基因工程的基本操作程序
基因工程操作的基本步骤
基因工程操作的基本步骤
基因工程是指人为地将外源基因导入到宿主生物体中，并使其在宿主中表达出来的技术。
基因工程的操作一般包括以下基本步骤：
1.确定目标基因：确定想要转入宿主生物体的目标基因，这可能是来自其他生物体的其中一种特定基因。
2.获得目标基因：获得目标基因的DNA序列，通常通过基因重组、合成或从源生物中提取。
3.构建载体：将目标基因插入到一个载体DNA中，以便将其导入宿主生物体。
载体可以是人工合成的质粒或病毒，能够稳定地带有外源DNA。
4.转化宿主生物体：将构建好的载体导入到宿主生物体中，使其接受外源基因。
转化方法可以包括化学方法、电击法、基因枪等。
5.筛选转化体：通过筛选方法，如对转化体进行培养基的筛选、对荧光标记的筛选等，来选出成功转化了外源基因的宿主生物体。
6.验证基因表达：通过PCR、蛋白质表达分析等实验方法验证外源基因是否成功表达。
7.优化表达：根据目的需要，可以通过引入启动子、启动子增强子、终止子等调控元件，优化外源基因的表达。
8.传代培养：将成功表达外源基因的宿主生物体进行传代培养，以使其后代继续表达目标基因。
9.应用研究：将表达目标基因的宿主生物体应用于研究中，如表达重要药物、生产工业化酶、改良农作物等。
基因工程程序
编码区下游 非编码区
终止子
能够转录为相应的信 使RNA，进而指导蛋 白质的合成，也就是 说能够编码蛋白质
不能转录为 信使RNA， 不能编码蛋 白质
真核细胞的基因结构 外显子
编码区上游
非编码区
编码区
内含子
编码区上游
非编码区
启动子
与RNA聚酶 结合位点
不能转录 为信使RNA， 不能编码 蛋白质
终止子
能够编码 蛋白质的 序列叫做 外显子
Ti质粒
✓Ti质粒是农杆菌的染色体外遗传物质 ✓双链闭合环状DNA ✓植物基因工程常用的载体
将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上构成重组Ti质粒 转入农杆菌细胞
含重组Ti质粒的农杆菌感染植物细胞 使目的基因整合到植物染色体上，实现遗传转化
组培再生获得植株
2、将目的基因导入动物细胞 ——显微注射技术
1.2基因工程的基本操作程序
1.2 基因工程的基本操作程序
一、目的基因的获取 二、基因表达载体构建 三、将目的基因导入受体细胞 四、目的基因的检测和鉴定
一、目的基因的获取
目的基因是人们所需要转移或改造的基因。
如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有 植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种 子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛cDNA 复制
双链cDNA
载体DNA
重组DNA分子
导入 受体菌增殖 cDNA基因组与cDNA的比较：只包括某一特定细胞类型、某一
组织、或某一发育时期的表达序列。 3、分离特定基因，cDNA库比较。 原 料：4种游离三磷酸脱氧核苷酸dNTP
dCTP、dGTP、dATP 、dTTP 。 能 量：dNTP 缓冲液：
DNA变性的本质是双链间氢键的断 裂
基因工程的基本操作程序 课件
限制性酶切割 DNA分子
限制片段 琼脂糖电泳
DNA
带有DNA片段的凝胶
分
用缓冲液转 转移至硝酸纤维素膜上
子
移DNA
杂
凝胶
交
滤膜
与放射性标记 DNA探针杂交
吸附有DNA片 段的膜
放射自显影
抗原-抗体杂交
重组体
转化到 E.Coli
细菌启动子 插入的真核 DNA片段
解析：DNA 分子杂交就是不同来源的 DNA 分子的单 链按碱基互补配对原则结合在一起，形成杂合双链的过 程。B 项利用了分子杂交技术(DNA 与 mRNA 之间杂交)。 检测目的基因是否翻译合成蛋白质依据的是抗原—抗体 杂交原理，未用到 DNA 分子杂交原理。
答案：C
生物 种类
植物细胞
动物细胞
微生物细胞
转化 过程
将目的基因插入Ti质 粒的T-DNA上→Ca2+ 处理导入农杆菌细胞 →侵染植物细胞→目 的基因整合到受体细 胞的染色体上DNA上 →植物组织培养→试 管苗表达目的基因→
产生相应性状。
将含有目的基因
的表达载体提纯 →取受精卵→显 微注射→获得导 入目的基因的受 体细胞→早期胚 胎培养→胚胎移 植→获得新性状
第三步：将目的基因导入受体细胞（转化 transformation） 3、将目的基因导入微生物细胞 （1）微生物作为受体的优势
①繁殖速度快，可大量生产 ②生产成本低
（2）导入方法 Ca2+处理
第三步：将目的基因导入受体细胞（转化 transformation） 3、将目的基因导入微生物细胞 （3）原核生物作为受体细胞产生的蛋白质没有空间结构， 需要在体外加工。
2025高考生物总复习基因工程的基本工具和基本操作程序
第54讲基因工程的基本工具和基本操作程序课标内容(1)阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。
(2)阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤。
(3)DNA的粗提取与鉴定实验。
(4)利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验。
考点一重组DNA技术的基本工具1.基因工程概述基因工程的理论基础2.重组DNA技术的基本工具(1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)①将一个基因从DNA分子上切割下来需要切两处，同时产生四个黏性末端或平末端。
②限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
(2)DNA连接酶①DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上。
②DNA聚合酶起作用时需要以一条DNA链为模板，而DNA连接酶不需要模板。
(3)载体构建基因表达载体时，需要选择合适的限制酶切割含有目的基因的DNA片段和载体。
已知限制性内切核酸酶Ⅰ的识别序列和切点是，限制性内切核酸酶Ⅱ的识别序列和切点是，根据图示分析回答下列问题：(1)请用图示法写出限制性内切核酸酶Ⅰ和限制性内切核酸酶Ⅱ切割后形成黏性末端的过程。
提示限制性内切核酸酶Ⅰ：限制性内切核酸酶Ⅱ：(2)切割图示中的目的基因和质粒应选用哪类限制酶？请说明理由。
提示用限制酶Ⅱ切割目的基因，用限制酶Ⅰ切割质粒。
限制酶Ⅰ的识别序列包含限制酶Ⅱ的识别序列，因此限制酶Ⅱ也可切割限制酶Ⅰ的位点，故使用限制酶Ⅱ时，可在目的基因两端同时作切割，从而切出“目的基因”，但若使用限制酶Ⅱ切割质粒，会同时破坏质粒中的两个“标记基因”，故只能使用限制酶Ⅰ切割质粒。
1.限制酶的选择原则(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。
基因工程的基本操作程序
基因工程的基本操作程序包括以下几个步骤：
1. DNA提取：从细胞中提取DNA，通常使用化学方法或机械方法。
2. PCR扩增：利用聚合酶链式反应（PCR）技术扩增目标DNA片段。
3. 限制性内切酶切割：使用限制性内切酶切割目标DNA片段，以便进行后续的克隆和重组。
4. 凝胶电泳：将DNA样品分离出来，并确定其大小和纯度。
5. 克隆：将目标DNA片段插入到载体DNA中，形成重组DNA，然后将其转化到宿主细胞中。
6. 筛选：筛选出含白质，实现目标基因的表达。
8. 分析和应用：对表达的蛋白质进行分析和应用，如药物开发、基因治疗等。
基因工程的基本操作程序是基因工程技术的核心，它使得我们能够对基因进行精确的操作和控制，从而实现对生命过程的深入研究和应用。
《基因工程的基本操作程序》 学历案
《基因工程的基本操作程序》学历案一、学习目标1、简述基因工程的基本操作程序。
2、理解基因工程四个步骤的原理及操作技术。
3、分析基因工程操作程序中的相关实例，培养科学思维和实践能力。
二、学习重难点1、重点（1）基因工程基本操作程序的四个步骤。
（2）获取目的基因的方法。
（3）基因表达载体的构建。
2、难点（1）从基因文库中获取目的基因。
（2）利用 PCR 技术扩增目的基因。
三、知识梳理（一）目的基因的获取1、目的基因的概念目的基因主要是指编码蛋白质的结构基因，也可以是一些具有调控作用的因子。
2、获取目的基因的方法（1）从基因文库中获取基因文库包括基因组文库和部分基因文库（如 cDNA 文库）。
基因组文库包含了一种生物的全部基因，而 cDNA 文库只包含了一种生物的部分基因，是由 mRNA 反转录得到的 DNA 片段构建而成。
（2）利用 PCR 技术扩增目的基因PCR 是一项在生物体外复制特定 DNA 片段的核酸合成技术。
它的原理是 DNA 双链复制，需要模板 DNA、引物、四种脱氧核苷酸、热稳定 DNA 聚合酶（Taq 酶）等条件。
PCR 过程包括变性、退火、延伸三个步骤，经过多次循环，可以大量扩增目的基因。
（3）人工合成如果基因比较小，核苷酸序列又已知，可以通过 DNA 合成仪用化学方法直接人工合成。
（二）基因表达载体的构建1、基因表达载体的组成基因表达载体通常由目的基因、启动子、终止子、标记基因等部分组成。
启动子是 RNA 聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA；终止子是转录终止的信号；标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。
2、构建基因表达载体的目的（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。
（2）使目的基因能够表达和发挥作用。
（三）将目的基因导入受体细胞1、转化的概念目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。
管理制度基因工程的基本操作程序(修改)
管理制度基因工程的基本操作程序(修改)
管理制度基因工程是一项重要的工作，需要严格执行操作程序。
基本操作程序如下：
一、确定目标：首先确定所需进行基因工程的目标和目的，明确要改良的特性或功能。
二、设计方案：根据目标确定基因工程的设计方案，包括选择适当的基因编辑技术和工具。
三、实施操作：按照设计方案实施基因工程，包括提取DNA、编辑基因、转入目标细胞等操作步骤。
四、筛选验证：进行细胞培养和筛选验证，确保基因编辑成功并达到预期效果。
五、安全监管：在进行基因工程过程中，需要严格遵守相关的安全规定，确保操作安全。
六、数据记录：对基因工程的每一个操作步骤进行详细的记录，包括实验条件、操作细节和结果数据等。
七、结果分析：对实验结果进行分析和总结，评估基因工程的效果和成果是否符合预期。
八、报告汇总：将基因工程的操作过程和结果进行报告汇总，供管理部门审查和评估。
以上就是管理制度基因工程的基本操作程序，其严格执行可以确保工程的安全和有效实施。
基因工程基本操作步骤
基因工程基本操作步骤
1、目标基因的选择。
这是进行基因工程的第一步，目标基因可以是已知的具有特定功能的基因，也可以是未知的探索性研究对象，在选择时需要考虑多个方面，如所需功能、适用范围、安全性等。
2、克隆目标基因。
这一步骤包括提取DNA、使用限制性内切酶将DNA切割成特定长度、连接载体（如质粒、病毒等）以及转化宿主细胞（如大肠杆菌、哺乳动物细胞等）。
3、构建重组表达载体。
这一步骤包括选择合适的载体、插入目标基因、调节表达（如调节启动子和终止子）等，重组表达载体是将目标基因嵌入到载体中，使其能够在宿主细胞中表达。
4、转染宿主细胞。
这一步骤包括选择合适的宿主细胞、转染重组表达载体、筛选阳性克隆等，转染宿主细胞是将构建好的重组表达载体转移到宿主细胞中，使其能够在宿主细胞中进行表达。
5、目的基因的检测与鉴定。
这一步骤包括分子水平上的检测（如DNA分子杂交技术、分子杂交技术、抗原-抗体杂交技术）和个体水平上的鉴定（如抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等）。
6、分离和纯化目标蛋白。
这一步骤包括破碎宿主细胞、
使用不同的技术对混合物进行分离（如层析、电泳等）。
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③检测目的基因是否翻译成蛋白质 方法—— 抗原抗体杂交
鉴定—— 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
1、原核细胞的基因结构
非编码区 编码区上游
启动子
编码区
非编码区
编码区下游 终止子
与RNA聚合酶结合位点
启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断， 它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能 驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质
终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断， 能终止mRNA的转录
__D_N_A_聚__合__酶__.前提条件：
④方式：以_指__数__方式扩增，即__2_n_（n为扩增循 环的次数）
⑤结果： 使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增
⑥过程：
a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板 在热作用下，_氢__键__断裂，形成__单__链__D_N_A___
b、退火（复性55℃-65℃）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部___双__链___。
练习
1）以下说法正确的是
（C ）
A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷 酸序列
B、质粒是基因工程中唯一的运载体
C、运载体必须具备的条件之一是：具有多 个限制酶切点，以便与外源基因连接
D、基因控制的性状都能在后代表现出来
练习
2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是
A、能复制
（ D）
B、有多个限制酶切点
c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下， 合成与模板互补的_D_N_A_链____。
3、人工合成法：
基因较小，核苷酸序列已知，可以 利用DNA合成仪人工合成
二、基因表达载体的构建
——基因工程的核心
1、目的：
使目的基因在受体细胞中稳定存在， 并且可以遗传给下一代，同时使目的 基因能够表达和发挥作用。
所需物质：
它们各自 的作用是 什么?
2、基因表达载体的组成：
复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因
它们各自 的作用是 什么?
启动子：位于基因的首端的 一段特殊的DNA片断，它 是RNA聚合酶识别和结合的 部位，有了它才能驱动基因 转录出mRNA，最终获得蛋 白质
终止子：位于基因的尾端的 一段特殊的DNA片断，能 终止mRNA的转录
了耐盐水稻新品系。
（1）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所
用的限制性内切酶作用于图中的 处，
DNA连接酶作用于
处。（填“a”或
“b”）
练习1：(2008理综山东卷)为扩大可耕地面积，增
加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备
受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐
水稻新品系。
（2）将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方
练习
5）基因工程是在DNA分子水平上进行设计
施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行
碱基互补配对的步骤是
（C ）
A、人工合成目的基因
B、目的基因与运载体结合
C、将目的基因导入受体细胞
D、目的基因的检测和表达
(四)目的基因的检测与鉴定
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
——检查是否成功
检测—
①检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因 方法—— DNA分子杂交
标记基因的作用是为了鉴别 受体细胞中是否含有目的基 因，从而将有目的基因的细
三将目的基因导入受体细胞
（一）转化：目受的体基细因 胞进 内入 维持_受_稳__体__定__细____胞和___内表_，_达_并_的且过在程
（二）方法
将目的基因导入 植物细胞
农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法
将目的基因导入 动物细胞
法有农杆菌转化法和 法。
（3）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要
利用
技术，该技术的核心是
和
。
（4）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既
要用放射性同位素标记的 作探针进行分子杂交
检测，又要用 方法从个体水平鉴定水稻植株
的耐盐性。
答案：（1）a a （2）基因枪 法（花粉管通道法） （3）植物组织培养（1分） 脱分化 （去分化） 再分化 （4）耐盐基因（目的基因） 一定 浓度盐水浇灌（移栽到盐碱地中）③基因组和部分基因组(cDNA)比较
怎样从基因中得 到我们所需的目的基 因呢?基因的有关信息。 如：根据基因的核苷酸序列
基因的功能 基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质等特性
2、利用PCR技术扩增目的基因
（二）、获合成1、从基因中获取目的基因（1）.基因
将含有某种生物不同基因的许多 DNA片断，导入到受体菌的群体中， 各个受体菌分别含有这种生物的不同 基因，称为基因基因基因组
部分基因 （如:cDNA）归纳步骤DNA分子杂交示意图
采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分 子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补 的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合 在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序 列的部位，仍然是两条游离的单链。
P15思考与探究
2、检测目的基因是否转录出了mRNA
①方法: 分 子 杂 交
——显微注射法
将目的基因导入 微生物细胞
——感受态细胞
1、将目的基因导入植物细胞的方法： （1）农杆菌转化法 ①农杆菌特点：
易感染双子叶植物和裸子植物，对大多 数单子叶植物没有感染能力
②原理：Ti质粒上的T---DNA可以转 移到受体细胞，并整合到受体细胞染 色体的DNA上。
③过程：
④优点
（2）基因枪法 （3）花粉管通道法（2）.基因的构建方法①基因组的构建
通过对受 体菌的基因转 录成的信使RNA为 模板，反转录成互 补的单链DNA，然 后在酶的作用下合 成双链DNA，从而 获得所需的基因。
目的基因的mRNA
反转录酶
单链DNA
DNA聚合 双链DNA酶 (目的基因)
②过程: 用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若 出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA
3、检测目的基因是否翻译成蛋白质
方法: 抗原抗体杂交
（二）、鉴定（个体生物学水平） 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
归纳步骤
归纳: 基因工程的基本操作程序录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚 合酶也从DNA模板链上脱落下来。
非编码区 编码区上游
启动子
编码区
非编码区
编码区下游 终止子
原核 细胞 的 基因 结构
编码区 ：能转录相应的信使RNA，能 编码蛋白质
①不能转录为信使RNA，不能 非编码区 编码蛋白质。
②有调控遗传信息表达的核 苷酸序列.包括启动子和终止子
1.2 基因工程的基本操作程序
基因工程基本操作的四个步骤 1、目的基因的获取
2、基因表达载体的构建 3、将目的基因导入受体细胞
4、目的基因的检测与鉴定
一、目的基因的获取
请阅读P9第一和二两段
(一)、目的基因主要是_编__码__蛋__白__质__的__结__构__基__因___ 请举出三个以上的例子
2. 构建基因表达载体
目的基因、启动子、终止子、标记基因
3. 将目的基因导入受体细胞
农杆菌转化法、显微注射法
4. 目的基因的检测与鉴定
检测：是否插入、转录、翻译 鉴定：
练习1：(2008理综山东卷)为扩大可耕地面积，
增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利
用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出
2、真核细胞的基因结构
非编码区
编码区上游
启动子 与RNA聚合酶 结合位点
编码区
外显子 内含子
非编码区
编码区下游
终止子
外显子： 能够编码蛋白质的序列叫做外显子
内含子： 不能够编码蛋白质的序列叫做内 含子
真核 细胞 的 基因 结构
外显子：能编码蛋白质的序列 编码区
内含子：不能编码蛋白质的序列
非编码区：有调控作用的核苷酸序列， 包括位于编码区上游的RNA 聚合酶结合位点（启动子）。
C、具有标记基因
D、它是环状DNA
练习
3）有关基因工程的叙述中，错误的是（ A ）
A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、 限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、 人工合成目的基因不用限制性内切酶
练习
4）有关基因工程的叙述正确的是 （ D ）
A、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体 D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供 资料
① 概念：PCR全称为_聚__合__酶__链__式__反__应__，是一项 在生物_体__外_复制_特__定__D_N_A_片__段_的核酸合成技术
②原理：_D_N_A_复__制____
③条件：_已__知__基__因__的__核__苷__酸__序__列____、 _四__种__脱__氧__核__苷__酸__、__一__对__引__物___ 、
2、将目的基因导入动物细胞
①方法：显微注射法
②程序：
目的基因表达载体提纯
显微注射
受精卵
取卵（受精卵） 新性状动物
3、将目的基因导入微生物细胞
①原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少 ②方法：
用Ca2+处理细胞 感受态细胞
表
达载体与感受态细胞混合
感受态
细胞吸收DNA分子
四、目的基因的检测与鉴定
非编码序列：包括非编码区和内含子
3、原核细胞与真核细胞的基因结构比较
不同点 相同点
原核细胞
真核细胞
编码区是