全基因组重测序
基因组重测序
基因组重测序背景介绍 全基因组重测序，是对基因组序列已知的个体进行基因组测序，并在个体或群体水平上进行差异性分析的方法。
与已知序列比对，寻找单核苷酸多态性位点（SNP ）、插入缺失位点（InDel ，Insertion/Deletion ）、结构变异位点（SV ，Structure Variation ）位点及拷贝数变化(CNV) 。
可以寻找到大量基因差异，实现遗传进化分析及重要性状候选基因的预测。
涉及临床医药研究、群体遗传学研究、关联分析、进化分析等众多应用领域。
随着测序成本的大幅度降低以及测序效率的数量级提升，全基因组重测序已经成为研究人类疾病及动植物分子育种最为快速有效的方法之一。
利用illumina Hiseq 2000平台，将不同插入片段文库和双末端测序相结合，可以高效地挖掘基因序列差异和结构变异等信息，为客户进行疾病研究、分子育种等提供准确依据。
重测序的两个条件：（1）该物种基因组序列已知；（2）所测序群体之间遗传性差异不大（ >99% 相似度 ）在已经完成的全基因组测序及其基因功能注释的基础上，采用全基因组鸟枪法（WGS ）对DNA 插入片段进行双末端测序。
技术路线生物信息学分析送样要求1.样品总量：每次样品制备需要大于5ug 的样品。
为保证实验质量及延续性，请一次性提供至少20ug的样品。
如需多次制备样品，按照制备次数计算样品总量。
2.样品纯度：OD值260/280应在1.8～2.0 之间；无蛋白质、RNA或肉眼可见杂质污染。
3.样品浓度：不低于50 ng/μL。
4.样品质量：基因组完整、无降解，电泳结果基因组DNA主带应在λ‐Hind III digest 最大条带23 Kb以上且主带清晰，无弥散。
5.样品保存：限选择干粉、酒精、TE buffer或超纯水一种，请在样品信息单中注明。
6.样品运输：样品请置于1.5 ml管中，做好标记，使用封口膜封好；基因组DNA如果用乙醇沉淀，可以常温运输；否则建议使用干冰或冰袋运输，并选择较快的运输方式。
全基因组重测序数据分析详细说明
全基因组重测序数据分析详细说明全基因组重测序（whole genome sequencing, WGS）是一种高通量测序技术，用于获取个体的整个基因组信息。
全基因组重测序数据分析是指对这些数据进行处理、分析和解读，以获得有关个体的遗传变异、基因型、表达和功能等信息。
下面详细说明全基因组重测序数据分析的过程和方法。
首先，全基因组重测序数据的质量控制是必不可少的。
这一步骤包括对测序数据进行质量评估、剔除低质量序列，并进行去除接头序列和过滤序列等预处理操作，以确保后续分析的准确性和可靠性。
接下来，需要对全基因组重测序数据进行序列比对，将读取序列与参考基因组进行比对，以确定每个读取序列在参考基因组上的位置。
常用的比对工具包括Bowtie、BWA、BLAST等。
比对的结果将提供每个读取序列的基因组位置信息。
在序列比对完成后，就可以进行个体的变异检测。
变异检测的目的是识别个体的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms, SNPs）、插入缺失变异（insertions/deletions, indels）和结构变异（structural variations, SVs）等基因组变异。
通常，变异检测分为两个步骤：变异发现和变异筛选。
变异发现即根据比对结果，通过一定的算法和统计学原理，找到潜在的变异位点。
然后，利用临床数据库、已知变异数据库和基因功能注释数据库等，进行变异筛选，剔除假阳性和无功能变异，筛选出最有可能的致病变异。
接着，对筛选出的变异位点进行基因型確定。
基因型的确定可以通过直接从比对结果中读取碱基信息，或者通过再次测序来获取高度精确的基因型，以获得更可靠的变异信息。
随后，对变异位点进行注释和功能预测。
注释是指对变异位点进行功能和可能影响的基因、基因组区域和调控元件等进行注释。
常用的注释工具包括ANNOVAR、SnpEff、VEP等。
功能预测则是根据变异位点的位置和可能影响的功能进行预测，如是否影响蛋白质功能、是否在编码序列、是否在启动子或增强子区域等。
全基因组重测序技术的原理与进展
全基因组重测序技术的原理与进展全基因组重测序技术（Whole Genome Sequencing，WGS）是一种高通量的DNA序列分析技术，它可以检测出基因组中所有的DNA序列，包括基因及非编码区域的DNA序列，从而得到生物体的完整基因组信息。
全基因组重测序技术的应用范围极广，涵盖了医学、农业、生态、进化等领域。
全基因组重测序技术的原理是通过高通量测序技术对DNA样本进行多次、高精度的测序，将测序结果进行拼接处理，从而得到基因组的完整DNA序列。
目前常见的高通量测序技术包括Illumina、PacBio、ONT等，它们各自有优势和不足。
其中Illumina技术常用于重测序主流的生物体基因组，所需测序的覆盖度较高； PacBio和ONT均具有较长的单次读长，对于检测基因组中较长的插入或缺失变异等具有一定优势。
此外，针对富集序列的RNA测序技术也可以用于特定基因的全基因组重测序。
全基因组重测序技术的应用范围极广。
在医学领域，全基因组重测序技术被广泛应用于遗传病和肿瘤研究，可用于检测基因突变、引起复杂疾病的复杂基因组变异、疾病个体间的基因表达差异。
在农业领域，全基因组重测序技术可用于育种改良、农药研发、疫苗疾病预测和品种鉴定等。
在生态系统学与进化生物学研究中，全基因组重测序技术可用于物种间基因组比较、种群遗传学研究、进化历程研究等。
在全基因组重测序技术的基础上，个性化基因组医学逐渐发展。
通过对人类的基因组进行全基因组重测序，可以获得具体人群的基因突变情况和遗传倾向，从而进行个性化的病症预测和治疗方案设计，这在未来可能成为临床诊疗工具的一部分。
全基因组重测序技术的快速发展，也催生了大量为全基因组重测序应用领域所开发出的生物信息学工具。
生物信息学工具对于全基因组重测序技术的应用至关重要，它们可以对高通量测序数据进行高效准确地解析，分析复杂的基因组变异，对基因功能进行详细分析，从而推动基因组学领域的快速发展。
全基因组重测序数据分析
全基因组重测序数据分析1. 数据质量控制：对测序数据进行质量控制，包括去除低质量的碱基、过滤含有接头序列和接头污染的序列等。
这一步骤可以使用各种质控工具，例如FastQC、Trim Galore等。
2. 比对到参考基因组：将经过质控的测序数据与参考基因组进行比对。
参考基因组一般是已知的物种的基因组序列，在人类研究中通常使用人类参考基因组。
比对工具主要有BWA、Bowtie等。
3. 变异检测：从比对结果中检测出样本与参考基因组之间的差异，称为变异检测。
这包括单核苷酸变异（SNV）、插入/缺失（Indel）、结构变异（SV）等。
常用的变异检测工具有GATK、SAMtools、CNVnator等。
4. 注释和解读：对检测到的变异进行注释和解读，以确定其对基因功能和疾病相关性的影响。
注释可以包括基因、转录本、蛋白质功能、通路、疾病关联等信息。
常用的注释工具包括ANNOVAR、Variant Effect Predictor等。
5.结果可视化：将分析结果以图表或图形的形式展示出来，以便研究人员更好地理解和解释结果。
常用的可视化工具包括IGV、R软件等。
除了上述步骤，全基因组重测序数据分析还可以应用于其他研究领域，例如种群遗传学、复杂疾病研究、药物研发等。
在进行这些研究时，可能还需要其他分析方法和工具来完成特定的研究目标。
总之，全基因组重测序数据分析是一个复杂而关键的过程，它可以帮助研究人员了解个体的基因组特征，并揭示与疾病发生和发展相关的重要信息。
在不断发展的测序技术和分析方法的推动下，全基因组重测序数据分析将在基因组学领域中发挥越来越重要的作用。
全基因组重测序技术在疾病诊断中的应用
全基因组重测序技术在疾病诊断中的应用引言：全基因组重测序（whole-genome sequencing，WGS）是一项先进的技术，可以对个体的整个基因组进行高通量、高分辨率的测序。
随着测序技术的不断发展和成本的降低，全基因组重测序已经成为许多疾病诊断和治疗中的重要工具。
本文将探讨全基因组重测序技术在疾病诊断中的应用。
一、儿童遗传性疾病的诊断儿童遗传性疾病是指由遗传突变引起的各种罕见疾病。
由于这些疾病表现复杂多样，单一基因突变引起不同临床表型，传统方法很难准确诊断。
而全基因组重测序技术可以快速而精确地鉴定突变位点，并了解患者携带的致病变异情况。
通过对家系及相关资料进行综合分析，可以更精准地判断是否为染色体异常或单基因突变所致，从而为儿童遗传性疾病的诊断提供更准确的依据。
二、肿瘤基因组学研究全基因组重测序技术在肿瘤基因组学研究中具有重要意义。
肿瘤是由一系列DNA 突变和表观遗传异常引起的复杂疾病，因此了解患者的个体基因组信息对精准治疗至关重要。
全基因组重测序可以检测出肿瘤样本中所有突变位点，包括常见和罕见变异，在进一步分析突变驱动机制、变异负荷以及预后评估方面有着不可替代的作用。
此外，全基因组重测序技术还可以帮助发现新型靶向治疗标志物，并指导个性化治疗方案的制定。
三、个体化药物治疗随着全基因组重测序技术的应用，越来越多的医生开始使用“个体化药物治疗”来提高治愈率和降低患者副作用。
通过对患者进行基因组测序并与已经积累的大量数据库进行比对，可以预测疾病和药物反应的关联。
在使用特定药物之前，医生可以预测药物是否有效、是否会引起不良反应，并据此制定个体化的治疗方案。
这种精确的用药策略可以提高治疗效果，减少药物副作用，使患者获得更好的治疗结果。
四、遗传性疾病筛查与婚姻匹配全基因组重测序技术还可以应用于遗传性疾病筛查和婚姻匹配中。
通过对患者进行基因组测序，可以及早发现致病基因突变，并向有关人士提供相关信息以指导受孕决策。
动植物全基因组重测序简介
全基因组重测序是对已知基因组序列的物种进行不同个体的基因组测序，并在此基础上对个体或群体进行差异性分析。
基于全基因组重测序技术，人们可以快速进行资源普查筛选，寻找到大量遗传变异，实现遗传进化分析及重要性状候选基因的预测。
随着测序成本降低和拥有参考基因组序列物种增多，全基因组重测序成为动植物育种和群体进化研究迅速有效的方法。
简化基因组测序技术是对与限制性核酸内切酶识别位点相关的DNA进行高通量测序。
RAD-seq（Restriction-site Associated DNA Sequence）和GBS （Genotyping-by-Sequencing）技术是目前应用最为广泛的简化基因组技术，可大幅降低基因组的复杂度，操作简便，同时不受参考基因组的限制，可快速鉴定出高密度的SNP位点，从而实现遗传进化分析及重要性状候选基因的预测。
简化基因组技术尤其适合于大样本量的研究，可以为利用全基因组重测序技术做深度信息挖掘奠定坚实的基础。
全基因组重测序和简化基因组测序技术可广泛应用于变异检测、遗传图谱构建、功能基因挖掘、群体进化等研究，具有重大的科研和产业价值。
产品脉络图。
全基因组重测序
比对情况：
双端序列比对到一条染色体上
双端序列比对到不同染色体上
单端序列比对上，另一端未比对上
软件 SOAP Maq BWA Bowtie NovoAlign Subread
发表年代 2008 2008 2009 2009 2009 2013
双端序列均未比对上
PMID 18227114 18714091 19451168 19261174
CODON_CHANGE_PLUS_CODON_DELETION 非密码子边界上的3的整数倍的删除
CODON_CHANGE_PLUS_CODON_INSERTION 非密码子边界上的3的整数倍的插入
STOP_GAINED STOP_LOST Other
终止密码子获得
终止密码子丢失 由于gff文件中基因信息不完整/错误而无法得到准 确的判断
两个基本特征：可遗传性和可识别性 某种生物的任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记。
形态标记
• 株高、穗形、粒色或芒毛等外部形态特征的 相对差异。
细胞学标记 • 染色体核型（染色体数目、结构、随体有无、 着丝粒位置等）和带型（C带、N带、G带等） 的变化。
生化标记 • 基因表达产物——同工酶、等位酶等的差异。
基因间区 基因内（无转录本信息） 内含子 基因上游区域(5K以内) 基因下游区域(5K以内) 基因的5’UTR内 基因的3’UTR内 剪切受体突变(exon前2bp内) 剪切供体突变(exon后2bp内) 起始密码子丢失 移码突变(非3的整数倍插入或删除) 密码子删除(3的整数倍) 整个外显子被删除 密码子插入(3的整数倍)
同义/非同义突变
同义突变(synonymous mutation)：
全基因组重测序家系样本研究思路
全基因组重测序家系样本研究思路全基因组重测序家系样本研究是一种通过对家系成员进行全基因组重测序分析，来研究遗传变异在家系中的传递和影响的方法。
下面是一个可能的研究思路：1. 家系样本选择：选择一个包含父母和子女的家庭样本，确保样本之间有明确的亲缘关系。
2. DNA提取和测序：从每个家庭成员的血液或唾液样本中提取DNA，并进行全基因组重测序。
可以使用高通量测序技术，如Illumina HiSeq平台。
3. 数据预处理：对测序数据进行质量控制和剔除低质量的序列，然后进行比对，将测序reads与参考基因组序列进行比对。
4. 变异检测和注释：使用生物信息学工具对比对后的测序数据进行变异检测，包括单核苷酸变异（SNV）、插入缺失（InDel）和结构变异（SV）。
然后对检测到的变异进行注释，包括功能注释、遗传变异数据库查询等。
5. 变异过滤和筛选：根据研究目的和家系特点，进行变异过滤和筛选。
可以根据变异的频率、功能、致病性等进行筛选，以确定与家系特征相关的变异。
6. 遗传分析：通过对家系成员的变异数据进行遗传分析，可以分析遗传变异在家系中的传递模式，如常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传或X连锁遗传等。
7. 功能分析和富集分析：对筛选出的变异进行功能分析，可以使用生物信息学工具预测变异的功能影响，如影响蛋白结构或功能。
此外，还可以进行富集分析，探索变异富集在哪些功能通路或生物学过程中。
8. 结果分析和解释：根据遗传分析和功能分析的结果，对家系样本中的遗传变异进行解释，探索与家系特征相关的遗传因素。
9. 结果验证和进一步研究：根据家系样本的研究结果，可以选择一些候选变异进行验证，如通过Sanger测序验证变异的存在。
此外，还可以进一步扩大样本规模，进行更大范围的家系样本研究。
全基因组重测序家系样本研究可以帮助我们深入了解遗传变异在家系中的传递和影响，为研究遗传性疾病和个体遗传特征提供重要的基因组学数据。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
WGS原理目录分子标记与DNA变异全基因组重测序—实验全基因组重测序—分析全基因组重测序—应用遗传标记遗传标记是指在遗传分析上用作标记的基因，也称为标记基因。
形态学标记细胞学标记生物化学标记免疫学标记分子标记遗传标记（genetic marker）概念:指可追踪染色体、染色体某一节段、某个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性。
两个基本特征：可遗传性和可识别性某种生物的任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记。
•株高、穗形、粒色或芒毛等外部形态特征的相对差异。
形态标记 •染色体核型（染色体数目、结构、随体有无、着丝粒位置等）和带型（C 带、N 带、G 带等）的变化。
细胞学标记•基因表达产物——同工酶、等位酶等的差异。
生化标记•核苷酸序列的差异分子标记◆多态性（Polymorphism）——－群体内同一DNA序列的两种或多种变异形式，统计表明：群体内任何两个生物个体平均每1000～10000个碱基对有一对有差别，这种差别就是多态性。
◆突变（Mutation）——指DNA水平的可遗传的变异，不管这种DNA变异能不能导致可检测的表型或生化改变。
突变产生的变异是自然选择的基础。
可遗传的突变在群体中扩散从而产生多态性。
●以个体间核苷酸序列变异为基础的遗传标记●是 DNA 水平遗传多态性的直接反映●能直接反映生物个体或种群间基因组DNA间的差异1.直接以DNA的形式表现，不受组织、发育阶段、季节、环境等因素的限制，不存在表达与否等问题，表现稳定2.数量极多，遍布整个基因组3.多态性高，自然界存在许多等位变异4.许多标记表现为共显性的特点，能区别显性纯合体和杂合体，对隐性农艺性状的选择十分便利5.表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁6.检测手段简单、迅速7.差异发生于同源染色单体之间●构建遗传连锁图谱●分子标记辅助选择育种●基因定位●基因克隆●植物遗传多样性分析●品种和品质纯度鉴定及遗传纯度的测定●疾病检测•RFLP•RAPD、ISSR、 SSR、SCAR、SRAP•AFLP、CAPS•SNPDNA变异基本类型SNP•单核苷酸多态性INDEL•小片段的插入缺失SV•大片段的基因组结构变异CNV•基因组片段的拷贝数变异目录分子标记全基因组重测序—实验全基因组重测序—分析全基因组重测序—应用基因组重测序1. 什么是基因组重测序•基因组重测序是对已知基因组序列的物种进行不同个体的基因组测序，并在此基础上对个体或群体进行差异性分析。
2. 重测序原理•基于测序序列与参考基因组间的比对，发现样品与参考基因组间的变异位点，如SNP、InDel、SV等3. 重测序必要条件•已知物种基因组•待测物种与参考序列物种足够接近实验部分随机打断加入接头片段选择桥式PCR上机测序关键参数◆PE测序，测序读长151bp◆插入片段大小：360bp◆下机数据格式：Fastq格式◆测序深度：对基因组每个碱基的次数◆测序覆盖度：基因组上深度不为0的碱基比例测序深度与覆盖度根据1988年提出的Lander-Waterman 模型：测序深度达到５X即可达到99%以上的覆盖度。
碱基平均测序深度基因组未覆盖率基因组覆盖率1 3.68E-0163.21%2 1.35E-0186.47%3 4.98E-0295.02%4 1.83E-0298.17%5 6.74E-0399.33%10 4.54E-05100%15 3.06E-07100%双端测序◆对于一个DNA片段的两侧同时进行测序，完成测序reads的测序◆优点：◆双端信息：能够跨越一段序列◆插入片段信息：无法预知具体序列信息，可以预知长度大小read1read2全基因组重测序——分析序列比对SNP检测INDEL检测SV检测CNV检测功能注释序列比对根据reads与参考基因组的相似性将reads定位到染色体上的过程比对软件◆比对特点：短序列局部比对，遇到重复比对随机输出一个位置◆比对情况：◆双端序列比对到一条染色体上◆双端序列比对到不同染色体上◆单端序列比对上，另一端未比对上◆双端序列均未比对上软件发表年代PMID SOAP200818227114 Maq200818714091 BWA200919451168 Bowtie200919261174 NovoAlign2009Subread201323558742比对原理◆将基因组拆分为若干个具有互相overlap的片段—index◆Reads与已经拆分好的片段进行比对，找到最优的比对位置◆DNA 使用BWA◆RNA或chip-seq使用Bowtie◆比对效率：比对到基因组上的reads/所有参与比对分析的reads变异检测SNPINDELSVCNVSNP◆由于单个核苷酸变异导致的序列碱基差异◆两种类型：◆转换：同型碱基的置换（嘌呤↔嘌呤、嘧啶↔嘧啶）（A↔G、T↔C）；◆颠换：异型碱基的置换（嘌呤↔嘧啶）（AT↔TA/CG,GC↔CG/TA）SNP检测结合基因组同一碱基位置的A/T/G/C的出现次数和测序错误率，判断单一位点是为纯合/杂合Step1：reads比对到基因组上Step2：统计每个碱基上reads的ATGC出现的次数Step3：结合突变率和测序错误率对纯和和杂合进行判断Step4：确定高质量的SNP位点同义/非同义突变同义突变(synonymous mutation)：由于生物的遗传密码子存在简并现象，密码子的核苷酸发生改变后，所编码的氨基酸种类保持不变。
非同义突变(nonsynonymous mutation)：密码子的核苷酸发生改变后导致编码的氨基酸改变。
SNP功能INTERGENIC基因间区INTRAGENIC基因内（无转录本信息）INTRON内含子UPSTREAM基因上游区域(5K以内)DOWNSTREAM基因下游区域(5K以内)UTR_5_PRIME基因的5’UTR内UTR_3_PRIME基因的3’UTR内SPLICE_SITE_ACCEPTOR剪切受体突变(exon前2bp内)SPLICE_SITE_DONOR剪切供体突变(exon后2bp内)START_GAINED起始密码子获得（非编码区）START_LOST起始密码子丢失NON_SYNONYMOUS_START非同义的起始密码子突变SYNONYMOUS_CODING同义编码突变NON_SYNONYMOUS_CODING非同义编码突变SYNONYMOUS_STOP同义终止密码子突变STOP_GAINED终止密码子获得STOP_LOST终止密码子丢失样品间差异SNP◆概念：若某一SNP位点在样品间存在不一致的基因型，则认为是样品间差异的SNP。
◆检测原理：比较同一SNP位点上各样品基因型是否完全一致。
◆检测结果：#Chr Pos Ref R01R02chr0473C G Cchr0801G T Gchr0892G C Gchr0963G R Gchr01013C C Ychr01231C Y Cchr02387G T GSmall INDEL◆指的是在基因组的某个位置上所发生的小片段序列的插入或者删除，其长度通常在50bp以下◆单端reads能够跨越，而不影响序列比对的InDelIndel 功能INTERGENIC基因间区INTRAGENIC基因内（无转录本信息）INTRON内含子UPSTREAM基因上游区域(5K以内)DOWNSTREAM基因下游区域(5K以内)UTR_5_PRIME基因的5’UTR内UTR_3_PRIME基因的3’UTR内SPLICE_SITE_ACCEPTOR剪切受体突变(exon前2bp内)SPLICE_SITE_DONOR剪切供体突变(exon后2bp内)START_LOST起始密码子丢失FRAME_SHIFT移码突变(非3的整数倍插入或删除)CODON_DELETION密码子删除(3的整数倍)EXON_DELETED整个外显子被删除CODON_INSERTION密码子插入(3的整数倍)CODON_CHANGE_PLUS_CODON_DELETION非密码子边界上的3的整数倍的删除CODON_CHANGE_PLUS_CODON_INSERTION非密码子边界上的3的整数倍的插入STOP_GAINED终止密码子获得STOP_LOST终止密码子丢失Other 由于gff文件中基因信息不完整/错误而无法得到准确的判断移码突变：在外显子区域非3的整数倍插入和缺失Small INDEL检测◆step1：将reads不允许indel的方式比对到参考基因组上◆Step2：对于比对过程产生大量mismatch的比对序列进行重新进行允许indel比对◆Step3：确定其中能够确定的Indel位点，并根据测序reads的深度进行判定纯和和杂合◆Step4：对SNP位点和Indel位点进行筛选和过滤◆概念：基因组上发生的大片段插入、缺失、倒位、易位等类型的变异。
◆软件：breakdancer◆检测原理：利用reads的pair-end关系进行检测◆将reads比对到参考基因组上，获得在基因组上的插入片段大小◆根据建库时理论的插入片段大小与pairend大小之间的差值，确定可能的SV位点◆依据SV在reads中的支持率，确定最终的SV大小和深度◆筛选其中高质量，高深度的SV作为最终的SVCNV◆由于基因组上拷贝数的变异所导致的差异位点◆拷贝数变异：基因组家族的扩张和收缩/转座子的复制/基因组复制◆类型：◆Duplicate：材料拷贝数多而基因组拷贝数少◆Deleltion：基因组拷贝数少而材料拷贝数多生信分析流程原始数据比对序列比对不允许IndelIndel Realign检测多个mismatch reads重新比对，降低比对错误率SNP/INDEL callingSNP INDELSV callingBreakdancer插入/缺失/倒位/异位CNV callingCNVnator重复变异功能注释SNP INDEL SV CNV思考题◆影响比对效率的因素有哪些◆影响SNP和INDEL检测准确度的因素有哪些◆影响SV检测准确度的影响因素有哪些。