基因工程-第3章-核酸操作的基本技术

第三章 核酸操作的基本技术
3.1 碱抽提法提取DNA
碱变性抽提法又称碱抽提法或碱裂解法，是一 种用的最广泛的制备质粒DNA的方法，是当今 分子生物学研究中的常规方法。碱变性抽提法 是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的 差异而达到分离目的。在pH值达到12.6的碱性 条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构 解开而变性，质粒DNA的大部分氢键也断裂， 但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全 分离。当以pH4.8 的NaAc高盐缓冲液调节其Ph 至中性时，变性的质粒ＤＮＡ又恢复原来的构 型，保存在溶液中，而染色体ＤＮＡ不能复性
而形成缠连的网状结构。通过离心，染色体Ｄ ＮＡ与不稳定的大分子ＲＮＡ、蛋白质－ＳＤ Ｓ复合物等一起沉淀下来而被除去。
碱变性抽提质粒ＤＮＡ，除了菌体培养、质粒 扩增和收集菌体外，其提取过程大体分为三个 步骤：（１）从染色体ＤＮＡ中分离质粒ＤＮ Ａ。（２）去除质粒ＤＮＡ中的ＲＮＡ。（３） 进一步纯化质粒ＤＮＡ，去除蛋白质等杂质。
3.1.1 碱抽提法所用各类试剂 的生化作用
（１）溶菌液中的溶菌酶是糖苷水解酶，能水 解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的Ｂ－ １，４糖苷键，因而具有溶菌作用。
（２）NaOH-SDS液：核酸在pH５.９的溶液中 是稳定的，但当pH>１２ 或pH<３时，就会引 起双链之间氢键的解离而变性。ＳＤＳ是离子 型表面活性剂，它可以溶解细胞膜上的脂质与 蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜、解聚
（８）饱和酚：因为酚与水有一定的互 溶，苯酚用水饱和的目的是使其抽提Ｄ
ＮＡ过程中，不致吸收样品中含有ＤＮ Ａ的水分，减少ＤＮＡ的损失。用Ｔris 调节pH为８是因为ＤＮＡ在此条件下比 较稳定。
质粒DNA的小规模提取－碱裂解法
1）接种一单菌落于3ml含70μl/ml Amp的LB液 体培养基中。200转/分37℃振荡培养过夜（约8 －10h）。12000rpm离心1min收集细菌。
细胞中的核蛋白，还能与蛋白质结合成 为Ｒ－Ｏ－ＳＯ－３…R+－蛋白质的复合 物，使蛋白质变性而ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ淀下来。但是Ｓ
ＤＳ能抑制核糖核酸酶的作用，所以在
以后的提取过程中，必须把它去除干净， 防止它影响Raase的活性。
（３）ＮaＡc的水溶液呈碱性，为了调 节pH至4.8，必须加入大量的冰醋酸。目 的是把pH12.6的抽提液调节至中性，使 变性的质粒ＤＮＡ能够复性，并能稳定 存在。而高盐的３mol/L NaAc有利于变 性的大分子染色体ＤＮＡ、ＲＮＡ、以 及ＳＤＳ－蛋白复合物的凝聚而沉淀之。
心5min，弃上清，加入70％乙醇沉淀。
7）离心弃上清，真空抽干，去除痕量乙醇。
8）加入50μl TE并加入1μl RNase放入37℃水浴 1h。
9）0.7%琼脂糖电泳检测其含量。
3.1.2 碱抽提法抽提DNA过程 中应注意的问题
（1） 染色体DNA、蛋白质与RNA是否去除干 净，是否获得一定得率的质粒DNA。
小规模制备质粒ＤＮＡ的特点是可以一次制备 多种质粒ＤＮＡ，速度快、省时间、步骤简化、 ＤＮＡ纯度好，可以用于酶切、连接，甚至多 纯化几次还可作双链ＤＮＡ序列分析的模板等 常规基因工程操作之用。主要有下列方法：
有煮沸法、９６孔微量滴定板法、碱变性ＳＤ Ｓ和和ＳＥＴ法、单链质粒ＤＮＡ的小量制备 法、不需要苯酚抽提的质粒ＤＮＡ的小量制备 和用商品化试剂盒制备质粒ＤＮＡ等。
（４）乙醇：ＤＮＡ溶液是ＤＮＡ以水 合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇 会夺去ＤＮＡ周围的水分子，ＤＮＡ失 水而易于聚合。一般实验中，是加２倍 体积的无水乙醇与ＤＮＡ相聚合，其乙 醇的最终含量占６７％左右。
（５）ＴＥ缓冲液：在基因操作实验中， 选择缓冲液的主要原则是考虑ＤＮＡ的
稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。 采用Tris-HCL的缓冲系统，由于缓冲液 是Tris H+/Tris,不存在金属离子的干扰作 用，故在提取或保存ＤＮＡ时，大都采 用Tris-HCL系统，而ＴＥ缓冲液中的Ｅ ＤＴＡ更能稳定ＤＮＡ的活性。
质粒DNA提取溶液Ⅱ：0.2M NaOH，1% SDS， 现配现用。
质粒DNA提取溶液Ⅲ：5M 乙酸钾溶液60ml， 冰乙酸11.5ml，灭菌水28.5ml。
5）12000rpm离心8min，小心取上清于离心管 中。加等体积酚：氯仿抽提一次。
6）取上清液加入1/5体积5M的乙酸胺，再加入 2倍体积无水乙醇，12000rpm离
（６）酚－氯仿：酚与氯仿是非极性分 子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚 或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分 子就被酚或氯仿挤去，使蛋白质失去水 合状态而变性。经过离心，变性蛋白质 的密度比水的密度大，因而与水相分离， 沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中 的ＤＮＡ分开。而酚与氯仿有机溶剂比 重更大，保留在最下层。
（７）异戊醇：在抽提ＤＮＡ时，为了混合均 匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内 易产生气泡，气泡会阻止分子相互间的充分作 用。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能 减少抽提过程中泡沫的产生。一般采用氯仿与 异戊醇之比为２４：１。也可采用酚、氯仿与 异戊醇之比为２５：２４：１。同时异戊醇有 助于分相，使离心后的上层水相、中层变性蛋 白相以及下层有机溶剂相维持稳定。
（2）所用器皿必须严格清洗，各种试剂配制 是否准确，有的需高压高温灭菌。
（3）加乙醇沉淀DNA时，要把离心管加盖摇 动4-5次，注意观察水相与乙醇之间 没有分层 现象之后，才可以放入冰箱中沉淀DNA。
3.2 DNA提取的其他方法
2.2.1 质粒DNA的分离纯化
2.2.1.1微量提取质粒ＤＮＡ
2）用STE重悬细菌沉淀，12000rpm离心5min， 弃上清。
3）将细菌沉淀重悬于100μl冰预冷的溶液I中， 加入200μl新配制的溶液II，温和转动使之混匀， 冰浴2min。
4）加入150μl溶液III，将管倒置摇荡1min，冰 浴5min。
质粒DNA提取溶液Ⅰ： 50mM葡萄糖，25mM Tris.Cl（pH8.0），10mM EDTA（pH8.0），高 压灭菌，4℃保存。