基因工程的基本操作程序
基因工程操作的基本步骤
基因工程操作的基本步骤
基因工程是指人为地将外源基因导入到宿主生物体中，并使其在宿主中表达出来的技术。
基因工程的操作一般包括以下基本步骤：
1.确定目标基因：确定想要转入宿主生物体的目标基因，这可能是来自其他生物体的其中一种特定基因。
2.获得目标基因：获得目标基因的DNA序列，通常通过基因重组、合成或从源生物中提取。
3.构建载体：将目标基因插入到一个载体DNA中，以便将其导入宿主生物体。
载体可以是人工合成的质粒或病毒，能够稳定地带有外源DNA。
4.转化宿主生物体：将构建好的载体导入到宿主生物体中，使其接受外源基因。
转化方法可以包括化学方法、电击法、基因枪等。
5.筛选转化体：通过筛选方法，如对转化体进行培养基的筛选、对荧光标记的筛选等，来选出成功转化了外源基因的宿主生物体。
6.验证基因表达：通过PCR、蛋白质表达分析等实验方法验证外源基因是否成功表达。
7.优化表达：根据目的需要，可以通过引入启动子、启动子增强子、终止子等调控元件，优化外源基因的表达。
8.传代培养：将成功表达外源基因的宿主生物体进行传代培养，以使其后代继续表达目标基因。
9.应用研究：将表达目标基因的宿主生物体应用于研究中，如表达重要药物、生产工业化酶、改良农作物等。
基因工程程序
编码区下游 非编码区
终止子
能够转录为相应的信 使RNA，进而指导蛋 白质的合成，也就是 说能够编码蛋白质
不能转录为 信使RNA， 不能编码蛋 白质
真核细胞的基因结构 外显子
编码区上游
非编码区
编码区
内含子
编码区上游
非编码区
启动子
与RNA聚酶 结合位点
不能转录 为信使RNA， 不能编码 蛋白质
终止子
能够编码 蛋白质的 序列叫做 外显子
Ti质粒
✓Ti质粒是农杆菌的染色体外遗传物质 ✓双链闭合环状DNA ✓植物基因工程常用的载体
将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上构成重组Ti质粒 转入农杆菌细胞
含重组Ti质粒的农杆菌感染植物细胞 使目的基因整合到植物染色体上，实现遗传转化
组培再生获得植株
2、将目的基因导入动物细胞 ——显微注射技术
1.2基因工程的基本操作程序
1.2 基因工程的基本操作程序
一、目的基因的获取 二、基因表达载体构建 三、将目的基因导入受体细胞 四、目的基因的检测和鉴定
一、目的基因的获取
目的基因是人们所需要转移或改造的基因。
如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有 植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种 子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛cDNA 复制
双链cDNA
载体DNA
重组DNA分子
导入 受体菌增殖 cDNA基因组与cDNA的比较：只包括某一特定细胞类型、某一
组织、或某一发育时期的表达序列。 3、分离特定基因，cDNA库比较。 原 料：4种游离三磷酸脱氧核苷酸dNTP
dCTP、dGTP、dATP 、dTTP 。 能 量：dNTP 缓冲液：
DNA变性的本质是双链间氢键的断 裂
基因工程的基本操作程序 课件
限制性酶切割 DNA分子
限制片段 琼脂糖电泳
DNA
带有DNA片段的凝胶
分
用缓冲液转 转移至硝酸纤维素膜上
子
移DNA
杂
凝胶
交
滤膜
与放射性标记 DNA探针杂交
吸附有DNA片 段的膜
放射自显影
抗原-抗体杂交
重组体
转化到 E.Coli
细菌启动子 插入的真核 DNA片段
解析：DNA 分子杂交就是不同来源的 DNA 分子的单 链按碱基互补配对原则结合在一起，形成杂合双链的过 程。B 项利用了分子杂交技术(DNA 与 mRNA 之间杂交)。 检测目的基因是否翻译合成蛋白质依据的是抗原—抗体 杂交原理，未用到 DNA 分子杂交原理。
答案：C
生物 种类
植物细胞
动物细胞
微生物细胞
转化 过程
将目的基因插入Ti质 粒的T-DNA上→Ca2+ 处理导入农杆菌细胞 →侵染植物细胞→目 的基因整合到受体细 胞的染色体上DNA上 →植物组织培养→试 管苗表达目的基因→
产生相应性状。
将含有目的基因
的表达载体提纯 →取受精卵→显 微注射→获得导 入目的基因的受 体细胞→早期胚 胎培养→胚胎移 植→获得新性状
第三步：将目的基因导入受体细胞（转化 transformation） 3、将目的基因导入微生物细胞 （1）微生物作为受体的优势
①繁殖速度快，可大量生产 ②生产成本低
（2）导入方法 Ca2+处理
第三步：将目的基因导入受体细胞（转化 transformation） 3、将目的基因导入微生物细胞 （3）原核生物作为受体细胞产生的蛋白质没有空间结构， 需要在体外加工。
2025高考生物总复习基因工程的基本工具和基本操作程序
第54讲基因工程的基本工具和基本操作程序课标内容(1)阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。
(2)阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤。
(3)DNA的粗提取与鉴定实验。
(4)利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验。
考点一重组DNA技术的基本工具1.基因工程概述基因工程的理论基础2.重组DNA技术的基本工具(1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)①将一个基因从DNA分子上切割下来需要切两处，同时产生四个黏性末端或平末端。
②限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
(2)DNA连接酶①DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上。
②DNA聚合酶起作用时需要以一条DNA链为模板，而DNA连接酶不需要模板。
(3)载体构建基因表达载体时，需要选择合适的限制酶切割含有目的基因的DNA片段和载体。
已知限制性内切核酸酶Ⅰ的识别序列和切点是，限制性内切核酸酶Ⅱ的识别序列和切点是，根据图示分析回答下列问题：(1)请用图示法写出限制性内切核酸酶Ⅰ和限制性内切核酸酶Ⅱ切割后形成黏性末端的过程。
提示限制性内切核酸酶Ⅰ：限制性内切核酸酶Ⅱ：(2)切割图示中的目的基因和质粒应选用哪类限制酶？请说明理由。
提示用限制酶Ⅱ切割目的基因，用限制酶Ⅰ切割质粒。
限制酶Ⅰ的识别序列包含限制酶Ⅱ的识别序列，因此限制酶Ⅱ也可切割限制酶Ⅰ的位点，故使用限制酶Ⅱ时，可在目的基因两端同时作切割，从而切出“目的基因”，但若使用限制酶Ⅱ切割质粒，会同时破坏质粒中的两个“标记基因”，故只能使用限制酶Ⅰ切割质粒。
1.限制酶的选择原则(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。
基因工程的基本操作程序
基因工程的基本操作程序包括以下几个步骤：
1. DNA提取：从细胞中提取DNA，通常使用化学方法或机械方法。
2. PCR扩增：利用聚合酶链式反应（PCR）技术扩增目标DNA片段。
3. 限制性内切酶切割：使用限制性内切酶切割目标DNA片段，以便进行后续的克隆和重组。
4. 凝胶电泳：将DNA样品分离出来，并确定其大小和纯度。
5. 克隆：将目标DNA片段插入到载体DNA中，形成重组DNA，然后将其转化到宿主细胞中。
6. 筛选：筛选出含白质，实现目标基因的表达。
8. 分析和应用：对表达的蛋白质进行分析和应用，如药物开发、基因治疗等。
基因工程的基本操作程序是基因工程技术的核心，它使得我们能够对基因进行精确的操作和控制，从而实现对生命过程的深入研究和应用。
《基因工程的基本操作程序》 学历案
《基因工程的基本操作程序》学历案一、学习目标1、简述基因工程的基本操作程序。
2、理解基因工程四个步骤的原理及操作技术。
3、分析基因工程操作程序中的相关实例，培养科学思维和实践能力。
二、学习重难点1、重点（1）基因工程基本操作程序的四个步骤。
（2）获取目的基因的方法。
（3）基因表达载体的构建。
2、难点（1）从基因文库中获取目的基因。
（2）利用 PCR 技术扩增目的基因。
三、知识梳理（一）目的基因的获取1、目的基因的概念目的基因主要是指编码蛋白质的结构基因，也可以是一些具有调控作用的因子。
2、获取目的基因的方法（1）从基因文库中获取基因文库包括基因组文库和部分基因文库（如 cDNA 文库）。
基因组文库包含了一种生物的全部基因，而 cDNA 文库只包含了一种生物的部分基因，是由 mRNA 反转录得到的 DNA 片段构建而成。
（2）利用 PCR 技术扩增目的基因PCR 是一项在生物体外复制特定 DNA 片段的核酸合成技术。
它的原理是 DNA 双链复制，需要模板 DNA、引物、四种脱氧核苷酸、热稳定 DNA 聚合酶（Taq 酶）等条件。
PCR 过程包括变性、退火、延伸三个步骤，经过多次循环，可以大量扩增目的基因。
（3）人工合成如果基因比较小，核苷酸序列又已知，可以通过 DNA 合成仪用化学方法直接人工合成。
（二）基因表达载体的构建1、基因表达载体的组成基因表达载体通常由目的基因、启动子、终止子、标记基因等部分组成。
启动子是 RNA 聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA；终止子是转录终止的信号；标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。
2、构建基因表达载体的目的（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。
（2）使目的基因能够表达和发挥作用。
（三）将目的基因导入受体细胞1、转化的概念目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。
管理制度基因工程的基本操作程序(修改)
管理制度基因工程的基本操作程序(修改)
管理制度基因工程是一项重要的工作，需要严格执行操作程序。
基本操作程序如下：
一、确定目标：首先确定所需进行基因工程的目标和目的，明确要改良的特性或功能。
二、设计方案：根据目标确定基因工程的设计方案，包括选择适当的基因编辑技术和工具。
三、实施操作：按照设计方案实施基因工程，包括提取DNA、编辑基因、转入目标细胞等操作步骤。
四、筛选验证：进行细胞培养和筛选验证，确保基因编辑成功并达到预期效果。
五、安全监管：在进行基因工程过程中，需要严格遵守相关的安全规定，确保操作安全。
六、数据记录：对基因工程的每一个操作步骤进行详细的记录，包括实验条件、操作细节和结果数据等。
七、结果分析：对实验结果进行分析和总结，评估基因工程的效果和成果是否符合预期。
八、报告汇总：将基因工程的操作过程和结果进行报告汇总，供管理部门审查和评估。
以上就是管理制度基因工程的基本操作程序，其严格执行可以确保工程的安全和有效实施。
《基因工程的基本操作程序》 学历案
《基因工程的基本操作程序》学历案一、学习目标1、简述基因工程的基本操作程序。
2、理解基因工程操作中获取目的基因、构建基因表达载体、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定等步骤的原理和方法。
二、学习重难点1、重点（1）基因工程基本操作程序的四个主要步骤。
（2）获取目的基因的方法。
（3）构建基因表达载体的方法和作用。
2、难点（1）从基因文库中获取目的基因。
（2）利用 PCR 技术扩增目的基因。
三、知识梳理（一）获取目的基因1、目的基因的概念目的基因主要是指编码蛋白质的结构基因，也可以是一些具有调控作用的因子。
2、获取目的基因的方法（1）从基因文库中获取基因文库包括基因组文库和部分基因文库（如 cDNA 文库）。
基因组文库包含了一种生物的全部基因，而 cDNA 文库只包含了一种生物的部分基因，是由 mRNA 反转录得到的 DNA 片段构建而成。
（2）利用 PCR 技术扩增目的基因PCR 全称为聚合酶链式反应，是一项在体外快速大量复制特定DNA 片段的技术。
其原理是 DNA 双链复制，需要引物、耐高温的DNA 聚合酶、四种脱氧核苷酸等条件。
通过控制温度的变化来完成变性、退火、延伸等步骤，经过多次循环，使目的基因得以大量扩增。
（3）人工合成法如果基因较小，核苷酸序列已知，可以通过 DNA 合成仪用化学方法直接人工合成。
（二）构建基因表达载体1、目的使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。
2、组成基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子、标记基因等。
启动子是RNA 聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。
终止子是转录终止的信号。
标记基因的作用是用于鉴别和筛选含有目的基因的细胞。
（三）将目的基因导入受体细胞1、常用的受体细胞植物细胞可以用体细胞或受精卵，动物细胞常用受精卵，微生物细胞常用大肠杆菌、枯草杆菌等。
2、导入方法（1）植物细胞常用农杆菌转化法，将目的基因插入到农杆菌的 Ti 质粒上，通过农杆菌感染植物细胞，将目的基因整合到植物细胞的染色体 DNA 上。
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（1）获取目的基因的根据：
如：根据基因的核苷酸序列； 基因的功能； 基因在染色体上的位置； 基因的转录产物mRNA； 基因翻译产物蛋白质等特性。
1.2 基因工程的基本操作程序
2022/3/23
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基因工程基本操作的四个步骤 1、目的基因的获取 （前提）
2、基因表达载体的构建 （核心） 3、将目的基因导入受体细胞 （关键）
4、目的基因的检测与鉴定 （保证）
一、目的基因的获取
请阅读P9第一和二两段
(一)、目的基因主要是_编__码__蛋__白__质__的__基__因_______ 也可请以是举一出些三具个有以调上控的作用例的子因子
（三）、人工合成目的基因（在DNA合成仪中合成） 基因比较小，核苷酸序列已知
1）反转录法：
目的基因的mRNA
以目的基因转录成的信 使RNA为模板，反转录成 互补的单链DNA，然后在 酶的作用下合成双链DNA， 从而获得所需的基因。
2）人工化学合成法 ：
反转录 单链DNA (cDNA）
合成
双链DNA (即目的基因)
②原理：_D_N_A_复__制____
③条件：_有__一__段_已__知__基__因_的__核__苷__酸_序__列_、 _四_种__脱__氧__核_苷__酸____、__一__对__引__物___ 、
__耐_热__的__D_N_A聚__合. 酶（Taq酶）
④方式：以__指_数__方式扩增，即__2_n _（n为扩增循 环的次数）
别说明理由。
“ 汉 水 丑 生 的生物 同行” 超级群 大型 公 益 活 动 ： 历年高 考题PPT版 制 作。 本 课 件 为 公 益作品 ，版权 所有， 不得 以 任 何 形 式 用于商 业目的 。2012年 1月 15日 ， 汉 水 丑 生标 记。
第一组：①__引__物__I和__引__物__I_I局__部__发__生__碱__基__互__补__配__对__而__失__效__ ②_引__物__I_′__自__身__折__叠__后__会__出__现__局__部__碱__基__互__补__配_ 对而失效
“ 汉 水 丑 生 的生物 同行” 超级群 大型 公 益 活 动 ： 历年高 考题PPT版 制 作。 本 课 件 为 公 益作品 ，版权 所有， 不得 以 任 何 形 式 用于商 业目的 。2012年 1月 15日 ， 汉 水 丑 生标 记。
①从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段 所占比例为 15/16 。 ②在第 三 轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等 长的DNA片段。
有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是 在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和 高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在 这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋 白是不可能的。
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4.β-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它 的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细 胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌 生产出鼠的β-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？
（二）、利用PCR技术扩增目的基因
（二）、利用PCR技术扩增目的基因
原理：利用DNA双链复制原理 前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列。
以便合成引物。
n 过程： 变性、退火、延伸三步曲
➢ 变性：加热至90～
95℃双链DNA解链成
为单链DNA
注➢意退：火双：链冷DN却A至中5，5～G和C比例越高，DNA变性温度越高。
4、目的基因的插入位点不是随机的。
目的基因的插入不能破坏载体上自身需要的基因片段， 以及其上的标记基因，且插入在启动子和终止子之间。
5、受体细胞不同，基因表达载体的构建也会有 差异。
三、将目的基因导入受体细胞
（一）转化
目的基因进入_受__体__细__胞__内，并且在 受体细胞内维持稳__定___和_表__达__的过程
（1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身 基因的启动子才能比较有利于导入受体生物中无法转录；
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（3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；
（4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加 一些其他调控元件，如增强子等；
（二）、获取目的合成
一、目的基因的获取（一）从基因中获取目的基因（先建立基因，再从中筛选；）1.基因：概念见P9 2.基因的分类:
种 基因组DNA：含有一种生物的全部基因 类 部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，
①要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌 菌株都可以侵染单子叶植物；
②要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目 的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性） 和激活农杆菌的Vir区（诱导）的基因，使T-DNA转移 并插入到染色体DNA上。
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思考与探究：
3.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关 细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路， 思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？
根据已知的氨基酸序列合成DNA
蛋白质 的氨基
推测
mRNA 的核苷
推测
结构基因 的核苷酸
酸序列
酸序列
序列
化学 合成
目的 基因
二、基因表达载体的构建——基因工程的核心
使目的基因在受体细胞中稳定存在， 目的： 并且可以遗传给下一代，同时使目的
基因能够表达和发挥作用。
2、表达载体的组成
1. 启动子 2. 终止子 3. 目的基因 4. 标记基因等
碱基互补配对 模板、原料、能量、酶、引物等
解旋方 式
氢键在高温下断 裂，双链全部解
开
解旋酶催化氢键逐步断裂
场所
体外
主要在细胞核中
不同 点
引物 酶
DNA
热稳定DNA聚合酶
（Taq酶）
RNA 解旋酶、DNA聚合酶等
结果
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在短时间内形成 大量的DNA片段
形成完整的DNA分子
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33.(8分)请回答基因工程方面的有关问题：
3.过程: 质粒
DNA分子
同一种限制酶处理
一个切口 两个黏性末端
两个切口 获得目的基因
DNA连接酶 重组DNA分子（重组质粒）
1、构建重组质粒时，需用
切割
含目的基因的DNA和载体。目的是酶。
2、为防止载体与目的基因自身环化，应该怎么做？ 3、目的基因与载体成功连接的基础是什么？
（二）方法
将目的基因导入 植物细胞
农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法
将目的基因导入 动物细胞
——显微注射法
将目的基因导入 微生物细胞
——Ca2+处理法
四、目的基因的检测与鉴定
——检查是否成功
（一）、检测 1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入 了目的基因
（1）方法: DNA分子杂交
（2）过程:
①.首先取出转基因生物的基因组DNA ②.用含目的基因的DNA片段用放射性同位素 等作标记,以此做探针 ③.使探针和转基因生物的基因组杂交,若显 示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中
归纳步骤
2、检测目的基因是否转录出了mRNA
①方法: 分 子 杂 交
②过程: 用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,
（5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞 的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因 （或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色 荧光蛋白基因等。
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思考与探究2.根据农杆菌可将目的基因导入双子 叶植物的机理,你能分析出不能导入单子叶植物的 原因吗?若将一个抗病基因导入小麦中,理论上讲 你应该怎样做?
若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA
3、检测目的基因是否翻译成蛋白质
方法: 抗原抗体杂交
（二）、鉴定（个体生物学水平） 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
思考与探究：1.作为基因工程表达载体，只需含有
目的基因就可以完成任务吗？为什么？ 不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作 用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记 基因等。必须构建上述元件的主要理由是：
（2）设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组 引物（只标注了部分碱基序列）都不合理（如下图），请分 “汉水丑生的生物同行”超级群大型
公 益 活 动 ： 历年高 考题PPT版 制 作。 本 课 件 为 公 益作品 ，版权 所有， 不得 以 任 何 形 式 用于商 业目的 。2012年 1月 15日 ， 汉 水 丑 生标 记。
⑤结果： 使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增
利用PCR技术扩增目的基因
PCR技术
DNA复制
过程
DNA变性（90～95℃）→退火 （复性55~60℃）→子链延伸 （70~75℃）→重复循环
DNA复制起始，RNA引物形成 →DNA片段生成→RNA引物水解 →完整的DNA分子形成
相同 原则 点 条件
60℃部分引物与模 变性
板的单链DNA的特定
延伸
互补部位相配对和
结合
➢ 延伸：加热至70～ 75℃在Taq酶作用下， 合成互补的新DNA链
退火
（二）、利用PCR技术扩增目的基因
二、利用PCR技术扩增目的基因
① 概念：PCR全称为_聚__合_酶__链__式__反_应____，是一项 在生物_体__外_复制_特__定_D_N_A_片__段__的核酸合成技术
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归纳: 基因工程的基本操作程序. 构建基因表达载体
目的基因、启动子、终止子、标记基因
3. 将目的基因导入受体细胞
农杆菌转化法、显微注射法