蛋白质含量测定方法
测量蛋白质含量的方法
蛋白质含量测定蛋白质含量测定方法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析之一。
目前常用的方法有凯氏定氮法(Kjedahl）、双缩脲法(Biuret)、紫外吸收法、考马斯亮蓝法(Bradford)。
其中Bradford法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10~20倍Biuret 法灵敏100倍以上。
凯氏定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。
1.凯氏定氮法1．1 原理凯氏定氮法测定蛋白质分为样品消化、蒸馏、吸收和滴定4个过程。
其原理是样品中含氮有机化合物与浓硫酸在催化剂作用下共热消化，含氮有机物分解产生氨，氨又与—酸作用，变成硫酸铵。
然后加碱蒸馏放出氨，氨用过量的硼酸溶液吸收，再用盐酸标准溶液滴定求出总氮量换算为蛋白质含量。
1．2 特点凯氏定氮法是目前分析有机化合物含氮量常用的方法，是测定试样中总有机氮最准确和最简单的方法之一，被国际国内作为法定的标准检验方法。
该凯氏定氮法适用范围广泛，用于标准蛋白质的准确测定，干扰少，干扰是非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离）测定结果准确，重现性好，但操作复杂费时，试剂消耗量大。
费时太长，通常8-10个小时，灵敏度低，测定范围是0.2-1.0mg。
2.双缩脲法2．1 原理双缩脲(N}I3C0NHC0NH 是两个分子脲经180℃左右加热，放出1个分子氨后得到的产物。
在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO 形成紫色络合物，称为双缩脲反应。
凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能够以1个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。
2.2特点双缩脲法中样品的取用量对测定结果的准确性有显著影响.采用0．5 g样品，40 mL双缩脲试剂的比例具有较高的检测精度。
双缩脲法对不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，不受温度的影响。
可快速测定蛋白质含量，试剂单一，方法简便，干扰物质少，如硫酸铵，Tris缓冲液，某些氨基酸。
蛋白质含量的测定方法及原理
蛋白质含量的测定方法及原理蛋白质是生物体内一种重要的有机化合物，具有构建细胞结构、调节生理功能等重要作用。
因此，准确测定蛋白质的含量对于生物科学研究和临床诊断具有重要意义。
本文将介绍几种常用的蛋白质含量测定方法及其原理。
一、比色法比色法是一种常用的蛋白质含量测定方法，其原理是利用蛋白质与某些特定试剂形成显色物，根据显色物的光吸收特性来测定蛋白质的含量。
1. 低里氏法低里氏法是一种经典的蛋白质含量测定方法，其原理是利用试剂双硫苏三唑酮（DTNB）与蛋白质中的半胱氨酸残基反应产生黄色的二硫苏三唑，然后通过分光光度计测定其在412nm处的吸光度，根据标准曲线计算出蛋白质的含量。
2. 伯杰法伯杰法是一种基于酪蛋白与浊度试剂金霉素的显色反应来测定蛋白质含量的方法。
酪蛋白与金霉素结合形成沉淀，通过比色法测定沉淀的光吸收度，再根据标准曲线计算出蛋白质的含量。
3. 白蛋白-酷伊斯基（BCA）法BCA法是一种常用的高灵敏度蛋白质测定方法，其原理是在碱性条件下，蛋白质与BCA试剂中的铜离子络合生成紫色的离子螯合物，通过比色法测定在562nm处的光吸收度，再根据标准曲线计算出蛋白质的含量。
二、光谱法光谱法是一种基于蛋白质在特定波长下的吸收特性来测定蛋白质含量的方法。
1. 紫外吸收法紫外吸收法根据蛋白质中的芳香族氨基酸（如酪氨酸、酪氨酸和色氨酸）在紫外光区域（200-400nm）的吸收特性来测定蛋白质含量。
通过分光光度计测定蛋白质溶液在280nm处的吸光度，再根据标准曲线计算出蛋白质的含量。
2. 近红外光谱法近红外光谱法是一种无损、非破坏性的蛋白质含量测定方法，其原理是利用蛋白质溶液在近红外光区域（700-2500nm）的吸收特性与其含量之间的关系。
通过近红外光谱仪获取蛋白质溶液的光谱图像，然后利用化学计量学方法建立标准模型，通过光谱图像预测蛋白质的含量。
三、生化分析法生化分析法是一种利用生化技术和仪器设备来测定蛋白质含量的方法。
蛋白质的含量测定方法
蛋白质的含量测定方法一、前言蛋白质是生命体中不可或缺的重要组成部分，对于研究生命科学、医学、农业等领域都有着极为重要的意义。
因此，蛋白质含量测定方法也就成为了这些领域研究的基础之一。
本文将介绍几种常用的蛋白质含量测定方法，并详细说明其原理及操作步骤。
二、生物素-琼脂糖凝胶电泳法1. 原理生物素-琼脂糖凝胶电泳法是一种常用的半定量分析方法，其原理是利用琼脂糖凝胶作为分离介质，通过电泳将样品中的蛋白质分离出来，并利用生物素与特异性抗体结合进行检测。
由于该方法操作简便，需要样品较少且具有较高的灵敏度和特异性，因此被广泛应用于各个领域。
2. 操作步骤(1) 制备琼脂糖凝胶：按比例配制琼脂糖溶液并加入适量缓冲液，混合均匀后加热至溶解，然后冷却至50℃左右，倒入凝胶模具中制备琼脂糖凝胶。
(2) 样品处理：将待测样品加入适量的缓冲液中，使其浓度适当稀释。
(3) 电泳：将处理好的样品加入琼脂糖凝胶槽中进行电泳分离。
电泳条件需要根据不同实验目的进行调整。
(4) 转移：将分离出来的蛋白质转移到聚丙烯酰胺膜上并进行固定。
(5) 检测：利用生物素与特异性抗体结合进行检测。
可以使用化学发光、荧光等方法进行检测。
三、Bradford法1. 原理Bradford法是一种广泛应用于蛋白质含量测定的方法，其原理是利用染料染色反应来检测样品中的蛋白质含量。
该方法操作简便、灵敏度高、特异性好，并且可以适用于各种类型的样品。
2. 操作步骤(1) 制备标准曲线：按比例配制标准蛋白质溶液，并利用Bradford染料对其进行染色反应，制备出标准曲线。
(2) 样品处理：将待测样品加入适量的缓冲液中，使其浓度适当稀释。
(3) 加染料：将Bradford染料加入处理好的样品中进行反应。
(4) 摇动混合：将反应溶液摇动混合均匀。
(5) 测量吸光度：利用分光光度计测量吸光度值，并根据标准曲线计算出样品中蛋白质的含量。
四、Lowry法1. 原理Lowry法是一种经典的蛋白质含量测定方法，其原理是利用酚-硫酸反应来检测样品中的蛋白质含量。
测蛋白质含量方法
测蛋白质含量方法测定蛋白质含量是生物化学和生物技术研究中常用的实验手段之一。
蛋白质是生物体内重要的组成部分，其含量的准确测定对于研究细胞功能、药物筛选和疾病诊断具有重要意义。
本文将介绍几种常用的测定蛋白质含量的方法。
一、比色法比色法是一种常用的测定蛋白质含量的方法。
其基本原理是利用蛋白质与染色剂之间的化学反应，通过比色计测量吸光度来确定蛋白质的含量。
常用的染色剂有布拉德福试剂、伯胺蓝试剂和康氏试剂等。
比色法测定蛋白质含量的优点是操作简单、结果准确，但对于一些特定蛋白质可能存在一定的误差。
二、生物素标记法生物素标记法是一种利用生物素与蛋白质之间的亲和性进行测定的方法。
生物素通过共价结合到蛋白质上，形成生物素标记的蛋白质。
然后利用生物素与亲和素结合的特异性，使用亲和素结合物进行测定。
这种方法的优点是具有高灵敏度和高特异性，可以测定低浓度的蛋白质。
三、Western blottingWestern blotting是一种常用的蛋白质检测方法。
它通过将蛋白质样品进行电泳分离，然后转移到膜上，并使用特异性抗体与目标蛋白质结合，最后利用染色剂可视化目标蛋白质。
这种方法可以检测特定蛋白质的存在和相对含量，并且可以检测蛋白质的修饰状态，如磷酸化、乙酰化等。
四、质谱法质谱法是一种高灵敏度的蛋白质检测方法。
它通过将蛋白质进行消化，得到肽段，然后利用质谱仪进行分析。
质谱法可以用于鉴定未知蛋白质的结构和确定蛋白质的修饰位点，同时也可以测定蛋白质的相对含量。
测定蛋白质含量的方法有很多种，每种方法都有其特点和适用范围。
在选择方法时，需要根据实验目的、样品的性质和实验条件等因素进行综合考虑。
此外，根据实验的要求和需求，也可以结合多种方法进行蛋白质含量的测定，以提高结果的准确性和可靠性。
三种常见蛋白质含量测定方法
三种常见蛋白质含量测定方法
蛋白质含量是决定植物质量的重要因素，在植物栽培及种子货架上，精确掌握植物蛋白质含量，进而为植物中品质和效用性提供重要的评价依据。
目前，研究常用的植物蛋白质含量测定方法有Kjeldahl法，Bradford法和Lowry法等三种。
Kjeldahl法是一种多功能性的蛋白质定量方法，它可以测定含氮量甚至微量有机氮，此法在测定蛋白质含量方面易于操作，测试效率高， get精度也较高。
该法简单地以氨作为氮源，以硫酸释放氨，用硫酸钠将氨碱中的氨携带，然后进行缓冲及蒸发水解，最后通过酚酞形成深蓝色络合物对氮进行定量，从而间接的得到蛋白质的含量。
Bradford法同样是一种多用途的法子，它能够直接测定蛋白质中的色氨酸及胆羧酸含量，该方法的操作简便，使用成本低，测试效率高，可在一个小时内达到较高精度的测定结果。
Bradford法原理是将蛋白质及它的沉淀由蛋白质合酶结合至二价铬J络合物，从而形成一种光电的特异性比色反应。
Lowry法也是一种多功能性的定量方法，该方法能测定有机物中蛋白质、氨基酸等氮含量，以及各种物质中的亲合体，操作过程简单，精度也较高，比Kjeldahl法快7倍以上，Lowry法原理是蛋白质分解成其中的氨基酸，通过对色比色反应，底物络合过程自络合金属，再经冷酰膦处理，酰膦中色素降解，形成比色荧光，定量检测氮含量，从而间接得到蛋白质含量。
以上就是蛋白质含量测定常见三种方法。
从Kjeldahl法，Bradford法和Lowry法等三种方法，人们可以很好地掌握植物蛋白质含量，进而为植物中品质和效用性提供重要的评价依据。
蛋白质含量测定方法
蛋白质含量测定方法
一、Lowry法。
Lowry法是一种经典的蛋白质含量测定方法，其原理是利用蛋白质与铜离子和
碱性试剂在碱性条件下发生蓝色化合物的形成，然后通过比色法来测定蛋白质的含量。
这种方法的优点是灵敏度高，适用于各种类型的蛋白质样品，但需要注意的是，样品中的其他成分可能对测定结果产生干扰。
二、Bradford法。
Bradford法是一种快速、简便的蛋白质含量测定方法，其原理是利用共轭蛋白
质与染料结合后产生吸收峰的变化来测定蛋白质的含量。
相比于Lowry法，Bradford法对于样品中存在的干扰物质的耐受性更强，因此在实际应用中更为广泛。
三、BCA法。
BCA法是一种基于铜离子的蛋白质含量测定方法，其原理是利用蛋白质与铜
离子和BCA试剂在碱性条件下发生紫色化合物的形成，然后通过比色法来测定蛋
白质的含量。
与Lowry法相比，BCA法对于一些常见的干扰物质的耐受性更好，
因此在实际应用中也得到了广泛的应用。
四、UV吸收法。
UV吸收法是一种利用蛋白质在280nm处的吸收峰来测定蛋白质含量的方法。
这种方法不需要添加试剂，操作简便，但对于一些特定类型的蛋白质可能存在灵敏度不足的问题。
以上介绍的几种蛋白质含量测定方法各有优缺点，选择合适的方法需要根据具
体的实验要求和样品特性来进行。
在进行蛋白质含量测定时，还需要注意样品的制备、操作的规范性以及仪器的准确性，以确保获得可靠的实验结果。
希望本文介绍的内容能对相关研究工作者有所帮助。
蛋白质含量测定方法汇总[整理]
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蛋白质含量测定方法汇总[整理]蛋白质含量测定是一种用于测定任何生物样品中蛋白质含量的有效测试方法。
此外，蛋白质含量也可以被用于检测不同生物样品中的样本污染程度的指标，以及生物样品中某种从另一个样本污染的量。
现今，存在许多蛋白质含量测定的方法，通常称作“蛋白质测定方法”，它们常用于检测各种类型的高分子生物物质，如蛋白质、核酸、多糖、脂类等。
下面总结了一些常见的蛋白质含量测定方法：1、分子吸光法：分子吸光法是一种常用的蛋白质测定方法，它利用液体或气体样品中分子的光吸收特性来测量蛋白质的含量。
它通过测量样品当量吸收辐射的强度来测量含量，并通过分子结构及激发能获取分子吸收率。
2、酶标法：酶标法是一种常见的蛋白质测定方法，它使用特定酶将蛋白质转化为可测试物质来准确估算样品中蛋白质含量。
此外，也可以用其他物质作为指示物来改变酶反应的速率，从而获取蛋白质含量。
3、体外测定法：体外测定法是一种常见的蛋白质测定方法，它可以任意选择探测，即特定蛋白质向特定外部刺激物反应的速率，以反映样品中的蛋白质含量。
它在分析较新的样品以及批量定量分析中有很大的优势。
4、表面增强拉曼光谱：表面增强拉曼光谱是一种新的蛋白质测定方法，它利用光的调制前后产生的均方根像素来测量蛋白质的含量，这种方法可在低浓度范围内准确定量样品中的蛋白质含量。
5、比多肽配体应答行为水平测定：比多肽配体应答行为水平是一种常见的蛋白质测定方法，它利用特指性多肽核酸探针乙酰化后，在特定条件下发生应答强度及反应速率的改变，从而测量样品中的蛋白质含量。
这是一种可以在短时间内实现高灵敏度和高精度的测定方法。
6、限制性酶体系：限制酶体系是一种常见的蛋白质测定方法，它利用限制性酶来切割或降解蛋白质链，从而得到可用于测定蛋白质含量的切片产物。
限制酶体系也能够有效地检测末端特异性蛋白质种类，以及它们的分布情况。
蛋白质含量测定方法汇总
蛋白质含量测定方法汇总-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1实验七蛋白质含量测定?测定蛋白质的定量方法有很多，目前常用的有染料法，双缩脲(Biuret)法，酚试剂法(Lowry)法及紫外吸收法。
[目的要求]1．掌握测定蛋白质的含量基本方法。
2．了解染料法、双缩脲法、Lowry法和紫外吸收法测定原理。
?一、染料法[实验原理]在酸性溶液中染料考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合，此时考马斯亮蓝G-250颜色从红色变为蓝色，吸收高峰从460nm移至595nm。
利用这个原理可以测定蛋白质含量。
该法近年在某些方面有取代经典的Lowry法趋势，因为它操作简单，反应时间短，染料-蛋白质颜色稳定，抗干扰性强。
本法的缺点是：对于那些与标准蛋白氨基酸组成有较大差异的蛋白质，有一定误差，因为不同的蛋白质与染料的结合是不同的，故该法适合测定与标准蛋白质氨基酸组成相近的蛋白质。
[器材]吸量管；试管；721型分光光度计[试剂]1.标准牛血清白蛋白溶液：配成ml的溶液。
2.待测蛋白质溶液。
3.染料溶液：称取考马斯亮蓝G-250溶于95%的酒精50ml，再加入85%的浓磷酸100ml，用水稀释至1000ml,混匀备用。
[操作步骤]按上表分别向各支试管内加入各种试剂，充分混匀，5min后在595nm波长处以0号管调零,测定各管吸光度值（A）。
以吸光度值为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。
2．样品测定：取1ml样品溶液（约含25～250微克蛋白质），加入染料溶液5ml混匀，5min后测定其595nm吸光度值，对照标准曲线求得蛋白质浓度。
?二、双缩脲(Biuret)法测定蛋白质含量?[实验原理]在碱性溶液中，双缩脲(H2N-CO-NH-CO-NH2)与二价铜离子作用形成紫红色的络合物，这一反应称双缩脲反应。
凡分子中含二个或二个以上酰胺基(—CO-NH2)，或与此相似的基团[如—CH2-NH2，—CS-NH2，—C(NH)NH2]的任何化合物，无论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接相连，均可发生上述反应。
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蛋白质含量测定院系名称食品与生物工程学院学生姓名孙洪磊学号200606021064专业班级生工06 - 2指导教师马美范二○○九年四月一日蛋白质含量测定方法比较蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。
目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。
另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。
其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。
定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。
值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。
每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。
在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。
考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。
一、双缩脲法（Biuret法）（一）实验原理双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。
在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。
凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。
测定范围为1~10mg蛋白质。
干扰这一测定的物质主要硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。
（二）试剂与器材1. 试剂：（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。
如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。
牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05N NaOH配制。
（2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO4•5H2O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6•4H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。
此试剂可长期保存。
若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需重新配制。
2. 器材：可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。
（三）操作方法1. 标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。
充分摇匀后，在室温（20~25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。
用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。
取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。
2、样品的测定：取2~3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。
注意样品浓度不要超过10mg/ml。
二、Folin—酚试剂法（Lowry法）（一）实验原理这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。
过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙的配制较为困难（现在已可以订购），近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。
此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。
这两种显色反应产生深兰色的原因是： 在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。
‚Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。
在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。
Folin—酚试剂法最早由Lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。
以后在生物化学领域得到广泛的应用。
这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。
对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰Lowry反应。
而且对后者的影响还要大得多。
酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。
浓度较低的尿素（0.5%），硫酸纳（1%），硝酸纳（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。
含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液，即可显色测定。
若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1~2倍。
（二）试剂与器材1.试剂（1）试剂甲：（A） 10克 Na2CO3，2克 NaOH和0.25克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6•4H2O）。
溶解于500毫升蒸馏水中。
（B） 0.5克硫酸铜（CuSO4•5H2O）溶解于100毫升蒸馏水中，每次使用前，将50份（A）与1份（B）混合，即为试剂甲。
（2）试剂乙：在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠（Na2WO4•2H2O）,25克钼酸钠（Na2MoO4•2H2O）及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克硫酸锂（Li2SO4），50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。
冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。
稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。
使用时用标准NaOH滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1N左右。
（3）标准蛋白质溶液:精确称取结晶牛血清清蛋白或 g—球蛋白，溶于蒸馏水，浓度为250 mg/ml左右。
牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用0.9 % NaCl溶液。
2. 器材（1）可见光分光光度计（2）旋涡混合器（3）秒表（4）试管16支（三）操作方法1. 标准曲线的测定：取16支大试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分成两组，分别加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升标准蛋白质溶液（浓度为250mg/ml）。
用水补足到1.0毫升，然后每支试管加入5毫升试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温（20～25℃）放置10分钟。
再逐管加入0.5毫升试剂乙（Folin—酚试剂），同样立即混匀。
这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。
然后在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于700nm 处测定各管中溶液的吸光度值。
以蛋白质的量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制出标准曲线。
注意：因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间，即第1支试管加入5毫升试剂甲后，开始计时，1分钟后，第2支试管加入5毫升试剂甲，2分钟后加第3支试管，余此类推。
全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟，则第1支试管可立即加入0.5毫升试剂乙，1分钟后第2支试管加入0.5毫升试剂乙，2分钟后加第3支试管，余此类推。
待最后一支试管加完试剂后，再放置30分钟，然后开始测定光吸收。
每分钟测一个样品。
进行多试管操作时，为了防止出错，每位学生都必须在实验记录本上预先画好下面的表格。
表中是每个试管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的顺序，逐管加入。
最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量（微克）和测得的吸光度值。
Folin—酚试剂法实验表格：管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 标准蛋白质 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0（250mg/ml）未知蛋白质 0.2 0.4 0.6（约250mg/ml）蒸馏水 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.6 0.4试剂甲 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0试剂乙 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5每管中蛋白质的量（mg）吸光度值（A700）2. 样品的测定：取1毫升样品溶液（其中约含蛋白质20~250微克），按上述方法进行操作，取1毫升蒸馏水代替样品作为空白对照。
通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起，同时进行。
即在标准曲线测定的各试管后面，再增加3个试管。
如上表中的8、9、10试管。
根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质量，从而计算出样品溶液的蛋白质浓度。
注意，由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。
因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。
三、考马斯亮兰法（Bradford法）（一）实验原理双缩脲法（Biuret法）和Folin—酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。
1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。
这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。
这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。
经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。
在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。
Bradford法的突出优点是：（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。
这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。
（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。
完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。
由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。
因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。
（3）干扰物质少。
如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。
此法的缺点是：（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用 g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
（二）试剂与器材1. 试剂：（1）标准蛋白质溶液，用 g—球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。