戊巴比妥钠和异氟烷对大鼠急性应激反应的影响

戊巴比妥钠和异氟烷对大鼠急性应激反应的影响麻醉前处死动物可能会干扰应激研究腹腔注射戊巴比妥钠和异氟烷吸入不影响大脑mRNA水平腹腔注射造成额外的应激和干扰血浆皮质酮异氟烷吸入在应激反应伦理上最理想研究背景：麻醉后处死动物在应激方面的研究是普遍的，但是麻醉对结果的影响研究不足。

我们的目的是探究不同麻醉剂的影响，如在大鼠急性应激反应时腹腔注射戊巴比妥钠或吸入异氟烷。

方法：将大鼠随机分为电击（FS）和非应激对照组，进一步设定处死程序：直接斩首，腹腔注射戊巴比妥钠或吸入异氟烷后斩首。

再设定一组对照组腹腔注射生理盐水后断头处死。

测定血浆皮质酮（CORT），睾酮和雌二醇，下丘脑应激相关分子表达的促肾上腺皮质激素释放激素，血管加压素和催产素，与额叶相关分子表达的NMDA受体NR2B亚单位，GABAA受体和神经元烟碱型乙酰胆碱受体。

结果：直接斩首组和异氟烷电击（FS）显著增加血浆皮质酮（CORT），而腹腔注射戊巴比妥钠注射后，这种应激反应未出现。

非应激对照组动物，无论是注射生理盐水还是戊巴比妥钠都引起的血浆皮质酮（CORT）显著增加。

各组间性激素水平和大脑中的相关分子mRNA的表达差异显著。

结论：混合注射麻醉导致动物应激反应，妨碍了血浆皮质酮（CORT）水平，但影响血浆性激素水平和大脑mRNA的表达。

异氟烷吸入应激反应影响较少，而且从实验动物伦理的角度来看，也是最理想的。

1.简介应激反应与情感性精神障碍病因学的关系[ 1 ]促进了动物模型应激反应的研究。

压力调节系统如下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴活动已在不同的应激活动下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）活性研究是由促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）驱动的物质主要来自下丘脑室旁核（PVN）的下丘脑。

HPA轴的最终目标的压力荷尔蒙激素，这主要是在大鼠皮质酮（CORT）。

我们和其他组发现性激素如睾酮（T）、雌二醇（E2）和神经肽，如精氨酸加压素（A VP）和催产素（OXT），在压力反应[ 2 ]起重要调节作用。

处死动物的方式来研究可能的混淆作用引起了我们的关注。

相关的生物学研究处死动物一般有两种方法：直接断头或给药后麻醉断头。

断头可能是一个潜在的额外的压力，这也取决于研究者的经验，会影响研究结果[ 3 ]。

无意识的麻醉药似乎减少了额外的压力[ 4 ]。

然而，一些药物，如苯巴比妥，也会引起额外的应激反应，表现为增加血浆CORT水平[5,6]。

此外，麻醉剂影响兴奋性受体抑制大脑的活动，包括N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体NR2B亚单位与神经元烟碱型乙酰胆碱受体（nnachr），通过抑制受体刺激如GABAA 受体（GABAAR）[ 7 ]。

到目前为止是否经常使用麻醉剂如腹腔注射（ip）戊巴比妥钠或异氟烷吸入可能影响大鼠脑mRNA表达与在急性应激反应有关的分子，也不清楚腹腔注射戊巴比妥钠如何引起动物的附加应激。

因此我们分析了经验丰富的研究员用不同方式处死动物的影响，大鼠腹腔注射戊巴比妥钠和吸入异氟烷后电击（FS）和不刺激对照组比较，比较内容包括血浆CORT，T和E2水平，下丘脑CRH mRNA水平，A VP和OXT，与额叶NMDA-NR2B、GABAAR、mRNA和nnAChR的表达水平。

2.实验方法2.1伦理陈述所有动物使用和实验均按照实验动物的使用和保护指南(National Research Council, 1996, USA)，经中国国家委员会浙江分会批准。

尽最大努力来减少动物的痛苦，并尽可能少用动物（更多细节见补充材料1）。

2.2电击大鼠雄性SD大鼠（体重300-330g），饲养在25-27℃房间，12h明暗交替，自由摄食饮水。

给予一周时间适应环境。

拟定0.5mA电刺激5s，然后间隔25min。

动物居住条件和卫生细节连同FS协议见辅助材料1.将大鼠随机分为7组：1）对照或2）FS通过直接断头处死大鼠（分别为黄连解毒汤，FSD）；3）控制或4）腹腔注射3.5%戊巴比妥钠（3ml/kg）5分钟后FS大鼠断头处死（分别为和FSP）；5）对照或6）4%异氟醚在吸氧后1–2分钟FS大鼠断头处死（综合技术研究所或FSI组）；7）额外的对照组腹腔注射生理盐水（3毫升/公斤）5分钟后断头处死（CTR）。

每组7只或8只大鼠。

由相同的研究人员，电击（FS）30分钟内处死动物，实验在每日15:00-16:00之间。

采血、离心、收集血浆。

迅速取出大鼠大脑、下丘脑和额叶进行解剖。

根据Paxinos和Watson的图集[ 10 ]下丘脑解剖位置是前囟点1.7mm。

所有的样品都是立即冻结并存储在−80°C直到进行检测。

所有程序均符合当地动物保护委员会的有关规定和法律。

2.3血浆激素水平测定采用酶联免疫法测定血浆CORT水平(RE52211, IBL Corporation, Germany)。

变异(CV)的内和间变异系数分别为3.38%和10.50%。

用放射免疫分析法检测血浆T水平(IM1087, Immunotech Corporation, USA)，一个内和批间CV分别为2.6%和11.9%。

通过酶联免疫试剂盒测定血浆E2水平(ADI-900-174, Enzolifesciences Corporation, USA)，一个内和跨3.9%和11.37%的CV，分别。

2.4定量逆转录聚合酶链反应（PCR）在下丘脑和额叶的mRNA表达分析对下丘脑CRH，A VP mRNA与额叶NR2B，GABAAR和nnachr表达水平的检测方法是光电导继电器Q-PCR。

总之，全部RNA用Trizol提取剂和基因与PrimeScript RT试剂盒合成。

Q-PCR采用Bio-Rad cfx96触摸荧光PCR仪进行比[ 11 ]。

所有的程序都是按照制造商的指示进行的。

引物对CRH，A VP，OXT，NR2B，GABAAR-受体，nnachr和β肌动蛋白mRNA设计与程序Primer Premier 5。

作为管家基因（见辅助材料2）2.5统计当数据被发现是不是正态分布，采用非参数测试。

多组比较，第一–沃利斯试验采用Kruskal，如果有显著性差异，组间比较进一步进行–Mann Whitney U检验。

P＜0.05被认为是重要的。

3.结果3.1血浆激素水平FSD组血浆激素明显升高（P＜0.001），但是和CTRD组相比T检验（P=0.834）或E2 levels（P=0.248）无显著差异。

图1类似结果被观察到，当FSI组和CTRI组相比较，血浆CORT水平显著升高（P＜0.001）。

血浆T（P=1.000）和E2 Levels（P=0.563）没有出现明显的变化。

相比之下，FSP集团并未显示血浆CORT显著变化（P = 0.132），T（P = 0.848），或E2水平（P = 0.949）与CTRP组比较（图1）。

此外，两CTRP（P = 0.008）和点击率（P = 0.004）组明显高于血浆CORT水平比CTRD组，而综合技术研究血浆CORT水平（P = 0.248）与CTRD组比较未显示出有显著差异（图1）。

下丘脑或额叶相关分子表达3.2 下丘脑和额叶相关分子表达在电击FS刺激处死大鼠实验无任何组在下丘脑CRH，A VP mRNA表达和催产素或额叶NR2B，GABAAR，和nnachr有显著性差异（图2）。

图24．讨论目前研究表明，断头前腹腔注射戊巴比妥显著增加基础血浆CORT水平，这可能会影响研究结果。

另一方面，断头前异氟烷吸入麻醉不影响基础血浆CORT水平。

事实上，生理盐水腹腔注射对照组增加基础血浆CORT水平，表明是腹腔注射而不是戊巴比妥造成额外的刺激。

我们还发现，麻药的使用，即腹腔注射戊巴比妥和吸入异氟烷，电击FS 30min后不干扰测量脑应激相关mRNA分子表达。

我们发现，FS后直接断头处死大鼠或吸入异氟烷后断头处死大鼠显著增加血浆CORT水平，这与之前的研究是一致的[ 12 ]。

然而，由于在非FS组皮质醇水平升高，这种应激反应在腹腔注射戊巴比妥钠注射液组没有出现。

由于腹腔注射戊巴比妥钠和腹腔注射生理盐水造成的对照组血浆CORT相似的增长，而额外增加血浆CORT水平在异氟烷组或直接断头对照组未出现，额外的应激明确是来自注射本身，而不是对戊巴比妥钠化合物的效果，混淆了结果。

应该指出的是，FS电击雄性SD大鼠20min后我们没有观察到血浆中T、E2水平或下丘脑CRH，A VP和oxtmrna水平或在额叶皮层NR2B，nnachr GABAA受体mRNA 的表达显著差异。

在某些区域的某些相关分子的表达可能没有回应，直到30分钟或更多的雄性SD大鼠的应激后。

在下丘脑PVN CRH mRNA开始明显增加，2 h和1 h的A VP mRNA开始增加约束应力[ 13 ]出现，虽然2小时固定[ 14 ]后OXT mRNA没有显示变化，可4小时腹腔注射高渗盐水后显著增加[ 15 ]。

这些数据可以解释在我们的研究中观察到的与应激有关的分子改变mRNA的表达。

应当指出，然而，那其他一些分子mRNA的表达，如黑皮质素受体亚型4（MC4R）和阿黑皮素原，表明雄性SD大鼠下丘脑显著增加，在30分钟内从一个类似的FS电击刺激开始，在杏仁核的[ 16 ] CRH mRNA和MC4R基因mRNA表达明显增加，说明FS引发变化的分子和脑区时相关的。

我们数据表明，电击30min后，断头前麻醉大鼠不影响下丘脑和额叶相关分子血浆激素水平或mRNA的表达，但实施方式可能影响血浆CORT水平，异氟烷吸入后断头似乎维持应激反应的完整，而且从伦理学角度也是应激反应研究的最佳选择。