分子机制-蛋白检测-GST-pulldown
GST-pull-down实验技术原理和实验流程
➢ 5、3000 rpm/min，4℃离心3min，弃上清（注意不要扰动底层 的Sepharose）；
➢ 6、重复步骤5三次; ➢ 7、吸干Sepharose上面的液体后，加入20~30微升1 ×蛋白电泳
上样缓冲液，沸水浴4min，冻存于-20℃备用； ➢ 8、做SDS-PAGE和Western blot检测另一个蛋白。
加DTT至终浓度1mmol/L。
Western Blot
➢ 1.1.2 (His)-B融合蛋白的纯化
➢ 1、 在新鲜制备的裂解液上清中加入适量体积的Ni-NTA珠子， 4℃缓慢摇动，反应30~60min；
➢ 2、 3000 rpm/min，4℃离心5min，弃上清。该Ni-NTA珠子上结 合了His-B融合蛋白。
B蛋白的来源： ➢ 1.1 (His)-B融合蛋白的原核表达与纯化 ➢ 1.2 (HA/Myc/Flag)-B融合蛋白的真核表达
Western Blot
➢ 1.1.1 (His)-B融合蛋白的原核表达
➢ 1、活化冻存菌种His和His-B：按1: 50比例将表达蛋白的冻存菌 液加入5ml LB(Amp＋)，37℃，200 rpm培养过夜；
加DTT至终浓度1mmol/L。
Western Blot
➢ 1.2 GST-A融合蛋白的纯化
➢ 1、 在新鲜制备的裂解液上清中加入适量体积的50%Glutathione Sepharose 4B，4℃缓慢摇动，反应30~60min；
➢ 2、 3000 rpm/min，4℃离心3min，弃上清。该Sepharose上结合 了GST-A融合蛋白。
Western Blot
GST pull-down原理：
基本原理：
GST pulldown实验技术
➢ 3、以预实验确定的最佳IPTG浓度、时间和温度诱导表达靶蛋 白（IPTG 0.5mM，28℃，200 rpm培养10~16小时）;
➢ 4、诱导适当时间后，4℃，5000 rpm/min离心10min后弃上清 （如需要该步沉淀能保存在-80℃）；
GST pull-downFra bibliotek示意图Western Blot
GST pull-down应用
Western Blot
用于验证两个已知蛋白的相互作用 筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白
GST pull-down流程
GST-A融合蛋白的制备 • B蛋白的制备 • 体外蛋白的结合 • Western blot检测
Western Blot
➢ 1.1 GST-A融合蛋白的表达
➢ 5、重悬沉淀：按10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬，并加入PMSF； ➢ 6、冰上超声沉淀重悬液：5S 间隔5S 至悬液透明（一般可容性
蛋白：10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬液超声6~9min可透明）; ➢ 7、12000 rpm/min，4℃离心10min，将上清转移至新的离心管，
B蛋白的来源： ➢ 1.1 (His)-B融合蛋白的原核表达与纯化 ➢ 1.2 (HA/Myc/Flag)-B融合蛋白的真核表达
Western Blot
➢ 1.1.1 (His)-B融合蛋白的原核表达
➢ 1、活化冻存菌种His和His-B：按1: 50比例将表达蛋白的冻存菌 液加入5ml LB(Amp＋)，37℃，200 rpm培养过夜；
Western Blot
1. GST-A融合蛋白的制备
GST pull-down实验技术
Western Blot
1. GST-A融合蛋白的制备
1.1 GST-A融合蛋白的表达 1.2 GST-A融合蛋白的纯化
Western Blot
Western Blot
1.1 GST-A融合蛋白的表达
1、活化冻存菌种GST和GST-A：按1: 50比例将表达蛋白的冻存 菌液加入5ml LB(Amp＋)，37℃，200 rpm培养过夜；
GST pull-down 示意图
Western Blot
GST pull-down应用
Western Blot
用于验证两个已知蛋白的相互作用 筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白
GST pull-down流程
GST-A融合蛋白的制备 • B蛋白的制备 • 体外蛋白的结合 • Western blot检测
3、在管中加入预冷的200微升PBS（沿壁加入，小心勿剧烈，以 免打断珠子与蛋白的连接），轻晃悬浮珠子，将Sepharose洗涤 一次， 3000 rpm/min，4℃离心3min，弃上清;
4、重复步骤3三次（最后一次以小枪头吸净珠子表面液体，吸 净但不吸走珠子），即获得结合有GST-A融合蛋白的Sepharose；
1.2 GST-A融合蛋白的纯化
Western Blot
5、如果用于检测，在Sepharose 加入15~20微升1×蛋白电泳上 样缓冲液，于沸水中煮5~10min。
6、12000 rpm/min离心5min，取上清做SDS-PAGE和WB检测。
2. B蛋白的制备
Western Blot
Western Blot
1.1 GST-A融合蛋白的表达
5、重悬沉淀：按10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬，并加入PMSF； 6、冰上超声沉淀重悬液：5S 间隔5S 至悬液透明（一般可容性
分子生物学常用实验方法原理介绍
分子生物学常用实验方法原理介绍一、GST pull-down实验基本原理:将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。
此方法简单易行,操作方便。
注：GST即谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase)二、足印法（Footprinting）足印法（Footprinting）是一种用来测定DNA-蛋白质专一性结合的方法，用于检测目的DNA序列与特定蛋白质的结合，也可展示蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合。
其原理为：DNA和蛋白质结合后，DNA与蛋白的结合区域不能被DNase（脱氧核糖核酸酶）分解，在对目的DNA 序列进行检测时便出现了一段无DNA序列的空白区(即蛋白质结合区)，从而了解与蛋白质结合部位的核苷酸数目及其核苷酸序列。
三、染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是研究体内蛋白质与DNA相互作用的有力工具，利用该技术不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰以及转录因子与基因表达的关系。
染色质免疫沉淀技术的原理是：在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，通过超声或酶处理将染色质切为小片段后，利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的DNA 片段沉淀下来。
染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定，染色质断裂，染色质免疫沉淀，交联反应的逆转，DNA的纯化及鉴定。
四、基因芯片（又称 DNA 芯片、生物芯片）技术基因芯片指将大量探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。
GST-Pull-down技术服务
原理简介：
GST-Pull-down技术是一种体外检测蛋白质之间相互作用的方法。
其基本原理是利用GST对于其底物-谷胱甘肽具有极高的特异性，故GST融合蛋白可亲和固化在谷胱甘肽树脂上，作为与猎物蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,当猎物蛋白溶液过柱时便可从中捕获与之相互作用的蛋白(目的蛋白)，洗脱结合物然后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,此方法简单易行,操作方便。
服务内容：
一验证两蛋白质间相互作用
诱饵蛋白与猎物蛋白原核表达载体的构建
诱饵蛋白与猎物蛋白的诱导表达
诱饵蛋白与猎物蛋白的纯化
Pull-down技术蛋白互作分析
Western bloting进一步鉴定互作蛋白表达
二，验证目的蛋白与细胞裂解物蛋白互作
诱饵蛋白原核表达载体的构建
诱饵蛋白的诱导表达
诱饵蛋白的纯化与固定
Pull-down技术蛋白互作分析
互作靶蛋白的鉴定
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GST pull down过程
GST pull-downGST pull-down实验是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术,近年来越来越受到广大学者的青睐。
其基本原理是将靶蛋白-GST（Glutathione-S-transferase谷胱苷肽巯基转移酶）融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。
此方法简单易行,操作方便。
GST pull-down技术GST：谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase)免疫共沉淀实验由于在非变性实验条件性进行，这样蛋白质之间的天然相互作用得以最大程度的保留，因此可以比较真实的反应蛋白质之间的相互作用。
但也基于此点，免疫共沉淀并不能显示蛋白质之间的相互作用是直接还是间接的，因为通过目的蛋白抗体共沉淀下来的是一个蛋白复合物，而不仅仅是和目的蛋白直接相互作用的蛋白。
而GST-Pull down实验可以通过体外实验条件，去除其它蛋白的影响，从而确定目的蛋白和待检测蛋白是否可以发生直接相互作用。
GST亲和层析和GST Pull-down方法的基本原理是：利用重组技术将探针蛋白与GST（Glutathione S transferase）融合，融合蛋白通过GST与固相化在载体上的GTH （Glutathione）亲和结合。
因此，当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离。
拉下实验（Pull-down assay）拉下实验又叫做蛋白质体外结合实验（binding assay in vitro），是一种在试管中检测蛋白质之间相互作用的方法。
gstpulldown实验技术
汇报人： 2023-12-25
目录
• 实验简介 • 材料准备 • 实验操作 • 结果分析 • 实验结论
01
实验简介
实验目的
确定蛋白质之间的相互作用
通过gstpulldown实验可以检测到与特定蛋白质结合的其他蛋白 质，从而确定蛋白质之间的相互作用。
验证已知的蛋白质相互作用
结果解读
解读实验结果
根据实验目的和预期，对实验结果进行解读，判断实 验是否达到预期目标。
解读数据变化
分析实验数据的变化趋势，探究可能影响实验结果的 因素。
解读误差范围
评估实验结果的误差范围，判断实验结果的可靠性和 稳定性。
结果讨论
讨论实验结果的意义
01
探讨实验结果对科学研究和实际应用的价值和意义。
04
结果分析
结果展示
实验结果表格
整理实验数据，以表格形式展示 各个组别的实验结果，包括样本 编号、实验条件、实验结果等。
实验结果图
根据实验数据绘制图表，如柱状 图、折线图等，直观展示实验结 果的变化趋势。
数据分析表格
对实验数据进行统计分析，计算 各组别的平均值、标准差等统计 指标，以便对实验结果进行比较 和评估。
gstpulldown实验可以用于验证已知的蛋白质相互作用，例如验证 某个蛋白质是否与特定的结合蛋白相互作用。
发现新的蛋白质相互作用
通过gstpulldown实验可以发现新的蛋白质相互作用，从而为研究 新的生物学过程和疾病机制提供线索。
实验原理
蛋白质相互作用
gstpulldown实验利用GST（谷胱甘肽巯基转移酶）融合蛋白作为诱饵，与细胞或组织 提取物中的目标蛋白质进行结合，从而检测到与诱饵蛋白结合的目标蛋白。
gst-pull down 鉴定蛋白纯化结果
gst-pull down 鉴定蛋白纯化结果
GST pull down（GST融合蛋白沉降技术）是体外检测蛋白相互作用的常用方法，可验证已知蛋白之间的互作，也可用于筛选与已知蛋白互作的未知蛋白。
其鉴定蛋白纯化结果的原理如下：
- 利用DNA重组技术将已知蛋白与GST融合；
- 融合蛋白通过GST与固化在载体上的GTH（谷胱甘肽）亲和结合；
- 将纯化的融合GST的a蛋白和纯化的b蛋白以及能特异性结合GST的Sephrose 4B beads混合在一起孵育一定时间；
- 洗去未结合的蛋白，煮沸beads进行SDS-PAGE电泳。
通过观察电泳结果，可以分析出蛋白间的互作关系，从而鉴定蛋白纯化结果。
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主题：GST-pulldown
概述：
GST pull-down实验是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术，近年来越来越受到广大学者的青睐。
其基本原理是将靶蛋白-GST（Glutathione-S-transferase谷胱苷肽巯基转移酶）融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物，充当一种“诱饵蛋白”，目的蛋白溶液过柱，可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白)，洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析，从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白，“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。
目的：
体外检测蛋白质与蛋白质之间相互作用，用于验证两个已知蛋白的相互作用，或者筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白。
原理：
利用重组技术将探针蛋白与GST（Glutathione S transferase）融合，融合蛋白通过GST与固相化在载体上的GTH（Glutathione）亲和结合。
因此，当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离。
步骤：
１.Glutathione琼脂糖珠预处理；
２.GST融合蛋白挂柱：取适GST-融合蛋白与已经处理过的beads置于管中，4℃，摇床孵育过夜；
３.孵育过夜的蛋白质与beads的混合液于4℃，离心,上清收集，观察融合蛋白是否饱和地挂在beads上；
４.把转染目的基因的细胞裂解在细胞裂解液里（含蛋白酶抑制剂），最大转速4℃离心，收集上清液；
５.将细胞裂解液上清加入beads；
６.加上SDS上样缓冲液；
７.SDS-PAGE，Western Blot或者质谱仪分析。
流程图：。