ELISA检测
Elisa检测原理及注意事项
4.试剂使用前要恢复到室温。
5.加样过程中枪头不要触碰到孔壁。
谢谢大家
5. Elisa实验注意事项：
1.加显色液要迅速，前后不要超过5min, 如果样本过多可以用排枪 加。
显色液加入以后，颜色反应就开始了，反应时间越长，颜色越深。
2.要通过预实验确定样本的稀释倍数，保证样本的吸光度在标准曲线 的量程内。吸光度超过量程，测出的浓度可能会偏低。公司的酶标仪 最高能测到4。
4. Elisa显色原理
Ab-HRP
PH<1
TMB+H2O2
H2O+OX-TMB
联苯醌 （450nm 测OD值）
蓝色 2M硫酸 黄色
酶标抗体：Ab-HRP HRP:辣根过氧化物酶 TMB：四甲基联苯胺(TMB) H2O2：过氧化氢 OX-TMB：一种氧化后的蓝色色物质
辣根过氧化物酶底物：鲁米诺、TMB 碱性磷酸酶底物：AMPPD β-D-半乳糖苷酶底物：甲基伞形酮-β-D-半乳糖苷
洗
洗
涤
涤
颜色越深，待测抗 原浓度越低
标准曲线
6000
5000 4000
y = 7741.3e-1.255x R²= 0.996
3000
2000
1000
0
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
2.抗原、抗体与固相载体（Elisa 板底）结合原理
固相载体 聚苯乙烯，具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其 上后仍保留原来的免疫学活性。
洗
洗
洗
涤
涤
涤
抗原（待测蛋白）含量和颜色深 浅呈正相关，颜色越深，抗原含 量越高。
ELISA试验技术要点
ELISA试验技术要点ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种常用的生物化学技术，用于检测特定蛋白质或其他分子在样本中的存在量。
ELISA试验技术是基于抗原-抗体相互作用原理的一种快速、敏感的定量方法。
在本文中，我们将讨论ELISA试验技术的要点，包括原理、步骤、优缺点以及应用范围。
一、ELISA试验的原理ELISA试验通过测定受检物质与特定抗体之间的结合来检测受检物质的存在量。
ELISA试验通常包括4个基本步骤：涂底板、孵育、洗板和检测。
在涂底板过程中，将要检测的抗原或抗体固定在底板上。
然后，在孵育过程中，将待测样本加入底板，与固定的抗原或抗体结合。
接着，在洗板过程中，清洗掉未结合的物质。
最后，在检测过程中，使用酶标记的二抗或底物来确定结合的抗原和抗体的量。
二、ELISA试验的步骤1.涂底板：将抗原或抗体固定在底板上。
2.孵育：加入待检测样本，经过特定时间让抗原和抗体发生结合。
3.洗板：清洗掉未结合的物质，防止干扰物质的干扰。
4.检测：加入酶标记的二抗或底物，测量酶标记反应的信号强度。
三、ELISA试验的优缺点1.优点：ELISA试验具有高灵敏度和特异性，能够快速、准确地检测目标物质的存在量。
此外，ELISA试验的操作简单，不需要昂贵的设备。
2.缺点：ELISA试验在一定程度上受到干扰物质的影响，有时需要多步骤操作，容易出现误差。
四、ELISA试验的应用范围ELISA试验广泛应用于医学、生物化学、环境科学、食品安全等领域。
在医学领域，ELISA试验可用于诊断感染病原体、筛查肿瘤标志物等。
在生物化学领域，ELISA试验可用于研究蛋白质的相互作用、酶活性等。
在环境科学领域，ELISA试验可用于检测水体或土壤中的污染物。
在食品安全领域，ELISA试验可用于检测食品中的残留农药、重金属等。
总之，ELISA试验技术是一种重要的生物化学技术，具有广泛的应用价值。
elisa的检测原理及步骤
elisa的检测原理及步骤ELISA也就是酶联免疫吸附法，是常见的一种免疫学实验技术，广泛应用于疾病诊断、药物检测和基因工程等多个领域。
下面对该检测方法的原理和步骤进行详细介绍。
一、原理ELISA是一种通过酶标记在特定抗原-抗体反应后，通过测定酶活性或者荧光强度来检测特定抗体或抗原的方法。
具体原理包括以下几个方面：1.抗体/抗原的孕育：为了进行ELISA检测，首先需要制备抗体或者抗原，在抗原的孕育过程中，一般采用细胞、细胞质、蛋白质、肝炎病毒核心抗原、抗体等作为抗原。
2.抗原加到板上：将抗原添加到检测板上，用于捕获待测样品中的特定抗体/抗原。
5.辣根过氧化物酶标记抗体加入：将与辣根过氧化物酶标记的抗体加入到检测板上，抗体与待测样品中的抗原结合。
6.底物加入：将底物（可以是苯基乙酸和过氧化物的混合物）加入到检测板上，通过酶标记抗体加强底物的催化，产生颜色。
7.读板：用酶标记抗体催化反应的底物生成的颜色强度，表示样品中的相应抗体或抗原的含量。
二、步骤ELISA步骤如下：1.制备捕获抗体：制备捕获抗体，将其吸附到检测板上。
2.将样品加入检测板：向检测板添加待测物质，例如蛋白质或者抗体。
3.洗涤步骤：用缓冲液冲洗检测板上的非特异性结合物质，以减少假阳性反应的出现。
4.加入探针抗体：加入与待测物质特异性结合的酶标记抗体。
6.底物加入：加入底物，让酶标记物质生成颜色。
7.读板：对反应所生成的颜色进行测量，例如比色法或者发光法等。
三、总结ELISA检测具有以下优点：非常准确、灵敏性高、易于操作、可产生准确可靠的结果等。
其通过测定酶活性成分的存在，展示了其在生物医学领域中的重要应用，帮助人们更好地理解生物分子，并依据该理解开展诸如疾病诊断、药物检测和基因工程等工作。
ELISA六种方法类型及原理
ELISA六种方法类型及原理ELISA（酶标检测）是用于检测免疫学反应的一种技术，全称为酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assays, ELISA），该技术是测定抗体及抗原的特异性相互作用的一种常用的检测方法。
ELISA通过酶联试验来灵敏地检测特异性抗体或抗原的含量。
ELISA检测方法有很多种。
常用的ELISA检测方法有以下六种：一、双抗体沉淀反应ELISA（DAP-ELISA）双抗体沉淀反应ELISA是一种比较简单的ELISA方法，该方法的原理是，在受体表面点涂两种类型的抗体，例如兔抗人IgG，而免疫反应物则是人IgG，受体与免疫反应物结合后，形成抗体-抗原复合物，其上自发形成特异性沉淀。
随着浓度的增加，抗原越多，沉淀凝固物也越多，膜上形成沉淀下降，沉淀量可以通过酶标仪测定，或者免疫发光法检测，大体上，兔抗人IgG及抗原分别点涂及酶标探针可能以1:1:2的比例，也就是在100 L的反应液中加入到受体和兔抗人IgG各10 L，抗原20 L的条件下进行反应。
二、夹心ELISA（Sandwich ELISA）夹心ELISA是一种常见的ELISA检测方法，它利用特殊的标记抗体完成免疫反应，以达到检测目的。
以IgG为例，在受体表面点涂一种特异性抗体,如兔抗人IgG，受体与人IgG结合形成复合物，在这一抗原复合物上再添加第二种特异性抗体，如抗兔IgG，第二种抗体结合复合物，并将复合物结合在受体表面，形成抗原“夹心环”，该免疫反应体系可以通过酶标仪来检测指示物的夹心量，计算受体中抗原的含量。
三、竞争ELISA（Competitive ELISA）竞争ELISA提高ELISA检测的灵敏度，竞争式ELISA也属ELISA技术范畴，该技术通过特异性抗体与抗原间竞争性结合而形成的结果来检测特异性抗原的浓度。
竞争ELISA的原理是：将偶氮羟化物体表膜点涂含有特异性抗原区域的抗体，若添加一定量的抗原（相同的特异性抗原）至反应液，则可形成抗原-抗体复合物，受体与抗原的竞争性结合，而非特异性的抗体-抗原复合物。
ELISA检测方法
ELISA检测方法ELISA（酶联免疫吸附实验）是一种常用的免疫学检测方法，广泛应用于医学、生物科学及环境科学等领域。
该方法利用抗体和酶的相互作用，能够检测和测定特定抗原或抗体的存在和浓度。
下面将详细介绍ELISA的原理、步骤、应用以及优缺点。
ELISA的原理主要基于抗原-抗体结合的原理。
首先，在固体表面（晶髓酶标板等）上吸附或共价结合抗原，形成抗原固相。
然后，将待测样品加入酶标板孔中与固定的抗原发生反应，形成抗原-抗体复合物。
随后加入特异性的酶标记抗体，使其与复合物形成二抗三重复合物。
最后，通过添加底物，酶催化底物产生可检测的色变反应，测定抗原或抗体的浓度。
1.抗原固定：将已知浓度的抗原加入酶标板中，并使其吸附在固体表面，形成抗原固相。
固相吸附通常通过物理吸附或共价结合实现。
2.试样加入：将待测样品加入酶标板中与固定抗原发生反应，形成抗原-抗体复合物。
通常需要对样品进行初步处理，如稀释、加入染色剂等。
3.二抗加入：将特异性酶标记的二抗加入酶标板中，与复合物发生特异性反应，形成二抗三重复合物。
4.清洗：通过洗涤剂将非特异性结合物洗去，以减少干扰。
5.基质加入：加入特定底物，如TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯二胺）或ABTS（2,2'-联氨基二（2-甲基丙酰氧）乙烷磺酸铵），酶催化产生彩色反应。
6.反应停止：用酸、碱或金属离子等停止反应，阻断底物的氧化反应，维持产色稳定。
7.反应测定：使用光度计测定产生的色素的吸光度或荧光。
ELISA具有广泛的应用。
在医学领域，ELISA常用于检测血液中的抗体和抗原，从而诊断传染病、自身免疫疾病等。
在生物科学研究中，ELISA可用于测定细胞因子、蛋白质等生物大分子的浓度。
此外，ELISA也可以用于检测环境样品中的污染物，如重金属、农药等。
1.灵敏度高：ELISA可以检测到较低浓度的抗原或抗体，常常超过其他方法的敏感度。
2.特异性强：ELISA利用特异性抗体进行识别，可准确检测特定的抗原或抗体。
ELISA试验技术要点
ELISA试验技术要点1.抗原和抗体：ELISA试验的基础是抗原与抗体的特异性结合。
抗原是分子或物质，可以激发免疫系统产生抗体。
抗体是由免疫系统产生的蛋白质，可以与特定抗原结合。
在ELISA试验中，通常至少需要一种抗原和一种抗体。
2.固相载体：ELISA试验通常需要使用固相载体来固定抗原或抗体。
常用的固相载体包括微孔板、磁珠和膜。
微孔板是最常用的固相载体，其表面通常涂有抗原或抗体，并能与试样中的抗体或抗原发生特异性结合。
磁珠和膜在一些特定实验中也有应用。
3.目标分子的检测：ELISA试验可以用于检测和定量分析各种目标分子，包括蛋白质、抗体、细胞因子、药物、代谢产物等。
通过选择合适的抗体对，可以实现对目标分子的高灵敏度和高特异性的检测。
4.直接ELISA：直接ELISA是最简单的ELISA形式之一，其适用于检测抗原。
直接ELISA中，固相载体上涂有相应的抗体，待测抗原直接与抗体发生特异性结合。
通过将固相载体进行洗涤，去除未结合的物质，可以测量已结合抗原的含量。
6.间接亲和ELISA：间接亲和ELISA在间接ELISA的基础上更进一步，通过添加竞争性抑制物来检测少量的抗体。
这种方法可以在低浓度的抗体中实现更高的敏感度。
7.双抗原ELISA：双抗原ELISA是另一种用于检测抗体的ELISA形式。
在这种方法中，首先将抗原与抗体结合，然后再添加标记有酶的第二抗体与待测抗体结合。
通过测量标记物的酶活性，可以得出待测抗体的含量。
8.酶标记物和底物：为了检测待测分子的存在，ELISA试验常使用酶标记物和底物。
酶标记物是一种酶化合物，结合在抗体或抗原上。
常用的酶标记物包括辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）等。
底物是一种可以与酶催化产生颜色的反应物质，如TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯二胺）或ABTS（2,2'-氨丙基苯并咪唑-2-磺酸盐）。
通过测量底物的颜色变化，可以确定待测分子的存在和含量。
elisa检测实验报告
elisa检测实验报告ELISA 检测实验报告一、实验目的本次 ELISA 检测实验的目的是定量检测样本中特定抗原或抗体的浓度，以评估实验对象的生理或病理状态。
二、实验原理ELISA（酶联免疫吸附测定）是一种基于抗原抗体特异性结合反应的免疫测定技术。
其基本原理是将已知的抗原或抗体固定在固相载体（如聚苯乙烯微孔板）表面，然后加入待检样本，样本中的待测抗原或抗体与固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。
接着，加入酶标记的第二抗体（或抗原），形成抗原抗体酶标记抗体复合物。
最后，加入底物，酶催化底物反应生成有色产物，通过测定有色产物的吸光度值，即可定量分析样本中待测抗原或抗体的浓度。
三、实验材料与设备1、试剂包被缓冲液（碳酸盐缓冲液，pH 96）封闭液（含 1% 5% 牛血清白蛋白的 PBS 缓冲液）洗涤液（含 005% Tween-20 的 PBS 缓冲液）样本稀释液（PBS 缓冲液）标准品（已知浓度的抗原或抗体）酶标记的二抗（辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记）底物溶液（如 TMB 或 pNPP）终止液（如 2M 硫酸或 1M 氢氧化钠）2、仪器与设备酶标仪（能够读取 450nm 或 492nm 波长的吸光度值）恒温培养箱移液器（量程分别为20μL、200μL、1000μL）聚苯乙烯微孔板离心机四、实验步骤1、包被将已知浓度的抗原或抗体用包被缓冲液稀释至适当浓度。
向聚苯乙烯微孔板的每孔中加入100μL 稀释后的包被液，4℃过夜或 37℃孵育 2 3 小时。
2、封闭倒掉包被液，用洗涤液洗涤微孔板 3 次，每次浸泡 3 分钟，然后拍干。
每孔加入200μL 封闭液，37℃孵育 1 2 小时。
3、加样倒掉封闭液，用洗涤液洗涤微孔板 3 次，然后拍干。
将待检样本和标准品用样本稀释液进行梯度稀释。
向微孔板的每孔中分别加入100μL 稀释后的样本和标准品，空白对照孔加入100μL 样本稀释液。
37℃孵育 1 2 小时。
《ELISA检测技术》课件
总结词
通过间接利用酶标记的抗抗体与待测 样本中的抗原反应。
详细描述
间接ELISA是在固相载体上包被已知 抗原，然后加入酶标记的抗抗体与待 测样本中的抗原反应，再加入底物显 色，达到检测抗原的目的。
夹心ELISA
总结词
通过酶标记的二抗将待测样本中的抗原夹在固相载体和酶标记的抗体之间。
详细描述
夹心ELISA是在固相载体上包被特异性抗体，然后加入待测样本与酶标记的二抗 反应，形成固相抗体-抗原-酶标记抗体的复合物，再加入底物显色，达到检测 抗原的目的。
《elisa检测技术》ppt 课件
目录
• ELISA检测技术概述 • ELISA检测技术的分类 • ELISA检测技术实验步骤 • ELISA检测技术的影响因素 • ELISA检测技术的优缺点 • ELISA检测技术的应用实例
01
ELISA检测技术概述
ELISA检测技术的定义
要点一
酶联免疫吸附分析（EnzymeLinked Immu…
一种基于抗原-抗体反应的检测技术，通过酶标记的方法将 免疫反应与化学信号放大，实现对目标分子的定量或定性 分析。
要点二
特点
灵敏度高、特异性强、操作简便、适用于大量样本检测。
ELISA检测技术的原理
抗原或抗体与固相载体表 面的抗原或抗体结合，形 成固相复合物；
加入酶标记的抗原或抗体 ，与固相复合物结合；
基因表达研究
通过ELISA检测技术可以检测基因表达产物的含量和活性，了解基因表达的规律和调控机制。
THANKS
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显色
01
02
03
显色
加入显色底物，使抗原抗 体复合物呈现颜色反应。
显色底物
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ELISA检测 ----- 固相捕获法测IgM抗体在病原体急性感染的诊断中，通常需检测IgM抗体，如急性甲型肝炎诊断的血清抗HAVIgM检测、急性乙型肝炎病毒感染的血清抗HBc lgM检测和TORCH项目的系列IgM检测等。
IgM抗体也有使用间接法测定的，如目前在市场上可见到的有些TORCH系列的IgM检测试剂盒。
在使用间接法测IgM抗体时，由于临床血清样本中含有高浓度的IgG抗体，其中部分特异IgG抗体将与IgM抗体竞争与固相抗原结合，从而干扰IgM抗体的检测。
因此，在使用间接法测定IgM抗体时，通常须将血清样本用抗人IgG抗体或SPA预处理，以去除IgG的干扰。
这样不但测定较为繁琐，而且影响测定的特异性和灵敏度。
目前，常用的IgM抗体检测方法为捕获法，即以抗人IgM抗体(抗人u链)作为固相抗体，当加入血清标本时，其中的IgM类抗体(特异的和非特异的)即可被固相抗体捕获，再加入特异抗原，其与固相上捕获的IgM抗体结合后，加入酶标抗特异抗原的抗体，最后加入底物显色。
具体操作步骤如下：1．首先将抗人IgMbt链抗体于碳酸盐缓冲液中40c下过夜包被聚苯乙烯等固相，形成固相抗体，洗涤去除未与固相结合或结合不紧的抗体后，用小牛血清或牛血清白蛋白等封闭，洗涤去除未结合的部分及杂质。
2．加入含待测IgM抗体的临床样本如血清等，温育一定时间后洗板；此时，待测样本中的IgM抗体就会与固相上的抗P链抗体反应而吸附于固相上。
3．加入特异的抗原如HAV抗原、HBcAg等，温育一定时间后洗板；此时，特异抗原就会与固相上的特异IgM抗体发生反应。
4．加入酶标记的抗特异抗原的抗体，温育一定时间后洗板；此时，在固相上即形成相应的抗原抗体复合物。
5．加入酶底物，温育显色测定本方法要着重注意的是RF(1gM类)及其他非特异IgM的干扰。
RF(1gM类)由于其能与固相抗人u 链抗体结合，并可与随后加入的酶标抗体(动物IgG)反应，从而导致假阳性反应。
而非特异IgM由于其在第一步温育中，可与特异IgM竞争与固相抗体结合，所以会影响测定的灵敏度。
因此，使用本法测IgM，必须对临床样本进行适当稀释。
样本稀释后，上述产生干扰作用的非特异IgM含量减少，而特异IgM由于处于相应病原体的急性感染期，滴度很高，一定稀释后，不会有明显影响，况且，在某些病原体如HBV的慢性感染阶段，IgM类特异抗体也能持续存在，只不过滴度要低很多。
因此，如不对血清样本稀释，就直接检测，即使是没有非特异IgM的干扰，阳性测定结果也没有急性感染的诊断价值。
现在，有些试剂生产厂家，为了迎合临床实验室减轻劳动强度、简便操作的要求，生产了不需对样本进行稀释的抗HAVIgM和抗HBclgMELISA试剂盒，现有不少实验室也在使用。
鉴于上面提到的原因，我们建议临床实验室在做抗HAVIgM和抗HBc lgM等类检测时，应使用对样本进行稀释的试剂盒，以保证检测的临床价值。
酶联免疫吸附测定ELISA结果判定的常用缩写ELISA测定按其表示测定结果的方式分为定性和定量测定两大类。
定性测定只是对标本中是否含有待测抗原或抗体作出“有”或“无”的结论，分别用“阳性”和“阴性”来表示。
可见定性测定通常是用于传染性病原体的抗原或抗体的测定，以判断特定病原体感染的存在与否。
而定量测定则是对标本中待测抗原的多少进行量值测定，以具体数值表示。
定量测定基本上是用于非病原体抗原物质的测定，如激素、细胞因子、肿瘤标志物、小分子药物等。
目前国内应用的ELISA试剂盒绝大部分是用于传染性病原体的抗原或抗体的定性测定，也有少部分用于。
FP，hCG、细胞因子等的定量测定。
ELISA定性测定的“阴性”和“阳性”的判定依据是试剂盒所确定的阳性判定值(cut-off)。
定量测定的“量值”依据是试剂盒中所带标准品同时测定得出的剂量反应曲线(又称标准曲线)。
实验室进行室内质控时使用。
下面再解释一下在ELISA定性测定结果判定中常用的一些缩写：(1)S／CO：其中S为sample(样本)或specimen(标本)的简写，表示的是标本测定的吸光度值，CO 为cut-off值的简写。
除竞争抑制法外，其他ELISA定性测定模式中，当S／CO值大于或等于1时，标本的测定为阳性，小于1时为阴性。
(2)S／N或P／N：其中S同(1)，N为negative(阴性对照)的简写，P为patient(患者)的简写。
较早的试剂盒很多都使用S／N或P／N≥2．1为阳性判定标准，现仍有一些试剂盒使用这种方式。
这种方式与S／CO方式无根本性区别，只不过是前者将阴性对照(N)的2．1倍视为cut-off值而已.酶免疫试验的优点及局限性酶免疫试验之所以能成为临床免疫检验中的主导技术，是与它的方法上的特异性和灵敏性、操作上的简便性以及试剂的稳定性分不开的，还有很重要的一点是，其对环境没有污染威胁。
尽管如此，作为一项免疫检验技术，酶免疫试验还是有其局限性的，不但所检测的生物学体液样本如血清中有可能存在各种干扰实验的因素，而且在实验过程中，影响结果的因素也很多，尤其是进行手工的ELISA测定时。
此外，在定性ELISA测定中，阳性判定值(CUT-OFF)的建立，是在一定的统计学基础上的，相对于某个具体的受检者来说，其有可能并不具备正确性。
例如，使用ELISA方法检测抗HCV及抗HIV或HBsAg，有时候，检测所得的阳性结也许并不是真正的阳性，而需要使用其他方法如重组免疫印迹(recombinant immunoblot as—say，RIBA)、蛋白印迹(Westernbl。
t，WB)或中和试验来确认，才能报告阳性。
这里抗HCV和抗HIV的检测均使用病毒部分的基因工程抗原，其他一些病毒如流感病毒、腮腺炎病毒和水痘病毒等感染人体后，亦或一些自身抗体，也有可能会导致假阳性反应。
HBsAg的测定主要是弱阳性的问题，这与ELISA测定的“灰区”有关系，处于cut-off值周围亦即“灰区”的结果的可靠性通常较差，阳性当然需要确认，阴性却也未必是真，这一点在血站筛检献血员血液时是非常重要的，必须引起注意，并采取适当的措施，防止此类严重影响人们健康的传染性疾病经输血传播，本书后面的有关章还会对此问题做详细论述。
此外，免疫测定的基础是抗原抗体的特异反应，因此，如检测抗原，除了要求抗体(单抗或多抗)是特异的外，还要求待测抗原上必须存在有能与所用抗体结合的抗原决定簇，如果因为基因突变导致某些位点的不表达，或者结合位点因为某些原因被封闭或阻断，都会影响抗体与抗原的结合，造成假阴性结果。
如检测抗体，则要求所用包被抗原应尽可能包含所有的特异抗原决定簇，同时又尽可能不含有非特异的成分，这一点往往由于技术水平的限制而难以完全做到，因此，从某种意义上来说，假阳性假阴性是不能完全避免的，尽管通过努力，可以将其降至很低的程度。
这也是建立临床免疫检验方法所努力的方向.酶联免疫吸附测定操作要点1 标本的采取和保存可用作ELISA测定的标本十分广泛，体液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、粪便）等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。
有些标本可直接进行测定（如血清、尿液），有些则需经预处理（如粪便和某些分泌物）。
大部分ELISA检测均以血清为标本。
血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成份均同等于血清。
制备血浆标本需借助于抗凝剂，而血清标本只要待血清自然凝固、血块收缩后即可取得。
除特殊情况外，在医学检验中均以血清作为检测标本。
在ELISA中血浆和血清可同等应用。
血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。
血清标本宜在新鲜时检测。
如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。
如在冰箱中保存过久，其中的可发生聚合，在间接法ELISA中可使本底加深。
一般说来，在5天内测定的血清标本可放置于4℃，超过一周测定的需低温冰存。
冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀宜轻缓，避免气泡，可上下颠倒混和，不要在混匀器上强烈振荡。
混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。
反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。
保存血清自采集时就应注意无菌操作，也可加入适当防腐剂。
2 试剂的准备按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。
ELISA中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的。
自配的缓冲液应用pH计测量较正。
从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。
试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。
3 加样在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。
加样时应将所加物加在LEISA 板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。
加标本一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。
每次加标本应更换吸嘴，以免发生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加样。
有此测定（如间接法ELISA）需用稀释的血清，可在试管中按规定的稀释度稀释后再加样。
也可在板孔中加入稀释液，再在其中加入血清标本，然后在微型震荡器上震荡1分钟以保证混和。
加酶结合物应用液和底物应用液时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。
4 保温在ELISA中一般有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合物后。
抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为温育(incubation)，有人称之为孵育，在ELISA中似不恰当。
ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。
以抗体包被的夹心法为例，加入板孔中的标本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。
这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。
在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。
这就是为什么ELISA反应总是需要一定时间的温育。
温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃（冰箱温度）等。
37℃是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。
在建立ELISA方法作反应动力学研究时，实验表明，两次抗原抗体反应一般在37℃经1-2小时，产物的生成可达顶峰。
为加速反应，可提高反应的温度，有些试验在43℃进行，但不宜采用更高的温度。
抗原抗体反应4℃更为彻底，在放射免疫测定中多使反应在冰箱中过夜，以形成最多的沉淀。
但因所需时间太长，在ELISA中一般不予采用。
保温的方式除有的ELISA仪器附有特制的电热块外，一般均采用水浴，可将ELISA板置于水浴箱中，ELISA板底应贴着水面，使温度迅速平衡。
为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，此时可让反应板漂浮在水面上。