能否用冷冻电子断层成像技术直接观察细胞膜上的离子通道
冷冻电子显微镜技术
冷冻电子显微镜技术在生物大分子的三维结构研究中的应用北京大学医学部生物物理系汪国良摘要冷冻电子显微镜技术的快速发展，使其在生物大分子的结构研究中得到越来越广泛的应用。
对于具有二维晶体结构的生物样品，能够得到其高分辨率的三维重构图像，并直接用于解析其空间结构信息；对于非晶体的样品，虽只能得到低分辨率的三维重构图，但可以为高分辨率的X-射线晶体学和核磁共振波谱学所得到的亚结构提供模型。
此外，通过捕获样品在不同状态的结构信息，研究其构象的动态变化与其功能的关系。
本文从样品准备、数据采集、数据处理等步骤，对冷冻电子显微镜技术在生物大分子的三维结构研究中的应用进行综述，并举例说明这项技术的优越性。
关键词冷冻电子显微镜、电子晶体学、单颗粒、电子断层学、三维重构冷冻电子显微镜技术（cryoelectron microscopy）是从20世纪70年代提出的，经过近10年的努力，在80年代趋于成熟。
它的研究对象非常广泛，包括病毒、膜蛋白、肌丝、蛋白质核苷酸复合体、亚细胞器等等[1]。
一方面，冷冻电子显微镜技术所研究的生物样品既可以是具有二维晶体结构的，也可以是非晶体的；而且对于样品的分子量没有限制。
因此，大大突破了X-射线晶体学只能研究三维晶体样品和核磁共振波谱学只能研究小分子量（小于100KDa）样品的限制。
另一方面，生物样品是通过快速冷冻的方法进行固定的，克服了因化学固定、染色、金属镀膜等过程对样品构象的影响，更加接近样品的生活状态。
现在，冷冻电子显微镜都具备自动图像采集系统。
CCD(charged-couple device)照相机能快速、动态的记录电子衍射图，但由于像素的限制，其分辨率不如照相胶片。
CCD和照相胶片所记录的是生物样品空间结构的二维投影，利用各种计算机软件程序包，可以从电镜的二维图像重构样品的三维结构，即三维重构。
现已开发出许多软件程序包可供计算机处理使用，大大方便了生物样品的结构重构[2]。
冷冻电镜
2、电子显微镜的原理？
电子的波长是光子波长的十万分之一左右，是一根极细的探针，理论上它 打在蛋白质分子这类生物大分子身上能被反射，这些反射的电子就能产生一张 照片，电子显微镜相当于是用电子替代光线来照射物体，由于电子的波长远低 于光波，它能够看到非常小尺度的结构。
冷冻电镜在2013年的技术革命
冷冻电镜的工作流程：
样品的制备 透射电子显微镜成像 结构解析
图像处理
图1 冷冻电子显微学解析结构基本步骤
冷冻电镜技术的操作过程：
1、样品的制备
• 用于冷冻电镜研究的生物大分子样品必须非常纯净。生物样品是在高 真空的条件下成像的，所以样品的制备既要能够保持本身的结构，又 能抗脱水、电子辐射。 • 一种方法是通过快速冷冻使含水样品中的水处于玻璃态，也就是在亲 水的支持膜上将含水样品包埋在一层较样品略高的薄冰内。该方法有 两个关键步骤：一是将样品在载网上形成一薄层水膜；二是将第一步 获得的含水薄膜样品快速冷冻。 • 另一种方法是通过喷雾冷冻装置（spray-freezing equipment），利用 结合底物混合冰冻技术(spray-freezing)，可以把两种溶液（如受体和 配体）在极短的时间内混合起来 (ms量级)，然后快速冷冻，将其固定 在某种反应中间状态，这样能对生物大分子在结合底物时或其他生化 反应中的快速的结构变化进行测定，深入了解生物大分子的功能。
冷冻电镜的发明及其在生物学的应用
报告人：XXX
冷冻电镜是什么？
冷冻电子显微镜技术（cryoelectron microscopy） 简称
现代电子显微镜技术在病毒检测中的应用进展
西藏医药2021年第42卷第2期（总155期）142明益气活血汤可降低患者心衰、死亡等的风险。
观察两组患者治疗前后心功能指标发现，治疗后治疗组患者的心功能改善情况较好，提示益气活血汤可改善患者的心脏收缩舒张功能，而两组治疗后LVEDd 水平未见明显差异，表明合用益气活血汤未缩小舒张末心脏内径，可能与观察的时间较短有关。
综上所述，气阴两虚AMI 患者冠脉介入术后采用西药联合益气活血汤治疗的效果较好，可改善患者心功能，可能与降低氨基末端脑钠肽前体、脂蛋白相关磷脂酶A2水平有关。
【参考文献】[1]门长英. 自拟益气活血利水汤治疗气阴两虚型冠心病慢性心力衰竭53例临床观察[J]. 中外医疗, 2012, 031(013):127-127.[2]李俊龙, 金政, 皮健彬,等. 益心活血丸对气阴两虚证急性ST 段抬高型心肌梗死经皮冠状动脉介入术后患者临床疗效及心功能的影响[J]. 中医杂志, 2019,60(11):949-953.[3]陈菊明, 韩平. 自拟保生汤辅助治疗气阴两虚急性心肌梗死疗效观察[J]. 四川中医, 2019,13(8):78-80.[4]吕静静. 益气通痹汤联合替罗非班对急性心肌梗死患者PCI 术后心肌保护的作用观察[J]. 中国合理用药探索, 2019,16(7):63-65.[5]王创国, 贾高鹏. 早期应用低分子肝素在急性心肌梗死患者溶栓治疗中的效果及对心功能的影响[J]. 临床医学研究与实践, 2019,5(16):40-42.[6]姚丽, 张剑波, 李永星,等. 重组人B 型钠尿肽对急性心肌梗死后心力衰竭患者心功能及心率变异性的影响[J]. 中国中西医结合急救杂志, 2019,26(1):50-53.[7]马晶, 张瀛月, 李海燕,等. 融合心脏康复治疗对心肌梗死患者心肺运动功能和心理状态的影响[J]. 中华老年多器官疾病杂志, 2019,18(10):721-725.[8]向芳. 救心汤对心肌梗死后心功能3级及以上患者脑钠肽的临床疗效[J]. 世界临床医学, 2017, 11(12):74,77.[9]罗子幸, 王文会, 贺青军,等. 参七益气活血汤治疗心肌梗死的临床效果及对生活质量的影响[J]. 中国现代医生, 2019,57(20):133-135,139.[10]陈雪云. 西医联合黄芪保心汤治疗扩张型心肌病心力衰竭对患者心功能及神经内分泌因子的影响分析[J]. 中医临床研究, 2019,11(20):26-28.[11]王群. 心脉隆注射液联合左西孟旦对急性心肌梗死后心力衰竭老年患者的疗效及炎症因子分析[J]. 世界复合医学, 2019,15(7):10-12.本文责任编辑 王聚乐●讲座·综述●现代电子显微镜技术在病毒检测中的应用进展丁巳娟 韩起 陈生林 冯东方西藏军区总医院 西藏拉萨 850000摘要 电子显微镜应用于病毒研究的历史悠久，为许多人类重大传染病致病因子的发现做出了重要的贡献。
细胞生物学考试模拟题及答案
细胞生物学考试模拟题及答案一、单选题（共100题，每题1分，共100分）1.为细胞生长提供重要的细胞因子,以及其他支持贴壁生长的大分子物质等A、COB、血清C、胰蛋白酶-EDTA溶液D、青链霉素E、L-谷氨酰胺正确答案：B2.关于冷冻割断技术的错误叙述是A、细胞常在膜脂质双层的疏水部位被割断B、生物样品在割断前需经液氮的快速冷冻处理C、是一种特殊的电镜样品制备技术D、用该技术所制标本可研究细胞膜的内部构造E、细胞经割断后无需处理可直接在扫描电镜下观察正确答案：E3.维持蛋白质一级结构的主要化学键是A、肽键B、离子键C、疏水键D、二硫键E、氢键正确答案：A4.利用电子显微镜所观察到的细胞结构A、细胞三维立体结构B、蛋白质一级结构C、生物大分子空间构象D、超微结构E、显微结构正确答案：D5.tRNA的结构特点不包括A、含甲基化核苷酸B、5′端具有特殊的帽子结构C、二级结构呈三叶草形D、有局部的双链结构E、含有二氢尿嘧啶环正确答案：B6.LDL通过受体介导的胞吞作用进入细胞,然后与溶酶体结合并且被降解,LDL的入胞过程是A、识别—包被小窝—无被小泡—有被小泡B、识别—包被小窝—有被小泡—无被小泡C、包被小窝—识别—无被小泡—有被小泡D、识别—有被小泡—无被小泡—包被小窝E、识别—有被小泡—包被小窝—无被小泡正确答案：B7.关于溶酶体的发生,正确的叙述是A、溶酶体蛋白经跨膜转运直接进入溶酶体B、溶酶体的膜脂来自质膜C、溶酶体是异质性细胞器D、溶酶体蛋白的分选标志是葡萄糖-6-磷酸E、溶酶体蛋自在胞质溶胶中合成正确答案：C8.RNA分子中能作为转运氨基酸工具的是A、miRNB、hnRNC、tRNAD、rRNAE、mRNA正确答案：C9.决定红细胞血型的物质是A、氨基酸B、磷脂C、脂蛋白D、胆固醇E、糖链正确答案：E10.关于低密度脂蛋白受体的错误叙述是A、与低密度脂蛋白特异性结合B、其合成受到细胞内游离胆固醇含量的影响C、由多个穿膜糖蛋白构成的蛋白复合体D、参与受体介导的胞吞作用E、与家族性高胆固醇血症的发生有关正确答案：C11.生物样品在进行显微观察前一般需要进行固定。
冷冻电镜技术PPT课件
1 冷冻电镜技术的概述
什么是Cryo-EM
冷冻电镜即冷冻电子显微镜 (cryo-electron microscopy，cryo-EM)，是将生物大分子快速冷 冻后，在低温环境下利用透射电子显微镜对样 品进行成像，再经图像处理和重构计算获得样 品的三维结构。
4
1 冷冻电镜技术的概述
看清楚分子级别的结构必须用电子显微镜
蛋白原子水平的三维结构模型，第一个用冷冻电镜解析出来的
膜蛋白结构。
13
冷冻电镜技术的发展 2
细菌视紫红质3D结构
1975年，Richard Henderson（理查德·亨德森）利用电子显微三 维重构技术首次获得7埃分辨率的细菌视紫红质3D结构的历史性突破。 这是人们首次观测到膜蛋白的跨膜螺旋三维结构。
冷冻电镜技术 Cryo-EM
1
1 冷冻电镜技术的概述
什么是Cryo-EM、冷冻电镜的分类
目
C
O录
N T E N T S
2 冷冻电镜技术的发展
1968—→Now
3 冷冻电镜技术的原理
样品冷冻、冷冻成像、三维重构
4 冷冻电镜技术的应用
结构生物学、医疗、具体应用场景
2
1
PA R T
冷冻电镜技术的概述
3
形成冰晶体的玻璃态冰包埋样品
2013
冷冻电镜三维重构技术确 定蛋白质TRPV1结构，标 志着冷冻电镜跨入“原子
分辨率”时代
1974
Robert Glaeser首次提出并进行 了冷冻含水生物样品的电镜成像。
1981
Joachim Frank完成了单颗粒
三维重构算法及软件Spider。
1990 Ric年hard Henderson利用冷冻电镜技术获得了细菌视紫红质
2022-2023学年全国高中高二下生物人教版期末试卷(含解析)
2022-2023学年全国高二下生物期末试卷考试总分：105 分考试时间： 120 分钟学校：__________ 班级：__________ 姓名：__________ 考号：__________注意事项：1．答题前填写好自己的姓名、班级、考号等信息;2．请将答案正确填写在答题卡上;卷I（选择题）一、选择题（本题共计 14 小题，每题 5 分，共计70分）1. 细胞是物质、能量、信息的统一体。
细胞形态多样，也有许多共性，下列关于原核细胞与真核细胞共性的描述，错误的是（）A.构成生命大厦的生物大分子都以碳链为骨架B.都以染色体作为遗传物质的主要载体C.都以核糖体作为遗传信息翻译的场所D.都以ATP作为生命活动的主要直接供能物质2. 小肠绒毛上皮细胞膜上存在着两种运输葡萄糖的载体SGLT1（主动运输的载体）和GLUT2（协助扩散的载体），研究人员通过实验绘制如图所示曲线。
下列说法错误的是（）A.该实验可以用来探究不同浓度葡萄糖条件下的主要吸收方式B.在较高葡萄糖浓度下，细胞主要依赖协助扩散来增大吸收速率C.小肠绒毛上皮细胞膜上存在SGLT1和GLUT2的根本原因是基因选择性表达D.葡萄糖分子在不同的浓度下都可通过主动运输和协助扩散两种方式进入细胞3. 如图为酵母细胞中某种酶分子的作用过程模式图。
下列相关叙述正确的是（）A.图中的酶分子合成的场所是核糖体B.该酶分子通过提供能量使底物的磷酸二酯键断裂C.酶和底物之间的碱基配对方式决定了该酶的特异性D.适当的低温和高温交替变化有利于该酶发挥作用4. 我国科学家颜宁运用冷冻电子显微镜技术解析了人葡萄糖运载体的空间结构及其功能，冷冻电子显微镜技术可使生物组织样品中的水冷冻为玻璃态，能够保持分子及细胞正常功能下的结构。
以下叙述正确的是（）A.冷冻电子显微镜下观察到的细胞结构，属于显微结构B.冷冻电子显微镜技术能使生物组织保持正常生理功能C.冷冻电子显微镜下细胞中的自由水全部转变为结合水D.人体所有细胞的细胞膜上都具有运输葡萄糖的载体蛋白5. 已知某种植物花的颜色受若干对独立遗传的等位基因（相关等位基因如果是1对，则用A 与a ；如果是2对，则用A 与a 、B 与b 表示，依此类推）的控制。
药物分析中的生物成像技术研究
药物分析中的生物成像技术研究随着科技的不断发展和医学领域对药物研究的需求增加，生物成像技术在药物分析中的应用变得越来越重要。
生物成像技术通过对生物体内部进行非侵入性的成像观察，能够提供关于药物在体内分布、代谢和作用等方面的重要信息。
本文将探讨药物分析中常用的几种生物成像技术，并分析其在药物研究中的应用。
一、放射性示踪剂技术放射性示踪剂技术是将放射性同位素标记在药物分析中使用的示踪剂上，然后通过放射性成像设备观察药物在体内的分布情况。
该技术可以提供药物的代谢途径、药物在目标器官的靶向性以及药物在体内的代谢速度等重要信息。
例如，通过将放射性同位素标记在药物上，研究人员可以观察到药物在体内的代谢动态，从而了解药物的代谢途径和代谢产物是否有毒副作用。
二、磁共振成像技术磁共振成像技术利用磁共振原理观察生物组织内部的图像，可提供高分辨率的解剖学信息。
在药物分析中，磁共振成像技术可以用来观察药物在体内的分布情况、药物与目标器官的相互作用等。
例如，研究人员可以利用磁共振成像技术观察药物在肿瘤组织中的分布情况，评估药物的靶向性和治疗效果。
三、荧光成像技术荧光成像技术利用荧光染料标记药物，通过荧光显微镜观察药物在体内的分布和作用。
荧光成像技术具有分子水平的分辨能力，可以提供药物在细胞和组织水平上的详细信息。
例如，研究人员可以利用荧光成像技术观察药物在癌细胞内的分布情况，评估药物的渗透性和药效。
四、正电子发射断层成像技术正电子发射断层成像技术是一种功能性成像技术，通过放射性同位素标记在药物上，观察药物在体内的分布和代谢。
该技术可以提供关于药物在体内的生物学过程、代谢途径以及目标器官的代谢状况等信息。
例如，研究人员可以利用正电子发射断层成像技术观察药物在脑部的分布情况，研究药物对神经系统的作用。
总结起来，生物成像技术在药物分析中具有重要的应用价值。
放射性示踪剂技术、磁共振成像技术、荧光成像技术和正电子发射断层成像技术是常用的生物成像技术，它们通过不同的原理和方法提供了药物在体内的不同角度的观察。
冷冻电镜的原理及分类
冷冻电镜的原理及分类冷冻电镜（Cryo-EM）是一种用于生物样品的高分辨率电子显微镜技术。
它允许研究人员在生物冷冻状态下研究细胞和蛋白质的结构，而无需对样品进行固定、染色或晶化。
冷冻电镜的原理是将样品冷冻在液氮温度下（约-196），以减少辐射损伤和质子晃动，然后使用电子束照射样品，最后通过记录电子束传导，获得样品的二维或三维影像。
冷冻电镜的分类可以基于使用的技术和设备。
以下是几种常见的冷冻电镜分类：1. 传统冷冻电镜：传统冷冻电镜采用冷冻固化和真空干燥技术对样品进行制备。
样品通常需要固定、切片、冷冻，并通过真空干燥以降低样品的温度和压力，最后使用电子束对样品进行成像。
由于使用了真空干燥技术，这种冷冻电镜不能适应水性样品。
2. 高压冷冻电镜：高压冷冻电镜通过在高压下以固态冷却样品，然后通过电子束成像样品。
这种技术可以更好地保持样品的原始结构和水性环境，避免固定和干燥过程中可能引起的伪像。
3. Cryo-FIB（冷冻聚焦离子束）电镜：Cryo-FIB电镜通过将样品的冷冻微切片与聚焦离子束成像技术相结合，实现冷冻样品的切片和成像。
这种技术可以用于获得冷冻样品的三维结构信息。
4. Cryo-ET（冷冻电子断层术）电镜：Cryo-ET电镜将冷冻样品的序列二维图像重建成三维图像。
这种技术通过拍摄样品的序列图像，然后利用计算机算法将这些二维图像组合成三维模型。
冷冻电镜作为一种高分辨率的电子显微镜技术，具有很多应用领域。
它可以被广泛应用于生物学、生物医学、药物研发等领域，用于研究和理解蛋白质的结构和功能。
冷冻电镜可以帮助科学家揭示生物分子及其复合物的大量结构信息，为药物设计和疾病研究提供重要的参考和依据。
冷冻切片电子显微成像技术原理及应用研究
冷冻切片电子显微成像技术原理及应用研究近年来，随着科学技术的不断更新迭代，冷冻切片电子显微成像技术（Cryo-EM）在生命科学领域的地位日益建立。
这项技术可被用于大规模分析许多生物体系，包括大分子蛋白质、如病毒和细胞器、以及膜蛋白复合物。
本文将介绍Cryo-EM技术的工作原理、概述技术历史，以及展示当前Cryo-EM技术的一些显著应用案例。
一、Cryo-EM 的工作原理与历史Cryo-EM 是一种可观察各种生物体系超高的分辨率的技术，它将使用任何分子结构的高清晰图片对称性和某些相对情况进行分析。
在传统的电子显微镜中，需要将样品放在液态的金属物质中来实现其凝固，这有时对样品的结构和形状产生不可逆的损伤。
而Cryo-EM利用液氮（或者其他极低温度的物质）来固化样品，从而避免可能会发生的伤害。
当样品被冻结后，Cryo-EM就会通过向样品中发送电子束，然后通过检测这些电子束经过样品发生的扰动来生成图像。
这些图像表示了样品的外部轮廓到最小的物质单元的细微结构。
Cryo-EM起源于20世纪50年代的制备样品冷冻技术，这种技术让样品在冷冻过程中减少了旋转扭曲和其他可能的化学或物理变化。
在1990年代，Cryo-EM 开始被应用于细胞学和生物分子成像，然而，那时它仍然在精度、速度和分辨率方面存在一些限制。
直到最近十年左右，Cryo-EM 的真正潜力才逐渐被揭示出来，并通过如凝聚态生物领域中的一些关键成果而引起了广泛的关注。
二、Cryo-EM 的应用案例1、细胞生物学Cryo-EM 这种较新的技术方向使得研究人员能够观察和分析细胞生物学中多样化的系统——从样品中的分子组成到大的亚细胞结构。
为此，Cryo-EM 已经在肿瘤学、神经科学和感染病原体研究等许多研究领域占有重要的角色。
2、冷冻电子显微学与药物开发另一个 C ryo-EM 应用领域是进行药物开发，即通过 C ryo-EM 对β-介导的药物和与特定生化途径相关的膜蛋白复合物进行扫描和图像化。
冷冻电镜技术知识分享
冷冻扫描电镜技术一般是在普通扫描电镜上加装低温冷冻传输系统和冷冻样品台装置，它是在扫描电镜 的基础上发展起来的一种技术，可以直接观察液体、半液体的样品，不需要对样品进行干燥处理，最大
程度地减少了常规的干燥过程对高度含水样品的影响。
冷冻蚀刻电子显微镜（ F r e e z e - e t c h i n g ）
冷冻电镜单颗粒三维重构算法
1981年，Joachim Frank（约阿希姆·弗兰克）完成了单颗粒三维重 构算法及软件Spider，利用计算机识别图像把相同蛋白质的不同影子收集 起来，并且将轮廓相似的图像进行分类对比，通过分析不同的重复模式 将图片拟合成更加清晰的2D图像。在此基础上，通过数学方法，在同一 种蛋白质的不同2D图像之间建立联系，以此为基础拟合出3D结构图像。 单颗粒三维重构算法对于实现无需结晶的蛋白质三维结构解析至关重要， 弗兰克的图形拟合程序被认为是冷冻电镜发展的基石。
形成冰晶体的玻璃态冰包埋样品
2013
冷冻电镜三维重构技术确 定蛋白质TRPV1结构，标 志着冷冻电镜跨入“原子
分辨率”时代
1974
Robert Glaeser首次提出并进行 了冷冻含水生物样品的电镜成像。
1981
Joachim Frank完成了单颗粒 三维重构算法及软件Spider。
1990 Ric年hard Henderson利用冷冻电镜技术获得了细菌视紫红质
蛋白原子水平的三维结构模型，第一个用冷冻电镜解析出来的 膜蛋白结构。
冷冻电镜技术的发展 2
细菌视紫红质3D结构
1975年，Richard Henderson（理查德·亨德森）利用电子显微三 维重构技术首次获得7埃分辨率的细菌视紫红质3D结构的历史性突破。 这是人们首次观测到膜蛋白的跨膜螺旋三维结构。
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能否用冷冻电子断层成像技术直接观察细胞膜上的离子通道/受体？
cryo—ET是冷冻电镜技术与三维扫描成像相结合的产物，相对于传统的研究方法具有两大明显优点，一是保证了样品的完整性，样品是通过材料和专一性的冷冻剂快速结合而制备成功的，避免了样品的染色、固定、脱水等损伤细胞结构的处理过程，因此所得样品接近天然状态，从而使获得的图像更加逼真地反映真实的结构；二是实现了更高的分辨率，cryo—ET充分发挥高分辨率(<5nm)的三维成像技术潜能，同时联合图案识别技术(pattern recognition technique)，使我们能够绘制出细胞内的分子图案。
冷冻电子断层成像技术的优越性使得在理论上直接观察细胞膜上的膜蛋白成为了可能，但实际运用仍需有技术上的重大突破。
在1959年，J.D.Robertson用超薄切片技术获得了清晰的细胞膜照片，显示暗-明-暗三层结构，厚约7.5nm。
而cryo-ET的分辨率最好能够达到4~5nm,在细胞膜上断层成像获得足够一系列倾斜样品的断层图是技术上的一个挑战。
因此，cryo-ET主要用于分子量大于400kD的结构在细胞中的精确定位，或者观察线粒体、高尔基体等细胞器甚至整个细胞的三维结构。
例如，Medalia等人用冷冻电子断层成像术重构了网柄菌细胞的胞质结构,从中可清楚地看到以肌动蛋白为主的细胞骨架系统和细胞膜以及胞质里的一些大分子的空间连接关系。
Cryo-ET直接观察膜蛋白的信噪比非常低。
在细胞的整个蛋白质组中，膜蛋白占到30%~40%，包括各种受体、离子通道、离子泵、分子转运体和膜酶等，有镶嵌、内含、穿膜三种状态，因此膜蛋白密度比较高，在电镜图像中会出现蛋白图像的重叠，而且磷脂双分子层的密度接近膜蛋白，如何除去磷脂双分子层的图像背景也是一个棘手的问题。
Cryo-ET的优势和劣势都很明显，其优势在于能解析复杂体系在近生理环境下的结构；劣势则由于生物样品的特性，结构解析对大多数样品不可能达到原子分辨率的水平。
如果cryo-ET能将分辨率提高到2～3nm,再结合X射线晶体学和核磁共振技术得到的蛋白质单个组分的高分辨率精细结构,就有可能得到高分辨率的复合体结构，从而间接观察到离子通道。