菌种及抗生素的保存方法
菌种的储存条件
菌种的储存条件菌种的储存条件菌种是指具有一定遗传特性和生物学特性的一种微生物群体，是进行科学研究以及工业应用的基础。
为了长期保存和保持菌种的稳定性，在储存菌种时需要注意一些条件。
下面将详细介绍菌种的储存条件。
一、菌种的储存温度温度是影响菌种存活和保持活力的重要因素。
不同种类的菌种对于温度的要求不同，一般可分为冷冻储存和低温储存两种方式。
1. 冷冻储存：一般情况下，冷冻储存温度为-80℃，这是因为在这个温度下，细胞活动几乎停止，生化反应和分解过程也会减缓，从而能够稳定保存菌株。
此外，为了防止温度波动对菌种的影响，冷冻储存应该选择一个温度恒定的冷冻设备。
2. 低温储存：低温储存是相对于冷冻储存而言的，温度范围通常在-20℃至-70℃之间。
在低温下储存菌种，要求采用短时间转入低温环境，快速降温，并注意防止温度波动。
二、菌种的储存液菌种的储存液是将菌株保存在液体培养基中的一种方式，主要有菌种原液储存和冷冻储存液两种形式。
储存液的选择应根据不同菌株的要求、实验室设备和储存方式来决定。
1. 菌种原液储存：菌种原液储存适用于一些较为敏感的菌株，要求其活力尽可能得到保留。
菌种原液储存液一般由培养基和一定浓度的甘油混合而成，需要在使用前进行无菌处理。
2. 冷冻储存液：冷冻储存液中添加了一定比例的甘油或乳糖，可以减少冰晶对菌株的损伤，并增加了冷冻菌株的保活率。
此外，在选择储存液时还可以根据菌株特性添加一些物质，如保鲜剂、抗生素等，以提高菌株的储存质量。
三、菌种的储存容器菌种的储存容器对于菌株的保存稳定性以及长期保存的效果有着重要的影响。
常见的菌种储存容器主要有冷藏管、冷冻管、培养皿、冻干菌种等。
1. 冷藏管和冷冻管：冷藏管适用于低温储存，冷冻管适用于冷冻储存，可以防止水分和气体的渗透，并保持菌株的相对湿度。
在选择菌种储存管时，要注意其质量，确保无渗漏的情况下才能安全储存。
2. 培养皿：一般情况下，培养皿适用于菌种原液保存和短期保存。
菌种保藏的原理和方法.ppt
2.沙土管干燥保藏法（略）
3.真空冷冻干燥保藏法
是目前常用的较理想的一种方法。其基本原理是在较低温度 下，（-18℃），快速地将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后 在真空中使水分升华。在这样的环境中，微生物的生长和代谢 都暂时停止，不易发生变异。一般可保存5~10年左右。
4.液氮保藏法
是适用范围最广的微生物保藏法，其保存期最长。因为液氮的温度 可达-196℃，远远低于菌种新陈代谢作用停止的温度（-130℃）， 故此时代谢活动已停止。保藏期一般为2~3年，长的可达9年之久。
种时，先将原种制成若干管液氮菌种作为长期保藏用菌种，然后 再制一批冷冻保藏菌种作为用户分发用。约经5年后，假定第一 代（原种）的冷冻干燥保藏菌种已分发完毕，就再打开一支液氮 保藏原种制备大量冷冻保藏菌种，这样下去，至少在20年内，凡 获得该菌种的用户，至多只是原种的第二代，从而保证了保藏菌 种与分发菌种的高质量标准。
保藏斜面活化斜面来自2、复壮：使微生物活性恢复的同时，恢复其优良的生产性能。
保藏斜面 平板分离（自然分离，剔除退化菌种） 活化斜面
六、菌种保藏机构
菌种保藏机构的任务是：在广泛收集生产和科研菌种、菌株的基 础上，把它们妥善保藏，使之达到不死、不衰、不乱和便于交换使 用的目的。国际上很多国家都设立了菌种保藏机构。
▲ I FO（发酵研究所，日本大阪. Institute for Fermentation, Osaka, Japan ） ▲ NCTC（国家典型菌种保藏中心,英国伦敦. National Collection of Type Culture. London, United Kingdom） ▲ NRRL（Northern Utilization Research and Development Division, U.S Department of Agriculture. Peoria, U.S.A. 美国农业 部、北方开发利用研究部，美国皮奥里亚市）
菌种的管理和保藏
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液体冷冻保藏法
制备方法 1%蛋白胨 、甘油 ,灭菌,接种、培养18-24小时.
保存条件 -80℃可保存数年.
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菌种的传代和使用
工作菌种传代次数不得超过5代。 1代 是指将活的培养物接种到新鲜培养基中，任何亚培养的形式均被认为是转种或传 代一次。
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基本操作技术
细菌的接种、分离和培养 接种：将微生物的培养物接种到培养基上的一种操作技术。
信息。
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2015版-指导原则
菌种的鉴定
纯菌的分离 微生物的表型 表型微生物鉴定 通过长时间培养对微生物细胞的恢复、增殖是有限的，如有些环境中的微生 物在普通微生物增殖培养基不能恢复。此外，分离出的受损的培养物可能不 能完整表达其表型属性。 基因型微生物鉴定
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菌种的鉴定
微生物分类中使用的表型特征
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菌种的保藏
低温、干燥、缺氧、缺乏营养等环境条件都可以抑制微生物的代谢和生长繁殖， 因此低温、干燥和真空是菌种保藏的重要手段。
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菌种的保藏
标准储备菌株可用于制备每月或每周一次转种的工作菌株。 冷冻菌株一旦解冻转种制备工作菌株后,不得重新冷冻或再 次使用。
工作菌株不可代替标准菌株，标准菌株的商业衍生物仅可用 作
培养时间( h ) 18～24
2～3天
5～7天，或直到获得 丰富的孢子
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菌液制备用稀释液—2015修定内容
修订前 0.9％氯化钠溶液
修订后 pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。 0.9%无菌氯化钠溶液。
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菌液贮存—2015修定内容
修订前
修订后
菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2-8℃，可在24小时内使 用。
生产菌种的扩大培养与保藏简介
生产菌种的扩大培养与保藏简介1. 引言生产菌种的扩大培养与保藏是微生物工程中不可或缺的重要环节。
在微生物工业中，菌种数量的扩大和保藏对于生产规模的控制和后续的实验操作至关重要。
本文将介绍生产菌种的扩大培养和保藏的基本原理、方法和注意事项。
2. 菌种的扩大培养菌种的扩大培养是将初始的菌株培养至足够数量供生产使用的过程。
以下是菌种的扩大培养的基本步骤：2.1 选择培养基根据菌株的特性和要求，选择适当的培养基进行扩大培养。
常见的培养基包括富含营养物的培养基和特殊功能的培养基。
2.2 菌种的预培养在扩大培养前，先进行菌种的预培养。
从保存的菌种中挑取适量的菌落或菌点接种到预培养培养基中，进行为期数小时的预培养。
2.3 液体扩大培养将预培养的菌种转移到液体培养基中，并进行液体扩大培养。
根据需要的菌种数量，选择适当的容器和培养条件进行扩大培养。
2.4 固体扩大培养液体培养经过一定周期后，可以将菌种转移到固体培养基中进行固体扩大培养。
固体培养可以有助于菌落的生长和分离。
2.5 菌种的检测和纯化在扩大培养结束后，需要对菌种进行检测和纯化。
常用的方法包括菌落PCR、生化测试和纯化子代的分离。
3. 菌种的保藏菌种的保藏是为了长期保存和储备菌种，保证其稳定性的一系列措施。
以下是常见的菌种保藏方法：3.1 冷冻保存法将菌种在适当的保存液中制备冻存物，并存放在低温冰箱或液氮罐中。
常用的保存液包括甘露醇、甘油等。
3.2 干燥保存法将菌种在无菌条件下培养至晚期生长期，用无菌纱布吸干培养基上的菌落，将菌落贴附在无菌纸上，然后将纸张放置在干燥剂中保存。
3.3 冷冻干燥法通过冷冻和干燥的交替操作，将菌种制备为干燥粉末，再用密封容器保存。
冷冻干燥法在菌种保存期间能保持菌种的高度稳定。
3.4 液氮冷冻保存法将菌种悬浮液或培养物直接置于液氮罐中，利用极低温度保存菌种。
这种方法能够保留菌种的生物学特性，并保证菌种长期保存。
4. 注意事项在进行生产菌种的扩大培养和保藏时，需要注意以下事项：•严格遵守无菌操作规范，防止污染和交叉感染。
微生物菌种保藏方法
微生物菌种保藏方法菌种是一种重要的生物资源，菌种保藏是重要的微生物基础工作。
菌种保藏就是利用一切条件使菌种不死、不衰、不变，以便于研究与应用。
(一)常规保藏方法1 目的1.1 了解菌种保藏的基本原理1.2 掌握几种常用的菌种保藏方法。
2 原理菌种保藏的方法很多。
其原理却大同小异，不外乎为优良菌株创造一个适合长期休眠的环境,即干燥、低温、缺乏氧气和养料等。
使微生物的代谢活动处于最低的状态，但又不至于死亡，从而达到保藏的目的。
依据不同的菌种或不同的需求，应该选用不同的保藏方法。
一般情况下，斜面保藏、半固体穿刺,石蜡油封存和砂土管保藏法较为常用，也比较容易制作。
3 材料3.1菌株待保藏的适龄菌株斜面3.2培养基肉汤蛋白胨斜面，半固体及液体培养基。
3.3 试剂10%HCl无水氯化钙、石蜡油、五氧化二磷。
3.4 器具用于菌种保藏的小试管(10*100毫米)数支、5毫升无菌吸管、l 毫升无菌吸管等、灭菌锅、真空泵、干燥器、冰箱无菌水、筛子(40目、120目)、标签、接种针、接种环、棉花、牛角匙等等。
4 流程斜面保藏→半固体穿刺保藏→石蜡油封存→砂土管保藏5 步骤5.1斜面保藏5.1.1流程标记试管→接种→培养→保藏5.1.2步骤5.1.2.1贴标签取无菌的肉汤蛋白胨斜面数支。
在斜面的正上方距离试管口2-3厘米处贴上标签。
在标签纸上写明接种的细菌菌名、培养基名称和接种日期。
5.1.2.2斜面接种将待保藏的细菌用接种环以无菌操作在斜面上作划线接种。
5.1.2.3培养置37恒温箱中培养48小时。
5.1.2.4保藏斜面长好后，直接放入4℃的冰箱中保藏。
这种方法一船可保藏三个月至半年。
5.2半固体穿刺保藏5.2.1流程标记试管→穿刺接种→培养→保藏5.2.2 步骤5.2.2.1贴标签取无菌的半固体肉汤蛋白等直立柱数支，贴上标签，注明细菌菌名、培养基名称和接种日期。
5.2.2.2穿刺接种用接种针以无菌方式从待保藏的细菌斜面上挑取菌种，朝直立柱中央直刺至试管底部，然后又沿原线拉出。
菌种保存方法
菌种保存方法微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。
低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。
一. 保藏方法大致可分为以下几种：1．传代培养保藏法又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于4—6℃冰箱内保存。
2．液体石蜡覆盖保藏法是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。
3．载体保藏法是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。
4．寄主保藏法用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。
病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。
5．冷冻保藏法可分低温冰箱（-20—-30℃，-50—-80℃）、干冰酒精快速冻结（约-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法。
6．冷冻干燥保藏法先使微生物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥）。
有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。
保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。
保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。
二. 常用的器材所要保存的微生物；肉膏蛋白胨斜面培养基，灭菌脱脂牛乳，灭菌水，化学纯的液体石蜡，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黄土或红土，冰块、食盐，干冰，95％酒精，10％盐酸，无水氯化钙；灭菌吸管，灭菌滴管，灭菌培养皿，管形安瓿管，泪滴形安瓿管（长颈球形底），40目与10 0目筛子，油纸，滤纸条（0．5×1．2cm），干燥器，真空泵，真空压力表，喷灯，L形五通管，冰箱，低温冰箱（-30℃），液氮冷冻保藏器。
菌种冷柜操作规程
菌种冷柜操作规程
《菌种冷柜操作规程》
一、冷柜使用前的准备工作
1. 检查冷柜门是否紧闭，密封是否良好。
2. 清洁冷柜内外表面，确保无污物附着。
3. 确保冷柜内部温度已调至所需的温度。
二、菌种存储
1. 将菌种样本放入专用的存储盒中。
2. 在存储盒上标注菌株编号、存入日期等相关信息。
3. 将存储盒放入冷柜内指定的存储位置。
三、温度调节
1. 根据菌种的存储要求，调节冷柜的温度。
2. 定期检查冷柜温度，确保温度稳定在所需范围内。
四、冷柜内清洁
1. 定期清洁冷柜内部和外部，避免细菌滋生。
2. 清理冷柜内的结冰和水滴，保持冷柜的正常运行。
五、冷柜使用注意事项
1. 不得在冷柜内存放非菌种样本或食品等物品。
2. 避免频繁开启冷柜门，以免影响冷柜内环境温度。
3. 使用过程中遇到任何异常情况，应及时通知相关人员进行处理。
以上为《菌种冷柜操作规程》，请严格按照规程操作，确保菌种的存储和使用安全。
菌种冷冻保藏
7.4采用酒精喷灯进行封管时，烧的温度要适宜。封管后不要立即放在台面上，以防受冷撕裂。
附图：泪滴型安瓿管长颈毛细玻璃管
多头岐管
附：1、冷冻保藏改进方法（一）
因真空冷冻干燥器价格比较昂贵，通常抗生素生产厂都采用自制的简单易行办法，可达到同样的目的。即：
6.2制备脱脂乳
取市售新鲜、清洁、无抗生素污染的原牛奶300ml煮沸，在5000 r/min下离心10分钟，除去上层奶皮、油脂，吸取下层奶液，经脱脂棉过滤，如此反复3次脱去脂肪，然后分装入两个250 ml三角瓶中，加棉塞并用牛皮纸包头、扎牢，在115℃25min高压蒸汽灭菌，冷却后做无菌试验，4℃冰箱保存备用。
6.6预冻
因为迅速超低温预冻可保持菌体细胞结构成份原状，利于细菌存活。故将分装好的冷冻管及指示管置于低温冰箱冷冻室-70℃下快速冷冻过夜。无低温冰箱可用冷冻剂如干冰（固体CO2）酒精液或干冰丙酮液，温度可达-70℃。也可用液氮。将冷冻管插入冷冻剂，只需冷冻4—5分钟，即可使悬液结冰。也可用液氮预冻。还可用低温冰箱-80℃预冻1～2小时后转入冷冻真空干燥。
由于同时满足菌种保藏三要素，使微生物始终处在低温、干燥、缺氧的条件下，能克服传代、沙土管简单保藏方法的不足，保藏菌种范围广、时间长（保藏期可达数年至十数年）、存活率高、保存过程不易失活和退化等。
3、主要步骤为：
3.1将待保藏菌种的细胞或孢子悬浮于保护剂（如脱脂牛奶）中；
3.2在低温（-45℃以下）下使微生物细胞快速冷冻；
6.7冷冻真空干燥
真空冷冻干燥器有成套的装置出售（长药厂新近成立菌种中心，购有该机）。按其方法操作。冷冻干燥机要先开机预冷30分钟以上，再根据冷冻干燥机的水分蒸发能力，确定一次放入的冷冻管数量。将预冻好的冷冻管及指示管于次日取出迅速放入已预冷的冷冻干燥机的干燥箱内，开动真空泵进行一级真空抽干，待指示管出现由粉红色变全兰色时，再进行二级抽干12h。二级真空干燥既保持菌体细胞干燥度，又避免细胞反复冻结造成保存中菌体死亡，因而能更长期保存菌种，并能提高其存活率，又不会发生菌株的变异
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编号：SCHS-GL-2013-003版本：2013
审核人：胡宗秀审核日期：2013-1-1
批准人：王正武批准日期：2013-2-1
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菌种及抗生素的保存方法
1.目的：
规范四川宜宾横竖生物科技有限公司微生物检测实验室对菌种和抗生素保存，同时为技术人员提供可操作的技术标准。
2．范围：
适用于四川宜宾横竖生物科技有限公司猴场内所有涉及菌种和抗生素保存的工作人员。
3．标准菌株的来源和保存
3．1 标准菌株的来源
标准菌株是指具有典型的、稳定的生理生化特征，并被国际社会所认可的菌株。
这些菌株可来源于专门的机构。
本文件规定公司所采用的标
准菌株从中国卫生部药物制品鉴定所菌种保藏中心采购。
3．2 标准菌株的保存
3．2．1 一般保存方法
将细菌种于半固体培养基中，35℃培养18-24小时后封盖1cm厚的无菌石蜡油，置4℃保存。
适用于肠杆菌科等细菌的保存；对链球菌、脑膜炎奈瑟菌等苛养菌在血平板上或血清培养基中移种培养。
由于细菌经多次移种，性状
可能发生变异，所以本文件规定本公司范围内使用的菌种传代次数不
超过15次。
3．2．2 常见细菌的保存方法及保存时间见表-1
编号：SCHS-GL-2013-003版本：2013
审核人：胡宗秀审核日期：2013-1-1
批准人：王正武批准日期：2013-2-1
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本公司使用的菌种保存的方法和保存时间，由质量监督小组监督执行。
表-1 常见细菌的一般保存方法及保存时间
菌种保存用培养基保存条件及时间
葡萄球菌
链球菌
肺炎链球菌
脑膜炎奈瑟菌
流感嗜血杆菌
百日咳鲍特菌
结核分支杆菌
白喉棒杆菌
大肠埃希菌
志贺菌属
沙门菌属
肺炎克雷白菌属
变形杆菌属
肠道杆菌科其他菌属铜绿假单胞菌
含Vi的沙门菌
肠致病性大肠埃希菌普通琼脂半固体培养基
血清半固体培养基
血清半固体培养基
血琼脂斜面
巧克力琼脂斜面培养基
血琼脂斜面培养
血清半固体培养基
巧克力或血琼脂斜面
鲍-金氏培养基
罗-琴氏培养基
吕氏血清培养基
普通琼脂斜面培养基
琼脂半固体培养基
鸡蛋斜面
加封石蜡油4℃保存3个月
加封石蜡油4℃保存3个月
半固体4℃保存14天
斜面4℃保存2-4天
37℃，斜面2-4个月
半固体7-10天
37℃，4-5天
4℃，14天
4℃，2月
4℃，14-30天
4℃
斜面：1个月，加封石蜡油3个月
半固体：2个月，加封石蜡油6个月
4℃，1-2个月，加封石蜡油6个月
3．2．3 冷冻干燥法：需要长期保存的菌种采用冷冻干燥法保存。
需进行冻干保存的菌种报质量监督小组审批执行。
4、抗生素使用和保存
本公司使用的抗生素的标准品或参考品必须来自国家权威鉴定机构，如中国
编号：SCHS-GL-2013-003版本：2013
审核人：胡宗秀审核日期：2013-1-1
批准人：王正武批准日期：2013-2-1
变更日期：页码：第 3 页共 3 页
药品生物制品鉴定所，或来自生产厂商提供的标明效价的标准品或参考品。
不能使用口服药、外用药的制成品做药敏试验。
许多种抗菌药物粉剂状态比配制成溶液稳定，但自生产日期起保存时间一般不超过一年。
已配制成溶液的抗生素应尽快使用，保存条件及时间见表-2
表-2抗菌药物溶液的保存条件及时间
抗菌药物保存条件及时间
4℃-20℃
青霉素类（包括所有青霉素、半合成青霉素、头孢菌素）四环境素类氨基糖苷类（丁胺卡那霉素、庆大霉素、链霉素、妥布霉素）新生霉素、杆菌肽、万古霉素、氯林可霉素、红霉素、多粘菌素B
氯霉素、磺胺类、甲氧苄胺嘧啶7天
14天
长期保存
3个月
3个月
5．记录
操作完成后，认真、准确、完整的做好各项记录。