ELISA检测技术

上机检测、绘制标准曲线 (空孔调零) 从标准曲线上 读取样品含量
加酶标抗体 (空孔除外) 37℃, 30min
ELISA试验中的注意事项
必须设立阳性、阴性和空孔对照孔，控制试验条件并检验 试剂盒的质量； 待测样品应设立双复孔或三复孔； 酶标板洗涤时确保洗涤干净，避免假阳性； 半定量（或定性）ELISA中结果判断依据通常为： OD样/OD阴≥2.1时为阳性结果，＜2.1时为阴性；
酶标板
ELISA常用酶类
辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)
DH2+ H2O2 D + H2O 上式中，DH2为供氢体，H2O2为受氢体。
常用底物：
1. 邻苯二胺(OPD)，产物为橙红色（492nm检测）； 2. 四甲基联苯胺(TMB)，产物为蓝色，酸性条件下变为 黄色（450nm检测）。
酶标记物
底物溶液
E
E E E E E E E E
E
E
E
E
对 照 孔
参考液(不含抗原)
酶标记物
底物溶液
E
E E
E
E
E
E
测 定 孔
样本(含抗原)
竞争法ELISA实验原理
E
E
半定量ELISA试验
间接法检测血清HBsAb含量
设计加板次序 (空孔、阴、阳) 加板 (阴、阳、样) 37℃, 30min 洗涤3次，拍干 37℃, 30min 洗涤3次，拍干 加底物溶液 (空孔除外) 避光 37℃, 10-30min
ELISA所需仪器设备
恒温箱
洗板机
酶标仪
ELISA的类型和方法
直接法 间接法
试验性质
双抗夹心法 (直接夹心法) 双夹心法 (间接夹心法) BAS-ELISA 竞争法ELISA
半定量ELISA试验
试验目的
定量ELISA试验
直接法ELISA
直接法ELISA是将酶标抗原或抗体直接与包被在酶标板上 的抗体或抗原结合形成酶标抗原-抗体复合物，加入酶反应底物， 测定产物的吸光值，计算出包被在酶标上的抗体或抗原的量 （见后图） 。该方法可用于检测抗体或抗原。 优点: 1. 特异性高、准确性好； 2. 实验操作简便，用时短。 缺点: 1. 应用范围较小，生产难度大。 ——需制备各种酶标抗原或抗体。
术中应用最广的技术。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附 （包被）在固相载体 ( 聚苯乙烯微量反应板，也称酶标板 ) 表 面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液 相中的游离成分洗除，加入相应的酶底物后发生颜色反应，通 过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，通过颜色反应 的深浅检测标本中相应抗体或抗原含量的检测技术 。
加终止液 (空孔除外) 上机检测、结果判定 (空孔调零)
加酶标抗体 (空孔除外)
双抗夹心法检测血清IL-2含量
设计加板次序 (空孔、阴、阳、标准) 加板 (阴、阳、标准、样) 37℃, 30min 洗涤3次, 拍干
洗涤3次, 拍干
加底物溶液 (空孔除外)
避光
37℃, 10-30min
加终止液 SA
竞争法ELISA的实验原理：将包被了抗体的酶标板的微孔分 为测定孔和对照孔，在对照孔中加入已知浓度的系列标准品溶液 和酶标记物（酶标抗原）；在测定孔中同时加入酶标抗原和待检 样本（抗原），酶标抗原和样品互相竞争包被抗体的结合点，形 成酶标记的抗原-抗体复合物固定在微孔内，没有吸附的酶标抗 原通过洗涤去除，加入底物后，复合物上的酶催化底物生成有色 产物。当测定孔内的样本不含抗原时，固相上的抗体将和酶标抗 原结合，加入底物后显色较深；当样本含有抗原时，样本中的抗 原和酶标抗原共同竞争抗体的结合位点。酶标抗原结合的比例越 高，说明结合在固相抗体上的待测抗原就越少，反之亦然；在一 定的条件下，复合物上酶的量和酶产物呈现的色泽成正比，用分 光光度计进行测定，从而计算出参与反应的抗原和抗体的量，从 而进一步得知样本中抗原的多少。
定量ELISA中每一批次的试剂盒必须绘制一个标准曲线；
定量ELISA中还应特别注意试剂盒的灵敏度(测定范围)。
ELISA试验的应用
抗体及抗体亚类检测（包括血清、制备的抗体溶液等） 抗原检测（包括制备的抗原、毒素、病原体等）； 细胞因子及其受体检测（人、小鼠、大鼠等来源）； 激素及其他生物活性分子检测（如HCG检测等）； BAS-ELISA还可用于核酸（DNA/RNA）检测；
酶联免疫吸附试验 (ELISA)
ELISA技术简介 ELISA的基本原理 ELISA的类型和方法 ELISA方法注意事项和应用
酶联免疫吸附试验（ELISA）
酶联免疫吸附试验( Enzyme-Linked Immunosorbent Test, ELISA ) ：
基于抗原-抗体反应的特异性和等比例性，是酶免疫测定技
反应终止液：HCl或H2SO4溶液。
碱性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP) 常用底物：
1. 对硝基苯磷酸酯 ( p-NPP )，产物为黄色的对硝基酚 （405nm检测）； 2. 发荧光底物（磷酸4-甲基伞酮），可用于荧光测定， 灵敏度高于显色底物的方法。
反应终止液：NaOH 溶液。
双夹心法ELISA
双夹心法是先将未标记的抗体包被在酶标板上，用于捕获抗 原，然后用未标记的抗体与抗原反应形成抗体-抗原-未标记抗体 复合物；再应用酶标二抗和抗体-抗原-未标记抗体复合物结合， 形成抗体-抗原-未标记抗体-酶标二抗复合物，也称为间接夹心法 （见后图）。 该方法可用于抗原检测，例如蛋白质、病原体等。 优点: 1. 灵敏度高。 2. 制备方便，无需制备特殊的酶标抗体。
ELISA试剂盒的组成
完整的ELISA试剂盒通常包含以下各组分： （1）已包被抗原或抗体的固相载体（俗称酶标板）； （2）酶标记的抗原或抗体（酶标记物）； （3）酶的底物； （4）参考标准品（定量试剂盒）及其稀释液； （5）酶标记物及样本的稀释液； （6）洗涤液（通常为浓缩液，用前按比例稀释）； （7）反应终止液； （8）封口膜若干、说明书一份。
缺点: 实验操作较复杂。
BAS-ELISA
BAS-ELISA即生物素-亲和素系统（biotin avidin system, BAS）ELISA法：是先将抗体包被在酶标板上，用于捕获抗原， 然后用生物素（biotin）标记的抗体与抗原反应形成抗体-抗原生物素标记抗体复合物，再依次加入亲和素、酶标记生物素（或 直接加入酶标记的亲和素），最后加底物显色。 生物素是一种生长因子，广泛分布于动、植物体内，又称辅 酶R或维生素H。亲和素由四个亚单位组成，对生物素具有高度 亲和力，即一个亲和素可以结合4个生物素分子。因此，本方法 具有信号放大功能（特点）。 该方法可用于抗原、抗体以及DNA和RNA（生物素）检测。
双抗夹心法ELISA
双抗夹心法是先将未标记的抗体包被在酶标板上，用于捕获 抗原，在用酶标的抗体与抗原反应形成抗体-抗原-酶标抗体复合 物，加入酶反应底物，测定产物的吸光值，计算出捕获的抗原量， 本方法也称为直接夹心法（见后图） 。 该方法可用于抗原检测，例如细胞因子、激素、蛋白质、细 菌、病毒等，是目前检测抗原最常用的ELISA方法。 优点: 1. 适用范围广，无需制备特殊的酶标抗体。 2. 制备方便，价格便宜。
ELISA的基本原理
基本原理
酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗 体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可 与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶 液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成 有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来 判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或 抗原的量呈正比。此种显色反应可通过分光光度计进行定量测定， 这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来， 使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。
间接法ELISA
间接法ELISA是将酶标记在二抗上，当抗体（一抗）和包被
在酶标板的抗原结合形成抗原-抗体复合物后，再以酶标二抗和
复合物结合，通过测定酶反应产物的颜色可以（间接）反映一抗 和抗原的结合情况，进而计算出抗原或抗体的量（见后图）。
该方法可用于抗体检测，是目前检测抗体最常用的ELISA方
法。 优点: 1. 适用范围广，无需制备特殊的酶标抗体; 2. 制备方便，价格便宜。
ELISA的发展概况
自从Engvall和Perlman（瑞典，1971）首次报道建立酶联免 疫吸附试验（ELISA）以来，由于ELISA技术具有快速、敏感、 简便、易于标准化等优点，使其得到迅速的发展和广泛应用 。 随着生物技术的快速发展，将利用基因工程技术制备的抗原 或单克隆抗体包被酶标板后，极大地提高了ELISA检测技术的 特异性，加之电脑化程度极高的ELISA检测仪的使用，使 ELISA更为简便实用和标准化，从而使其成为最广泛应用的检 测方法之一。 目前，ELISA检测技术在科学研究、疾病诊断、检验检疫、 环境监测等诸多领域广泛应用。