ELISA试验技术要点
ELISA试验技术要点
ELISA试验技术要点ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种常用的生物化学技术，用于检测特定蛋白质或其他分子在样本中的存在量。
ELISA试验技术是基于抗原-抗体相互作用原理的一种快速、敏感的定量方法。
在本文中，我们将讨论ELISA试验技术的要点，包括原理、步骤、优缺点以及应用范围。
一、ELISA试验的原理ELISA试验通过测定受检物质与特定抗体之间的结合来检测受检物质的存在量。
ELISA试验通常包括4个基本步骤：涂底板、孵育、洗板和检测。
在涂底板过程中，将要检测的抗原或抗体固定在底板上。
然后，在孵育过程中，将待测样本加入底板，与固定的抗原或抗体结合。
接着，在洗板过程中，清洗掉未结合的物质。
最后，在检测过程中，使用酶标记的二抗或底物来确定结合的抗原和抗体的量。
二、ELISA试验的步骤1.涂底板：将抗原或抗体固定在底板上。
2.孵育：加入待检测样本，经过特定时间让抗原和抗体发生结合。
3.洗板：清洗掉未结合的物质，防止干扰物质的干扰。
4.检测：加入酶标记的二抗或底物，测量酶标记反应的信号强度。
三、ELISA试验的优缺点1.优点：ELISA试验具有高灵敏度和特异性，能够快速、准确地检测目标物质的存在量。
此外，ELISA试验的操作简单，不需要昂贵的设备。
2.缺点：ELISA试验在一定程度上受到干扰物质的影响，有时需要多步骤操作，容易出现误差。
四、ELISA试验的应用范围ELISA试验广泛应用于医学、生物化学、环境科学、食品安全等领域。
在医学领域，ELISA试验可用于诊断感染病原体、筛查肿瘤标志物等。
在生物化学领域，ELISA试验可用于研究蛋白质的相互作用、酶活性等。
在环境科学领域，ELISA试验可用于检测水体或土壤中的污染物。
在食品安全领域，ELISA试验可用于检测食品中的残留农药、重金属等。
总之，ELISA试验技术是一种重要的生物化学技术，具有广泛的应用价值。
ELISA原理及操作注意事项
ELISA原理及操作注意事项ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用于检测抗体或抗原的实验技术。
其原理是将待测物（抗体或抗原）通过特定的酶标记结合物与固定在试板上的配体结合，然后用底物与酶催化出彩色或荧光产物，从而通过测量产物的光学密度或荧光信号来定量检测待测物的含量。
1.实验仪器消毒：实验前应将使用的仪器、试剂瓶和器皿进行消毒，以避免实验中的污染。
2.条件优化：不同的ELISA实验条件可能有所不同，包括涂被物、孵育温度和时间、洗涤时间等，必须根据实验需要进行条件的优化。
3.阻断剂：在ELISA实验中，通常需要加入阻断剂（例如牛血清蛋白、鱼胶等）来减少非特异性的结合。
不同的样品可能需要不同的阻断剂浓度进行优化。
4.样品处理：对于待测物的检测，样品的处理包括稀释、加入试剂、混合等步骤。
处理时要注意对待测物的保存温度、避免阳性和阴性样品污染，以及避免样品的重复冻融过程，这可能会降低样品的稳定性。
5.孵育和洗涤步骤：酶标记物与涂被物结合的步骤通常需要进行一定的孵育时间和温度。
此外，洗涤步骤是为了去除不结合的物质，洗涤次数和洗涤液的成分必须根据实验需要进行优化。
6.制备酶标荧光物：在选择酶标物时，需要确保酶的活性和稳定性，并对荧光标记物的浓度和稀释倍数进行优化。
7.底物反应：根据所选择的酶，确定底物反应的最佳时间和温度。
避免底物超过反应时间，以防止过度反应导致结果不准确。
8.光学密度或荧光信号测定：ELISA的结果通常通过测量产物的光学密度（OD）或荧光信号来定量。
在测定前，必须确保光学和荧光仪器的正常工作，并根据实验条件和要求进行仪器校准。
9.数据分析：根据实验设计和实验目的，将ELISA的结果进行统计学分析，包括计算均值、标准差、相关系数等。
总结来说，ELISA是一种常用的实验技术，其原理基于酶催化反应。
在操作ELISA时需要注意实验仪器的消毒、条件的优化、样品的处理、酶标反应的制备和测定、以及数据的分析等方面。
ELISA步骤试剂及注意事项
ELISA步骤试剂及注意事项ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种广泛应用于生命科学、医学和工业领域的实验技术，用于检测和测定生物样本中的抗原或抗体。
以下是ELISA的一般步骤、试剂及注意事项的详细介绍。
一、ELISA步骤：1.样品制备：首先，需要将待测样品（血清、细胞上清、组织提取物等）制备成特定体积的稀释液，以便进行ELISA实验。
2.涂布：将测定物（抗原或抗体）加入固相（例如，微孔板或磁珠）上，使其与固相表面发生特异性结合。
3.阻断：将非特异性结合位点阻断，以降低假阳性结果。
常用的阻断剂包括牛血清蛋白（BSA）和干奶粉等。
4.孵育：将样品（稀释液）加入到涂布的微孔板孔中，与固相上的结合位点结合，并孵育一定时间，促使特异性结合反应进行。
5.洗涤：反复用洗涤缓冲液洗涤孔内的非特异性结合物质，以去除干扰因素。
6.探针反应：加入特定的称量标记的抗体或标记化的抗原，使其与待测样品特异性结合，并与固相上的结合位点结合。
7.洗涤：反复用洗涤缓冲液洗涤孔内的非特异性结合物质，以去除干扰因素。
8.显示：加入染色剂或底物，使其与标记物发生特异性反应，并显示颜色或荧光。
9.终止反应：加入终止液停止底物与染色剂的反应。
10.读板：使用酶标仪或光度计测量吸光度，在特定波长下测量显示产物的光密度，并根据标准曲线或控制组数据计算待测样品中特定抗原或抗体的浓度。
二、常用ELISA试剂：1.涂布缓冲液：主要用来将测定物溶解在其中，涂布在微孔板或磁珠上。
2.试样稀释液：用于制备待测样品的稀释液。
3.标准物：用于制作标准曲线，以确定待测样品中抗原或抗体的浓度。
4.阻断剂：用于封闭非特异性结合位点，以降低假阳性结果。
5.洗涤缓冲液：用于去除孔内非特异性结合物质。
6.探针：用于特定抗体或抗原的检测，通常经过标记，如HRP（辣根过氧化物酶）或荧光染料等。
7.显示试剂：用于显示标记物与底物的特异性反应，如碱性磷酸酶底物或H2O2和TMB（3,3',5,5'-四甲基苯基二唑基）等。
ELISA的技术要点及质量管理
抗原
谢谢！
每次加样应更换吸嘴，做到一人一 吸头，以免发生交叉污染;干吸头预 先在血清中抽吸三次。
样本稀释，目的是为了减少非特异性 反应，所以一定要先加稀释液后加样 本，且需振荡混匀。
温育
抗原抗体反应需要在一定温度（37），经过 一定的时间才能达到反应的平衡点
一般采用能使反应液温度迅速达到平衡的水 浴法。一种放在水浴箱的隔板上，另一种是 放在温箱的湿盒里。水要浸至板条的1/3处， 不可将板条叠加放置。
常见的显色系统有OPD和TMB二种，以后者最为常 见，而TMB酸不易终止因此必须尽快比色以免影响 结果。OPD终止后显棕色，测定波长为490nm；
TMB终止后显黄色，测定波长为450nm， 二种底物的校正波长均用630nm。 使用双波长的优点可以消除反应板条上的划痕手
印的干扰。同时要注意反应板应用纸吸干后才能 置酶标仪中比色，否则吸光度易出现负值或损坏 滤光片。
（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结 合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活 性； （3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据 加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在， 而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的 量成比例，因此，可以按底物显色的程度显示试验 结果。
3.基本方法
酶标仪 经常维护其光学部分，防止滤光片霉变， 定期检测校正
操作要求
建立标准操作程序 加样、温育、洗涤、显色、结果判读每一
步骤都参照技术要点的要求进行。
质量控制
定性试验
➢ 建议使用临界值血清界定法：将试剂盒所设的 阴阳性对照作为内对照指示反应；另设临界值、 高值质控血清，正常人血清作为外对照，与标 本同时检测，临界值S/C.O≥1，高值质控血清 S/C.O≥10，正常人血清A值在0.05~0.07之间。
ELISA操作流程及技术要点
编号 pg/mL
S7 2000
S6 1000
S5 500
S4 250
S3 125
S2 62.5
S1 31.25
S0 0
1. 2
洗液工作液
浓洗涤液按1:25倍用去离子水进行稀释。例如用量筒量取 240mL去离子水，倒入烧杯或其他洁净容器中，再量取10mL 浓洗涤液，均匀加入，搅拌混匀，在临用前配妥。浓洗涤 液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。
2
重要提示
1、实验开始前，请提前配置好所有试剂。试剂或样 本稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。 2、用户在初次使用试剂盒时，应将各种试剂管离心 数分钟，以便管盖和管壁上的液体集中到管底。 3、在配制标准品、检测溶液工作液时，请以相应的 稀释液配制，不能混淆。 4、因实际装量多于标示装量，配制工作试剂请用精 准的计量工具（移液枪或量筒等）量取，切勿不经量 取直接使用。 5、标准品、生物素标记抗体工作液、辣根过氧化物 酶标记亲和素工作液稀释前根据预先计算好的每次实 验所需的总量配制 ，实际配制时应多配制 0.1-0.4mL 。 请勿重复使用已稀释过的标准品、生物素标记抗体工 作液、或辣根过氧化物酶标记亲和素工作液。 6、标准品的稀释请勿于板中进行，标准品应于临用 前 15 分钟内配制。为保证实验有效性，建议每次实验 使用新的标准品。若保存得当，溶解后的标准品 S7 可 在 2-8 ℃保存， 7 天内使用有效。
4 、温育：为防止样本蒸发或污染，温育过程中酶标板必须 覆上板贴，实验过程中酶标板应避免处于干燥的状态。温育 过程中应随时观察温箱温度是否恒定于37℃，及时调整。温 育过程中，温箱不易开启太多次，以免影响温度平衡。 5 、洗涤：洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。 (1)手工洗板方法：吸去（不可触及孔壁和孔底）或甩掉 酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下 用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液按 200μL/孔注入孔内， 浸泡2分钟。根据操作步骤中所述，重复此过程数次。 (2)自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用 到正式实验过程中。 6 、显色：为保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应 尽快加入终止液。可在加入底物溶液后每隔一段时间观察一 下显色情况以控制反应时间（比如每隔10分钟）。当肉眼可 见标准品前3-4孔有明显梯度蓝色，后3-4孔显色不明显时， 即可加入终止液终止反应，此时蓝色立刻变为黄色。终止液 的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。 7 、底物溶液应为浅蓝色或无色，如果颜色严重变深则必须 弃用。底物溶液易受污染，请避光妥善保存。
ELISA的操作要点
ELISA的操作要点优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证ELISA检测结果准确可靠的必要条件。
1. 加样在ELISA检测中一般有3次加样，即加样本，加酶结合物，加底物。
加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。
加标本一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。
每次加标本应更换吸嘴，以免发生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加样。
有此测定（如间接法ELISA）需用稀释的抗体，可在试管中按规定的稀释度稀释后再加样。
加酶结合物应用液和底物应用液时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。
2 .温育在ELISA检测中一般有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合物后。
抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为温育(incubation)，有人称之为孵育，在ELISA中似不恰当。
ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。
以抗体包被的夹心法为例，加入板孔中的标本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。
这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。
在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。
这就是为什么ELISA反应总是需要一定时间的温育。
温育常采用的温度有24.5℃、37℃。
37℃是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。
在建立ELISA方法作反应动力学研究时，实验表明，两次抗原抗体反应一般在37℃经1-2小时，产物的生成可达顶峰。
保温的方式除有的ELISA仪器附有特制的电热块外，一般均采用水浴，可将ELISA板置于水浴箱中，ELISA板底应贴着水面，使温度迅速平衡。
为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，此时可让反应板漂浮在水面上。
若用保温箱，ELISA板应放在湿盒内，湿盒要选用传热性良好的材料如金属等，在盒底垫湿的纱布，最后将ELISA板放在湿纱布上。
ELISA技术要点及质量管理PPT课件
ELISA技术利用抗原或抗体与固相载体表面的抗原或抗体结合，再加入酶标记的 抗原或抗体，通过酶催化底物显色反应，实现对目标分子的检测。
ELISA技术的分类和应用
01 间接ELISA
02 夹心ELISA
03 竞争ELISA
04 重组ELISA
05 应用
用于检测抗体，将抗原吸 附在固相载体上，然后加 入待测血清，最后加入酶 标记的二抗，通过底物显 色反应检测抗体。
1 2
自动化与智能化
随着技术的发展，ELISA技术将进一步实现自动 化和智能化，提高检测效率和准确性。
多指标并行检测
未来ELISA技术将朝着多指标并行检测的方向发 展，能够同时检测多种指标，提高检测效率。
3
纳米技术与ELISA的结合
纳米技术将为ELISA技术带来新的突破，如纳米 探针、纳米酶等，提高检测灵敏度和特异性。
ELISA技术在食品安全检测中的应用实例
农药残留检测
ELISA技术可用于检测食品 中的农药残留，确保食品 的安全性。
兽药残留检测
ELISA技术可用于检测肉类、 禽蛋等食品中的兽药残留， 保障消费者的健康。
生物毒素检测
ELISA技术可用于检测食品 中的生物毒素，如细菌毒 素、真菌毒素等。
ELISA技术的发展前景和展望
选择适当的读数仪器和方法，确保实验结果的准确性和可靠性。
操作步骤
按照实验要求，进行加样、孵育、洗涤、显色等操作，确保实验过程的规范性和 准确性。
03
ELISA技术的质量控制
实验前的准备和要求
试剂准备
确保所有试剂都符合质 量标准，没有过期，且
在有效期内使用。
设备校准
确保所有的实验设备， 如酶标仪、洗板机等， 都经过校准，以确保结
ELISA试验技术要点
ELISA试验技术要点酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay,ELISA）⼀、基本原理：利⽤标记技术将酶标记到抗体（抗原）上，使待检物中相应的抗原（抗体）与酶标记抗体（抗原）发⽣特异性反应。
在遇到相应的酶底物时，酶能⾼效、专⼀催化、分解底物，⽣成有颜⾊的产物。
根据颜⾊的深、浅，可以判断待检物中有⽆特异的抗原（抗体）以及量的⼤⼩。
该⽅法可对待测样品进⾏定性和定量分析，同时具有微量、特异、⾼效、经济、简便等优点，因此是⼀种⼴泛应⽤于⽣物和医学领域的微量测定技术。
⽬前使⽤的酶联免疫检测⽅法很多，应⽤较多的有：间接法——⽤于测定抗体双抗体夹⼼法——主要⽤于测定⼤分⼦抗原竞争抑制法——主要⽤于测定⼩分⼦抗原⼆、试验材料及试剂酶标板（聚苯⼄烯微量96孔板）包被液（0.05M pH9.6 碳酸盐冲液）⽆⽔Na2CO3 1.59gNaHCO3 2.93g蒸馏⽔定容⾄1000ml洗涤液（0.1M pH7.4 磷酸盐缓冲液）NaCl 8.0gKCL 0.2gKH2PO40.2gNa2HPO4?12H2O 2.9g吐温-20 0.5ml蒸馏⽔加⾄1000 ml封闭液明胶1g包被液100ml抗体稀释液明胶0.1g洗涤液100ml底物缓冲液（pH5.0 柠檬酸-磷酸缓冲液）0.1M柠檬酸(19.2g/L) 24.3ml0.2M Na2HPO4 (28.4g/L) 25.7ml蒸馏⽔50mlTMB底物使⽤液TMB储存液（100mg溶于10mlDMSO,40C保存）0.1ml底物缓冲液10ml30%H2O2 10ul现⽤现配终⽌液（2M H2SO4）H2SO4（96%）22.2ml蒸馏⽔177.8ml三、基本操作1、间接ELISA操作步骤如下：包被酶标板：加适度稀释的抗原，0.1ml/孔，4℃孵育过夜；洗涤：倾去孔内的液体，在吸⽔纸上拍⼲，加⼊洗涤液，0.3ml/孔，洗涤三次，3min/次；封闭：加⼊1％明胶，0.2ml/孔；37℃孵育1h，洗涤同上待检⾎清：加⼊适当稀释度的待测⾎清，0.1ml/孔；37℃孵育1h，洗涤同上酶标记抗体：加⼊适当稀释度的酶标抗体，0.1ml/孔；37℃孵育1h，洗涤同上底物：加⼊TMD底物使⽤液，0.1ml/孔；37℃孵育15min终⽌液：加⼊2M H2SO4，0.1ml/孔；测定：终⽌后⽴即⽤酶标仪测定各孔OD 450nm。
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ELISA试验技术要点
1.抗原和抗体：ELISA试验的基础是抗原与抗体的特异性结合。
抗原
是分子或物质，可以激发免疫系统产生抗体。
抗体是由免疫系统产生的蛋
白质，可以与特定抗原结合。
在ELISA试验中，通常至少需要一种抗原和
一种抗体。
2.固相载体：ELISA试验通常需要使用固相载体来固定抗原或抗体。
常用的固相载体包括微孔板、磁珠和膜。
微孔板是最常用的固相载体，其
表面通常涂有抗原或抗体，并能与试样中的抗体或抗原发生特异性结合。
磁珠和膜在一些特定实验中也有应用。
3.目标分子的检测：ELISA试验可以用于检测和定量分析各种目标分子，包括蛋白质、抗体、细胞因子、药物、代谢产物等。
通过选择合适的
抗体对，可以实现对目标分子的高灵敏度和高特异性的检测。
4.直接ELISA：直接ELISA是最简单的ELISA形式之一，其适用于检
测抗原。
直接ELISA中，固相载体上涂有相应的抗体，待测抗原直接与抗
体发生特异性结合。
通过将固相载体进行洗涤，去除未结合的物质，可以
测量已结合抗原的含量。
6.间接亲和ELISA：间接亲和ELISA在间接ELISA的基础上更进一步，通过添加竞争性抑制物来检测少量的抗体。
这种方法可以在低浓度的抗体
中实现更高的敏感度。
7.双抗原ELISA：双抗原ELISA是另一种用于检测抗体的ELISA形式。
在这种方法中，首先将抗原与抗体结合，然后再添加标记有酶的第二抗体
与待测抗体结合。
通过测量标记物的酶活性，可以得出待测抗体的含量。
8.酶标记物和底物：为了检测待测分子的存在，ELISA试验常使用酶
标记物和底物。
酶标记物是一种酶化合物，结合在抗体或抗原上。
常用的
酶标记物包括辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）等。
底物是一
种可以与酶催化产生颜色的反应物质，如TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯二胺）或ABTS（2,2'-氨丙基苯并咪唑-2-磺酸盐）。
通过测量底物的颜色
变化，可以确定待测分子的存在和含量。
9.数据分析和结果解释：ELISA试验通常通过比较标准曲线上的样品
测量值，来确定待测分子的浓度。
标准曲线是用已知浓度的标准物制备的，通过测量标准物的浓度和对应的光密度，可以绘制出标准曲线。
根据待测
样品的光密度，可以通过标准曲线插值计算出待测分子的浓度。
总结：ELISA试验是一种常用的生物医学和生物化学研究技术，具有
高灵敏度和高特异性的优点。
通过选择合适的抗原和抗体，以及合适的酶
标记物和底物，可以实现对各种目标分子的定量检测。
数据分析和结果解
释需要通过比较样品测量值和标准曲线来确定待测分子的浓度。
ELISA试
验在医学诊断、药物研发和生物学研究中具有广泛的应用。