之间的相互作用（FRET） • 报告分子 将GFP的基因连在特殊的启动子的后面，可以检 测基因表达的时间和部位。
容易检测 分子量小
Douglas Prasher was the 不需要其它底物
first person to realize the potential of GFP as a tracer molecule.
Douglas Prasher 1992 克隆了GFP基 因
蛋白质的相互作用研究方法课件
核基因转录调控中建立。 典型的真核生长转录因子， 如GAL4、GCN4、
四、Bimolecular Fluorescent Complementation
蛋白质的相互作用研究方法课件
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五、Yeast Two－Hybrid Systerm
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1.原理 酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真
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2008年诺贝尔化学奖
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GFP主要应用: • 对活细胞中的蛋白质进行准确定位及动态观察
可实时原位跟踪特定蛋白在细胞生长、分裂、分化过 程中或外界刺激因子的作用下的时空表达, 如某种转录因 子的核转位、蛋白激酶C的膜转位等。
GFP基因与分泌蛋白基因连接后转染细胞, 可动态观察 该分泌蛋白分泌到细胞外的过程
GFP基因与定位于某一细胞器特殊蛋白基因相连,就能 显示活细胞中细胞核、内质网、高尔基体、线粒体等细胞 器的结构及病理过程。
膜蛋白的移动 （Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP ） • 蛋白之间的相互作用（FRET） • 报告分子 将GFP的基因连在特殊的启动子的后面，可以检 测基因表达的时间和部位。
容易检测 分子量小
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Douglas Prasher 1992 克隆了GFP基 因
蛋白质的相互作用研究方法课件
核基因转录调控中建立。 典型的真核生长转录因子， 如GAL4、GCN4、