ELISA检测乙肝抗体HBsAb概论
电化学发光法和ELISA法检测HBsAb的结果分析_赵秀丽
·医学检验·2012年10月第19卷第28期乙型肝炎（hepatitis B，简称乙肝）是一种严重危害人类健康、传播广泛的病毒传染性疾病，据世界卫生组织报道，全球约有20亿人感染乙型肝炎病毒，每年有超过60万人死于乙型肝炎病毒所致肝硬化或肝癌[1]。
乙型肝炎病毒侵入人体后，刺激人体免疫系统中的B淋巴细胞分泌出一种特异的免疫球蛋白G，也就是常说的乙型肝炎病毒表面抗体（HB-sAb），它可以与表面抗原特异地结合，与人体的其他免疫功能共同作用消除掉病毒，保护人体不再受HBV的感染[2]。
所以，乙型肝炎表面抗体（HBsAb）是一种中和抗体，具有保护作用，它的检测是判断疫苗接种效果的重要指标[3]。
目前，乙型肝炎表面抗体的检测主要还依赖于酶联免疫吸附试验（ELISA）来判断是否阳性，并不能说明HBsAb是否能达到对机体的保护作用。
电化学发光法（ECLIA）作为一种新型标记免疫分析技术，在临床工作中也得到了越来越广泛的应用。
笔者2011年8～11月对本院536例HBsAb阳性的标本分别使用电化学发光法和ELISA方法进行检测，并对检测结果进行分析比较。
1材料与方法1.1标本来源选取沈阳医学院奉天医院2011年8～11月门诊和住院患者HBsAb为阳性的血液标本536份。
1.2仪器及试剂ECLIA采用Roche E170型全自动电化学发光免疫分析仪，HBsAb试剂盒、校准品、质控品均由Roche公司提供。
严格按照仪器和试剂说明书进行校准、质控、检测等操作。
ELISA法采用上海科华HBsAb试剂盒检测，实验仪器为安图酶标仪和洗板机。
所有试剂均在有效期内使用。
1.3阳性标准ECLIA法≥10IU/L为阳性；ELISA法按照说明书确定临界值：为2.1×阴性对照（阴性对照<0.05按0.05计算），每次标本测定值（S/CO）≥临界值为阳性。
1.4统计学处理数据采用SPSS11.0软件进行四格表分析。
乙肝表面抗体定性和定量两种检测方法相关性分析
乙肝表面抗体定性和定量两种检测方法相关性分析目的通过分析比较两种检测方法（ELISA法定性与电化学发光法定量）检测乙肝表面抗体（抗-HBs）的结果差异，探讨测定乙肝表面抗体（抗-HBs）的浓度值与定性检测结果s/co值之间的关系及对临床工作的指导意义。
方法用ELISA法定性与电化学发光法定量分别对96份标本进行检测分析。
结果电化学发光法结果在10mIU/ml判为阳性。
两种方法对乙肝表面抗体的对比检测结果分别见表1，表2。
由表1 、表2可以看出，HBsAb浓度值小于10mIU/ml和大于100mIU/ml 时，电化学发光法和ELISA法检测结果相近，用ELISA法基本能准确判定阳性和阴性。
但在10～100mIU/ml之间的标本电化学发光法共检测的36例阳性样本，ELISA法只有26例是阳性。
以10～50mIU/ml区段尤为显著。
整体来看电化学发光法检出阳性率为68.8%，ELISA法检测阳性率为59.3%。
2种方法检测差异显著，有统计学意义（P＜0.05）。
3 讨论在我国乙肝的感染率较高，由于HBsAb是一种保护性抗体，一旦人体受到隐性感染或经急性感染乙肝病毒并清除后，会产生HBsAb。
若人群接种乙肝疫苗后，机体也可产生HBsAb。
人体内的较高浓度的HBsAb可有效清除机体感染的乙肝病毒。
同时乙型肝炎又与肝癌的发生有密切的关系，因此，为防止乙肝的蔓延，要想达到控制乙型肝炎的的目的，就应该采用减少易感人群的方式。
据相关资料报道，HBsAb含量在10mIU/ml以上的人群并不都具有较强的免疫力。
HBsAb含量在10-100mIU/ml之间的人群对乙型肝炎的免疫力相对较弱，甚至不能预防乙肝病毒的感染。
相关资料表明只有HBsAb的含量大于100mIU/ml时，才具有抵抗乙肝病毒入侵的能力。
但也有研究者认为大于10mIU/ml可以用于个体免疫力强弱的评价[3]。
正是由于乙肝抗体定量检测的重要性，现在，很多实验室都开展了该项目的检测，它不仅能够判断是否需要接种乙肝疫苗还能对疫苗接种后的效果进行评估。
乙肝五项
李成静
乙肝五项（酶联免疫法ELISA)
两对半：
表面抗原HBsAg ① 表面抗体HBsAb ② e抗原HBeAg ③ e抗体HBeAb ④ 核心抗体HBcAb ⑤
检验原理
表面抗原HBsAg 表面抗体HBsAb e抗原HBeAg e抗体HBeAb 核心抗体HBcAb
夹心法
竞争法
双抗体夹心法
乙肝表面抗原检验原理
采用抗体包被反应板，加入待测样本， 经孵育后，加入酶标抗体，当样本中存 在抗原时，该抗原与包被抗体结合并与 酶标抗体结合形成抗体抗原酶标抗体复 合物，加入底物产生显色反应，反之则 无显色反应。
乙肝e抗体检验原理（竞争法）
采用抗原包被反应板，加入待测样本， 同时加入酶标抗体，与抗原形成竞争结 合，如待测样本中抗体含量高，则酶标 抗体与抗原结合少，加入底物时显色淡， 反之显色深。
检验方法
表面抗原（两步法）
1.配置洗液（25倍稀释）。 2.根据标本数排板，多加两孔作为阳性对照。 3.加75ul待测样本和阳性对照于反应孔中。 4.封板，置37℃加速仪温育40min。 5.取出反应板，不洗，每孔各加酶50ul（即一滴）。 6.封板置37℃加速仪温育20min。 7.取出反应板，洗液洗5次，清水冲洗，吸水纸上拍干。 8.每孔各加显色液A和B各一滴，混匀。 9.显色蓝色为阳性，无色为阴性。
谢谢Βιβλιοθήκη 后四项（一步法）1.根据标本数排板，加阳性对照一孔。 2.加入血清50ul和阳性对照于反应孔中，加酶一 滴。 3.封板，加速仪温育20min。 4.取出反应板，用洗液洗5次，清水冲洗，板拍 干。 5.每孔各加显色液A和B各一滴，混匀。
小鼠乙肝表面抗体(HBsAb)酶联免疫分析(ELISA)
小鼠乙肝表面抗体（HBsAb）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定小鼠血清，血浆及相关液体样本中乙肝表面抗体（HBsAb）的含量。
实验原理：本试剂盒应用双抗原夹心法测定标本中小鼠乙肝表面抗体（HBsAb）水平。
用纯化的小鼠乙肝表面抗体（HBsAb）抗原包被微孔板，制成固相抗体，往包被抗原的微孔中依次加入乙肝表面抗体（HBsAb），再与HRP标记的乙肝表面抗体（HBsAb）抗原结合，形成抗原-抗体-酶标抗原复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的乙肝表面抗体（HBsAb）呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中小鼠乙肝表面抗体（HBsAb）浓度。
试剂盒组成：试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份封板膜2片（48）2片（96）密封袋1个1个酶标包被板1×481×962-8℃保存标准品：90IU/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存样本处理及要求：1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
ELISA检测HBsAb
结
果
• 黄色为阳性，无色为阴性 • 酶标仪测OD450
• 先观察阳性对照孔、阴性对照孔。待测样品孔 颜色与阳性孔同，则为阳性。或样品OD值/阴 性对照平均OD值≥2.1判断为阳性，否则为阴性。
酶 标 比 色 仪
• 酶标比色仪简称酶标仪，通常指测读ELISA光 度计。针对固相载体形式的不同，各有特制的 适用于板、珠和小试管的设计。
• （3）酶反应的底物。
乙型肝炎病毒表面抗体的检测 ——双抗原夹心法测抗体
原
理
• 用HBsAg包被酶标板，加入待测标本，同时加 入HBsAg-HRP(辣根过氧化物酶) 。若标本中 存在HBsAb，则与包被HBsAg结合并与酶标 HBsAg结合形成HBsAg -HBsAb -酶标HBsAg 复合物，加入底物产生显色反应；反之则无显 色反应。
抗原： 抗体
1、表面Ag（HBsAg）
2、核心抗原（HBcAg）
HBsAb
HBcAb
3、e抗原（HBeAg）
两对半： HBsAg HBcAb HBeAg HBeAb HBsAb
Hg HBsAb HBcAb HBeAb + + + + + + + + + + + + HBV感染/无症状携带者 急性/慢性乙肝/无症状携带者
•
每孔加入显色剂A、显色剂B各一滴，充 分混匀，显色后每孔加入终止液一滴。
•
观察各孔颜色变化。
•
洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤， 但却也决定着实验的成败。
•
ELSIA洗涤：清除残留在板孔中游离的物 质，以及非特异性地吸附的干扰物质，达 到分离游离的和结合的酶标记物的目的。
乙肝五项检测
乙肝五项检测（ELISA法）一、检测目的：乙型肝炎病毒标志物(HBsAgHBsAb、HBeAg、HBeAb、HbcAb)检测。
二、测定原理：分别采用双抗体（抗原）夹心法和竞争法。
HBsAg、HBsAb原理：采用单克隆抗-HBs(HbsAg)包被反应板，加入待测标本，同时加入多克隆抗-HBs-HRP(HBsAg-HRP),当标本中存在HBsAg（HBsAb）时，该HBsAg（HBsAb）与包被抗- HBsAg（HBsAb）结合并与抗- HBsAg-HRP （HbsAb-HRP）结合形成抗- HBsAg（HBsAb）-抗- HBsAg-HRP（HBsAb-HRP）复合物，加入TMB底物产生显色反应，反之则无显色反应。
HBeAg原理：采用抗-HBe包被反应板，加入待测标本，同时加入抗—HBe-HRP，如待测样本中抗HBeAg时，就与包被抗-HBe、抗—HBe-HRP结合形成复合物，加入TMB底物产生显色反应，反之则无显色反应。
HBeAb原理：采用抗-HBe、HBeAg包被反应板，加入待测标本，同时加入HBe-HRP，与抗原形成竞争结合，如待测样本中抗-HBe含量高，则抗—HBe-HRP 与HBeAg结合少，加入TMB底物时显色淡，反之则显色深。
HBcAb原理：采用基因工程重组HbcAg包被反应板，加入待测标本，同时加入HBc-HRP，与抗原形成竞争结合，如待测样本中抗-HBc含量高，则抗—HBc-HRP 与HBcAg结合少，加入TMB底物时显色淡，反之则显色深。
三、操作步骤：1、将试剂从冷藏室中取出，30分钟后平衡至室温方可开启使用。
2、用蒸馏水将PBST浓缩液20倍稀释，作为洗液。
3、将微孔条固定于支架上，按序编号。
4、按具体使用试剂盒说明书加样、孵育、洗板、显色。
9、用酶标仪读数，取波长450nm,先用空白调零，然后读取各孔OD值。
四、结果判断：样品OD值／阴性对照平均OD ≥2.1，判断为阳性，否则为阴性。
ELISA法在乙肝两对半测定中的质量控制分析
ELISA法在乙肝两对半测定中的质量控制分析摘要分析酶联免疫吸附实验（ELISA）法检测乙型肝炎（乙肝）两对半的检验步骤，总结检测全程的相关影响因素。
检测前标本的准备、试剂盒的影响、检验人员的业务水平、检测过程中的标准操作规程、检测结果的解讀等是ELISA 法检测乙肝两对半的相关影响因素。
ELISA法是检测乙肝两对半的灵敏方法，严格遵循操作规程，加强质量控制，可有效排除相关影响因素的干扰，为乙肝的临床诊疗提供有力依据。
关键词乙肝两对半；酶联免疫吸附实验；质量控制我国的乙肝病毒目前感染率大概占到总人群的60%～70%，这其中乙肝表面抗原携带人群占总人口的7%左右，以此计算，全国约有9300万人携带乙肝病毒，其中慢性乙肝患者约2000万例[1-3]。
乙肝两对半作为现阶段临床诊断、治疗乙型病毒性肝炎及观察疗效的重要实验室指标，主要使用ELISA进行检测，其灵敏度高，但在其检测过程中影响因素较多，易导致假阳性或假阴性结果[4]。
因此在实际工作中，临床实验诊断过程中需要加强实验室的科学管理，不断强化检测的标准流程，加强实验室诊断的质量控制，为患者提供准确的检验结果，有利于疾病的早期诊断和治疗，同时减少医患纠纷等问题。
1 检测前的质量控制1. 1 标本的准备检测前应该保证标本无溶血现象，因为溶血导致红细胞破裂后会将体内过氧化物酶活性物质释放，这种过氧化物酶活性物质会和显色剂发生显色反應，影响显色比对；患者血块完全收缩也可能致使待检标本中的非特异性活性物质出现部分或者完全失活的情况发生[1]，尤其是在血液标本尚没有完全凝固的状态下，若强行对血清进行分离处理会导致纤维蛋白块形成，极易导致检测结果的假阳性。
此外患者基本信息的核对也是标本准备质量控制中至关重要的一步。
1. 2 试剂盒的影响选择的试剂盒，其质量是保证实验诊断结果准确性、特异性的必要前提。
但需要临床检验人员注意的是，目前市场上不同厂家的试剂盒在特异性、准确性、稳定性以及特异性存在一定差异，因此在实际操作过程中，要求试剂盒保存在4℃左右的环境下，并且需在测定前将试剂盒放置于室温进行平衡处理约0.5～1.0 h[5]。
酶联免疫分析法(ELISA)在乙肝两对半检测中的应用价值
酶联免疫分析法(ELISA)在乙肝两对半检测中的应用价值发表时间：2013-06-03T14:48:23.297Z 来源：《医药前沿》2013年第9期供稿作者：张玉花[导读] 使用SPSS17.0软件对本次医学研究数据进行统计学分析。
张玉花(四川省阿坝州九寨沟县疾病预防控中心检验科 623400) 【摘要】目的探讨酶联免疫分析法(ELISA)在乙肝两对半检测中的应用价值。
方法本次医学观察选取本院2011年1月至2012年12月之间收治的200例门诊体检患者为观察对象，所有患者均接受酶联免疫分析法和乳胶层析法检测，回顾分析患者乙肝两对半检测结果。
结果两组检查方法中，HBeAb、HBeAg和HBsAg检查结果对比无明显统计学差异（P>0.05）；HBcAb和HBsAb检查结果对比统计学差异明显（P<0.05）。
结论由本次临床研究结果可知，酶联免疫分析法用于乙肝两对半检测，具有较高的敏感性和特异性，有助于乙肝病毒的进一步检测，因而临床应用价值较高。
【关键词】酶联免疫分析法乙肝两对半检测【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2013）09-0145-01 近年来，乙型肝炎在我国发生率呈现出了逐渐上升的趋势，该疾病的发生会给患者的健康和正常生活造成较为严重的负面影响，因而应得到及时有效的预防和治疗。
乙肝两对半是现阶段应用率最高的一种乙型肝炎病毒血清检测指标，对于献血人员检查、流行病学调查和乙肝防治具有十分重要的意义。
本次临床研究对酶联免疫分析法在乙肝两对半检测中的应用价值进行了分析，现将本次临床研究结果报道如下。
1 资料和方法1.1 临床资料本次医学观察选取本院2011年1月至2012年12月之间收治的200例门诊体检患者为观察对象，男性130例，女性70例，患者年龄范围在28岁至62岁不等，平均年龄（44.5±15.6）岁。
1.2 方法使用上海科华生物技术有限公司生产的乙肝两对半试剂盒作为本次临床研究的检测试剂；使用美国伯乐公司生产的1575型洗板机和680型酶标仪作为本次临床研究仪器。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
+
急性感染趋向恢复（小三阳）
+
+
+
既往感染恢复期
+
+
-
既往感染恢复期
-
-
+
既往感染或“窗口期”
+
-
-
既往感染或接种过疫苗
两对半： HBsAg HBsAb HBcAb HBeAg HBeAb
HBV-Ag、Ab检测结果临床分析
HBsAg HBeAg
+
-
+
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
HBsAb HBcAb HBeAb
-
-
-
HBV感染/无症状携带者
-
-
-
急性/慢性乙肝/无症状携带者
-
-
+
急性/慢性乙肝
（传染性强，大三阳）
-
+
这种方法所测定的抗原只要有一个结合部位就可， 因此，对小分子抗原如激素和药物之类的测定常用此 法。该法的优点是快，因为只有一个保温洗涤过程， 但需用较多量的酶标记抗原。
➢ 操作步骤 1.从冰箱取出试剂盒，室温平衡30分钟。 2.按如下方式加待测血清，每孔1滴。
待1 待2 待3 阳性 阴性 空白
3.每孔加酶结合物1滴（孔上方悬空滴加，无气泡），混匀， 空白孔不加，置37度温箱30分钟。 4.取出反应板，弃液，拍干。 5.每孔注满洗涤液，（不要溢出）静置5秒后弃液，拍干， 重复洗涤5次，拍干。 6.每孔加显色剂A和B各1滴，置37度温箱15分钟。 7.每孔加终止液1滴混匀，观察结果。
放射免疫技术
免疫荧光技术
酶免疫技术
酶免疫技术
用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。 可用酶标测定
仪测定光密度（OD）来反应抗原或抗体含量，灵敏度可达到
ng-pg/ml水平。
Y
酶
酶
DH2 + H2O2
D + 2H2O
无色
有色
酶具有高效催化性：可以加快化学反应的速度 ；在反应前后， 没有质和量的改变；微量的酶便可发挥巨大的催化作用。
间接法
将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原；
加酶标抗体：与固相抗原抗体复合物中的 抗体结合，使该抗体问接地标记上酶；
加受检血清：其特异抗体与抗原结合， 形成固相抗原抗体复合物。
固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。
传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原 就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法 。
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定 方法中有三个必要的试剂：
（1）固相的抗原或抗体，即"免疫吸附剂" （immunosorbent）； （2）酶标记的抗原或抗体，3）酶反应的底物。
ELISA的类型
间接法（测抗体） 双抗体夹心法（测大分子抗原） 竞争法（测小分子抗原）
酶联免疫吸附试验-ELISA
➢ 实验原理
抗原或抗体吸附到固相载体表面后，以及抗原抗体与 酶连接后，仍保持免疫活性和酶活性，当酶遇到相应底物 时，在酶的催化下引起底物水解显色。产物的量与标本中 受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定 性或定量分析。
此法的特异性及灵敏度与荧光及同位素标记相似，但 其方法较以上两者简便，且不需特殊贵重仪器。因此，这 项技术目前正越来越广泛地被应用到医学的各个领域中。
双抗体夹心法
酶标抗体
血清样品 或参比品
底物
特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体； 标本中的抗原与固相载体上的抗体结合成固相抗原复合物； 加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合， 酶量与标本中受检物质的量成正相关；
酶标仪测定OD值
加底物：夹心式复合物中的酶催化 底物成为有色产物
终止液
根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量
酶免疫技术
酶联免疫吸附试验
用于检测可溶性抗 原或抗体
酶免疫组化法
用于检测组织中或 细胞表面的抗原
酶联免疫吸附试验-ELISA
ELISA是一种免疫测定（immunoassay，IA）。 抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记； 加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物； 产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定 性或定量分析。
➢ 结果观察
➢ 结果观察
乙型肝炎病毒采用ELISA检测法具有操作简便、灵敏度高、试 剂成本低、环保和适用于大批量人群抗原、抗体筛查等优点, 目前在国内实验室被广泛使用。 缺点易产生假阳性结果。
酶标仪洗板机
排枪加样 酶标仪
乙肝病毒（hepatitis B virus, HBV）
抗原,抗体: 1、表面Ag（HBsAg） HBsAb 2、核心抗原（HBcAg） HBcAb 3、e抗原（HBeAg） HBeAb
此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、 HBeAg、AFP等。只要获得针对受检抗原的特异性抗体， 就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。
竞争法
用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。 以测定抗原为例，将特异性抗体吸附于固相载体表面， 经洗涤后分成两组：一组加酶标记抗原和待测抗原的混 合液，而另一组只加酶标记抗原，再经孵育洗涤后加底 物显色，这两组底物降解量之差，即为所要测定的未知 抗原的量。
ELISA检测乙肝抗体
第三小组
肝表面抗体ELISA检测
➢ 实验目的
1.掌握ELISA的原理和操作方法。 2.熟悉酶标仪的使用方法。
免疫标记技术 免疫标记技术是用荧光素、酶、或者放射性核素等标记抗体或 抗原，利用标记技术的高度敏感性进行的抗原抗体的反应。
标记物
Y
细胞1
细胞2
分类
荧光素
放色性核素
酶