6高等植物遗传转化系统
第五章 植物基因的遗传转化
主讲：胡银岗植物科学系农学院植物科学系西北农林科技大学农学院西北农林科技大学植物基因受体系统质粒介导基因转化直接导入的基因转化第四节花粉管通道法介导基因转化第五节病毒介导的基因转化第六节植物基因转化系统的选择第七节单子叶植物的基因转化依赖于良好的植物受体系统的建立。
用于转化的外植体（如发苗产生子叶、胚轴等）通过组织培养途径或其它非组织培养途径能高效、稳定地再生无性系接受外源DNA整合对转化选择抗生素敏感植物基因转化受体系统的条件（一）高效稳定的再生能力（二）较高的遗传稳定性（三）具有稳定的外植体来源（四）对选择性抗生素敏感（五）对农杆菌侵染有敏感性（一）高效稳定的再生能力从理论上讲，植物的任何体细胞都具有再生完整植（totipotency）但在组织培养的实践中，并不是所有的体细胞都能再生出完营养生长中心（分生组织）和薄壁细易再生出植株。
再生频率必须具有好的稳定性和重复性。
植物转化频率一般情况下只有0.1%。
基因转化操作，如农杆菌侵染，使用抗菌素筛选及继代培养，都会使转化外植体再生频率降低，有的甚至不能分化，或只能分化形成芽，而难以形成植株。
若只有10%再生率，则转化率10% ×0.1% = 0.01%后不影响其分裂和分化，并能稳定地将外源基因遗传给后代，保持遗传的稳定性，尽量减少变异。
不因导入优良性状的目的基因，使原有的目的性状（优良性状）在后代发生了变异。
注意组培过程（组培方法，再生途径及外植体基因型）引稳定的外植体来源，即外植体容易得到并且可以大量提供。
因基因转化的频率很低，需要多项反复地实验，所以就需要大量的外植体材料。
转化的外植体一般采用无菌实生苗的子叶、胚轴、幼叶等，或采用快速无需复杂的培养和繁殖操作过程，数量亦多；接种前的无菌处理简便易行；一些植物可由无菌幼苗形成愈伤组织和再生植株；无需保持无菌苗的无性系，只要有种子，随时可大量培养已适应组织培养条件，有利于外植体转化生长；可直接采用、无需消毒；材料来源量大而稳定。
某大学生物工程学院《生物化学》考试试卷(3639)
某大学生物工程学院《生物化学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、判断题（100分，每题5分）1. 非循环式光合磷酸化既可产生ATP，也可产生O2和NADPH。
（）答案：正确解析：非循环式光合磷酸化电子沿Z形传递，直至NADP＋产生NADPH，电子传递过程中产生的H＋浓度差推动ATP的生成，同时分解H2O分子产生O2。
2. 所有核酸的复制都是在碱基互补配对的原则下进行。
（）答案：正确解析：3. 人体内若缺乏维生素B6和维生素PP，均会引起氨基酸代谢障碍。
（）解析：4. 原核生物和真核生物的染色体均为DNA与组蛋白的复合体。
（）[四川大学2015研]答案：错误解析：真核生物的染色体为DNA与组蛋白的复合体，而原核生物的染色体为DNA与碱性精胺、亚精胺结合。
5. 真核细胞的基因转录也具有抗终止作用。
（）答案：正确解析：抗终止作用即是转录水平上的通读，某些真核细胞基因的转录可在特定的条件下可以发生这种现象。
6. 2,4二硝基苯酚（DNP）可解除寡霉素对电子传递的抑制。
（）答案：正确解析：2,4二硝基苯酚（DNP）是一种解偶联剂，它可使呼吸链上的电子流动与氧化磷酸化失去偶联关系。
本来寡霉素是通过抑制氧化磷酸化而间接抑制电子流动的。
当氧化磷酸化与呼吸链不再偶联的时候，寡霉素将丧失对电子流动的抑制作用。
7. 放线菌素D既能抑制DNA的复制，又能抑制转录。
（）解析：8. 氨基酸活化时，在氨酰tRNA合成酶的催化下，由ATP供能，消耗一个高能磷酸键。
（）答案：错误解析：9. 嘧啶环和嘌呤环在分解代谢中均被水解开环，且降解产物均易溶于水。
（）答案：错误解析：嘧啶环分解过程中开环，降解产物易溶于水。
但嘌呤环不同。
10. 原核生物中的三种终止与释放因子分别识别三种终止密码子。
植物遗传转化步骤
植物遗传转化步骤植物遗传转化是指通过外源DNA的导入，使植物细胞或组织发生基因改变，从而获得具有特定性状的转基因植物。
这一技术在农业、医学和工业等领域有着广泛的应用。
下面将介绍植物遗传转化的基本步骤。
步骤一：选择外源DNA在植物遗传转化中，首先需要选择外源DNA，也就是我们要导入到植物细胞中的目标基因。
这个目标基因可以来自于其他物种，也可以是人工合成的。
目标基因的选择取决于我们希望在转基因植物中表达的特定性状。
步骤二：构建转化载体将目标基因导入植物细胞需要使用载体。
载体是一种专门设计用于植物遗传转化的DNA分子。
通常，载体由多个组成部分组成，包括启动子、终止子、选择标记和目标基因。
这些组成部分的功能是确保目标基因能够在植物细胞中正确表达。
步骤三：转化载体导入植物细胞一旦构建好转化载体，接下来就需要将其导入到植物细胞中。
目前，有多种方法可以实现这一步骤，包括农杆菌介导转化、基因枪法和电穿孔法等。
这些方法都可以有效地将外源DNA导入植物细胞，使其成为转基因细胞。
步骤四：筛选转基因细胞一旦植物细胞被导入外源DNA，我们需要对其进行筛选，以确定哪些细胞成功地获得了目标基因。
为了实现这一步骤，常常会在转化载体中加入选择标记基因，如抗生素抗性基因。
只有携带了目标基因的细胞才能存活下来，而其他细胞则会被筛选掉。
步骤五：培养和再生转基因植物筛选出的转基因细胞可以通过培养和再生来获得完整的转基因植物。
这一过程通常需要在培养基上进行，通过提供适当的营养物质和激素来促进细胞分裂和分化。
经过一段时间的培养，转基因细胞可以发展成为转基因植物。
步骤六：鉴定转基因植物需要对获得的转基因植物进行鉴定，以确认其是否成功地获得了目标基因。
这一步骤通常需要使用分子生物学技术，如PCR和Southern blot等，来检测目标基因的存在和表达。
只有经过鉴定的转基因植物才能用于进一步的研究或应用。
总结：植物遗传转化是一项复杂的技术，需要经历多个步骤才能成功。
植物遗传转化
花椰菜遗传转化方法如图： 发根农杆菌介导 根瘤农杆菌介导
（三）林木遗传转化的技术
目前以掌握了杨树、白桦、桉树、落叶松、核 桃、苹果、沙田柚等树种外源基因转化技术。主要 转化方式是农杆菌介导法。增强植物抗病、耐高温、 耐旱等方面。
（四）药用植物遗传转化的技术
主要采用农杆菌介导法，其他方法成功的例子 极少。
第十七章：植物遗传转化
Section 1: 植物遗传转化的方法
Section 2: 转化植株的检测 Section 3: 几种植株遗传转化的 技术
植物遗传转化 （plan genetic transformation): 应用重组DNA技术、细胞组织培养 技术或种质 系统转化技术，有目的地将外源基因或DNA片 段插入到受体植物基因组中并通过减数分裂获 得新植株的技术。
•
（2）方法：人们将目的基因插入到经过 改造的T—DNA区，借助农杆菌的感染实现外 源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过 细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。 农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中， 近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物 (尤其是水稻)中也得到了广泛应用。
（3）转化步骤可简单概括为以下方面：
Section 2: 转化植株的检测
以报告基因检测为例：
报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶
的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被 鉴定的基因。目前主要的报告基因如下：
Section 3: 几种植株遗传转化的技术
（一）大田作物遗传转化的技术
①油菜的遗传转化技术 农杆菌介导转化法：根据不同的基因型选择适的培养基。
1、获取目的基因。用限制酶切割下目的基因。 2、基因表达载体的构建。将目的基因与载体（大 多数选用质粒）用DNA连接酶连接起来。 3、将目的基因导入受体细胞。将含目的基因的重 组质粒导入农杆菌（农杆菌为受体细胞）。 4、目的基因的检测与鉴定。用DNA分子杂交技术/ 分子杂交技术/抗原-抗体杂交/个体生物学水平鉴定 （这个方法需要导入重组后的细胞的植物体，详见 第五步） 几种方法进行检验（根据要求选取不同方 法）。 5、最后将成功表达的细胞导入植物体内，对植物 体进行个体生物学水平鉴定。
[医学]第十一章植物的遗传转化技术
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二、植物遗传转化方法
1.农杆菌介导法 农杆菌是一类革兰氏阴性土壤杆菌（G－），活在植物
根的表面依靠由根组织渗透出来的营养物质（冠瘿碱）生 存的一类细菌。
农杆菌可分为根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciems （含Ti质粒）和发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes （含 Ri质粒） ，在植物基因工程中以根瘤农杆菌的Ti质粒介导 的遗传转化最多。
二、植物遗传转化方法
1.农杆菌介导法 Ti质粒的改造 除去T-DNA上的生长素（tms）和分裂素（tmr）生物合成基因， 因为大量的生长素和分裂素会抑止细胞再生长为整株植物； 除去T-DNA上的有机碱生物合成基因（tmt）；因为有机碱的合成 大量消耗精氨酸和谷氨酸，影响植物细胞的生长； 除去 Ti 质粒上的其它非必需序列，最大限度地缩短载体的长度； 安装大肠杆菌复制子，使其能在大肠杆菌中复制，以利于克隆操作； 安装植物细胞的筛选标记，如 neor 基因，使用植物基因的启动子 和polyA化信号序列； 安装多聚人工接头以利于外源基因的克隆。
一、植物遗传转化的受体系统
二、植物遗传转化方法
转基因方法 概括起来说主要有两类： 第一类是以载体为媒介的遗传转化，也称为间接转移 系统法。如农杆菌介导法、病毒介导法。 第二类是外源目的DNA的直接导入。如基因枪法、电 激法、超声波法、显微注射法、花粉管通道法等。
二、植物遗传转化方法
载体介导转移系统 最常见的转基因方法。 将外源基因重组进入适合的载体系统，通过载体将携 带的外源基因导入植物细胞，整合在核染色体组中并随核 染色体复制和表达。 农杆菌Ti质粒（tumor-inducing plasmid）或 Ri质粒 (root-indcing plasmid)介导法是迄今为止植物基因工程中应 用最多、机理最清楚、最理想的载体转移方法。
十章园艺植物遗传转化1ppt课件
第二节 园艺植物遗传转化方法
一、外源裸露DNA的转化
（一）化学诱导转化法
化学诱导DNA直接转化是以原生质体为受体，借助于特定 的化学物质诱导DNA直接导入植物细胞的方法。
目前用于转化细胞的化学物质有聚乙二醇（PEG）、聚鸟 氨酸、聚乙烯醇等，其中最常用的化学物质是PEG。
第二节 园艺植物遗传转化方法
第一节 园艺植物遗传转化受体系统
（2）原生质体受体系统
原生质体转化受体系统的优点： a）原生质体无细胞壁，能够直接高效的摄取外源DNA或遗传 物质 b）通过原生质体培养，细胞分裂可形成基因型一致的细胞克 隆，无嵌合性愈伤组织，由其再生的转基因植株无嵌合性 c）原生质体转化受体系统易于在相对均匀和稳定的同等控制 条件下进行准确的转化和嵌合 d）适用于各种转化系统
第一节 园艺植物遗传转化受体系统
(5)对农杆菌侵染的敏感性
1）农杆菌介导的 遗传转化体系需要受体材料是农杆菌的 天然寄主，否则难以实现遗传转化
2）农杆菌Ti或Ri质粒是植物遗传转化的有效载体系统，但 其宿主范围局限于部分双子叶植物，对大部分单子叶植 物和裸子植物不敏感，不同植物，同一植物的不同组织 细胞对农杆菌的敏感性也有很大差 因而，在选择农杆菌转化系统前必须测试受体系统 对农杆菌的敏感性，只有农杆菌侵染敏感的植物才能作 为受体系统
植物生物技术：第九章 植物遗传转化载体
农杆菌可分为根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciems（含Ti质粒 ）和发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes （含Ri质粒） ，在植
物基因工程中以根瘤农杆菌的Ti质粒介导的遗传转化最多。
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病毒载体感染植物细胞以后只是利用寄主细胞的功能在细胞质进 行复制和表达；同时又由于病毒具有高效自我复制能力，故在转 化植物中可得到高拷贝外源基因，从而十分有利于外源基因的表 达和功能的实现
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Ti质粒结构
毒性区（vir区）：激活T－DNA的转移
T－DNA区： 侵染植物时，从Ti质粒上 被切割，转移到植物细胞中，带有与 肿瘤形成有关的基因
接合转移区：存在与细菌间进行接合有 关的基因
复制起始区：保证Ti质粒进行自我复制
T-DNA 区
Cytokinin
Auxin
Opine
左边界
右边界
Ti 质粒
第九章 植物遗传转化载体
1
第9章 植物遗传转化载体
本章主要内容
• 第一节 植物遗传转化载体的种类及特点 • 第二节 农杆菌质粒系统的结构、功能和构建 • 第三节 植物病毒载体 • 第四节 叶绿体转化载体 • 第五节 遗传转化常用的选择标记基因及及无选择标记基因转化系统
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第9章 植物遗传转化载体
本章教学目的与要求
含子、信号肽等）连接在一起构成基因。
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启动子
Ti质粒
Nos（胭脂碱合成酶基因）、Ocs（章鱼碱合成酶基因）等
基因具有与真核生物启动子类似的TATA盒和CAAT盒，均能在植 物细胞中表达，并且无组织特异性。因此，它们成为早期构建 嵌合基因的启动子。
大豆瞬时转化体系和遗传转化体系的建立与应用
大豆瞬时转化体系和遗传转化体系的建立与应用一、引言大豆（Glycine max）是我国的主要农作物之一，其种子含有丰富的优质蛋白质和油脂，被广泛用于食品加工、饲料生产和生物能源开发等领域。
然而，提高大豆的产量和抗逆性一直是大豆育种领域面临的挑战。
为了解决这一问题，科研人员不断努力，建立了大豆瞬时转化体系和遗传转化体系，并将其应用于大豆育种中，取得了显著的成果。
二、大豆瞬时转化体系的建立与应用1. 大豆瞬时转化体系的概念及原理大豆瞬时转化体系是指利用农杆菌介导法将外源基因导入大豆离体部分，经瞬时表达后再转移到植株体内的一种转化技术。
该技术的核心原理是通过利用农杆菌的T-DNA片段将目的基因导入大豆受体细胞，利用激素和植物生长物质的作用，实现外源基因在大豆植株体内的转化和表达。
大豆瞬时转化体系的建立为大豆遗传改良提供了重要的技术手段。
2. 大豆瞬时转化体系的应用进展利用大豆瞬时转化体系，科研人员已经成功地转化了多种外源基因，并将其导入大豆植株体内。
通过该技术，不仅可以实现外源基因在大豆植株体内的高效表达，还可以实现特定基因的靶向编辑和调控。
利用大豆瞬时转化体系成功导入了抗病基因、抗逆基因和营养改良基因等，为大豆的抗病、抗旱、抗寒和产量性状的改良提供了重要的技术支持。
三、大豆遗传转化体系的建立与应用1. 大豆遗传转化体系的概念及原理大豆遗传转化体系是指利用基因编辑技术，通过CRISPR/Cas9系统等工具对大豆基因组进行精准编辑和改造的一种转化技术。
该技术的核心原理是利用CRISPR/Cas9系统的靶向特异性，将Cas9蛋白和RNA 导向的DNA裂解酶导入大豆细胞内，通过靶向编辑特定基因，实现对大豆遗传特性的调控和改良。
2. 大豆遗传转化体系的应用进展近年来，大豆遗传转化体系的应用进展迅速，科研人员已经成功地利用CRISPR/Cas9系统对大豆的多种性状进行精准编辑和改良。
通过该技术，不仅可以实现对大豆产量、品质和抗逆性状的调控，还可以实现对大豆次生代谢途径和生长发育过程的精准编辑。
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缺点：
目前对植物病毒分子生物学研究十分初浅，还 不能建立有效遗传转化体系。迄今为止，植物病毒 载体尚未发展到可以广泛使用的阶段。
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重组双子座病毒载体系统感染植物示意图
NPT II
外壳蛋 白基因
DNA A
DNA B
2020日/11/趋22 减少。
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基因枪及动力源的类型
❖火药爆炸轰击载体
塑料子弹为载体，火药爆炸为动力，挡板阻挡塑料载体，而金属子弹高速 轰击靶细胞。
❖压缩气体冲击载体
以压缩氦气动力，可裂膜携带微弹高速运动，以阻网阻挡可裂膜，微弹轰 击靶细胞。
❖高压放电基因枪
高压放电使水气化产生动力，驱动微弹载体。
优点：可瞄准靶细胞定位导入外源DNA，与其他方法比较对靶 细胞损伤小、恢复快。单、双子叶植物均可，受体细胞可以是 花粉、单细胞或组织、器官。 缺点：需要相应昂贵的设备，穿刺处理速度较慢。
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六 PEG介导法
PEG为化学渗透剂，通过改变细胞膜的通透性促 使外源DNA进入靶细胞。所引起的膜透性可以恢复， 但引起的外源DNA进入机制尚不清楚。
❖压缩气流直接传送
以氦气动力直接驱动微弹。
❖微靶点射击
无需载体，将DNA与金属颗粒混合为小液滴，压缩气体为动力轰击。
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基因枪转化法的影响条件
1 DNA：高纯度的DNA；质粒或裸露DNA 片段大小在 20-
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四 显微注射转化法
利用显微装置将大分子物质（DNA）或细胞器注 射到培养细胞中。最初主要由于动物，80年代中后 期开始用于植物遗传转化。用微毛细管在显微镜下 将外源DNA导入特定细胞，并使其成活、增殖。
技术要点：注射针直径要细（1uM）;选择生长旺盛 的胚性细胞；注射细胞核；进行微培养法。
优点：可精细选择受体细胞，并直接导入细胞核。
技术原理：首先获得原生质体，并有相应的组培再 生体系。在一定渗透压体系内将外源DNA直接导入。 改进的方法有（1）脂质体法，将外源DNA与脂质体 （磷脂双分子膜）的复合体用于转化；（2）电击法 与PEG法相结合等，可提高转化效率。
特点：由于原生质体及相应的组培体系的获得较难，
且培养周期长、细胞遗传背景易变异，故PEG法使用
基因枪价格昂贵，转化成本较高，轰击过程对细胞损害较大， 转化效率有待进一步提高。
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二 电击法
又称电击穿孔法，80年代发展起来的遗传转化技术， 利用高压放电产生的脉冲使细胞膜产生可逆的“微 孔”，从而使外源DNA等进入细胞。 最早应用于原生质体，近来有直接转化带壁植物细胞 核组织的报道。
1 花粉管通道法：周光宇（1981）首先提出，之后
有不少改良。使子房预先充分授粉，在授粉后至合
子分裂之前，通过花柱断面滴加或子房注射，使外
源DNA到达培囊，搜集成熟种子，筛选转基因植株。
我国目前推广面积最大的转基因抗虫棉就是用花粉
管通道法培育出来的。该法的最大优点是不依赖组
20织20/1培1/22养人工再生植株，IMAU, Huo XW
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一 基因枪转化法
又称微弹射击法、粒子轰击法、高速粒子喷射技术、弹道 微靶点射击，将载有外源DNA的金属（钨或金）经驱动后通 过真空小室进入靶组织的一种遗传转化技术。
采用的基因枪分为火药引爆、高压放电、压缩气体等。
1987年美国康奈尔大学的Sanford首次用于植物遗传转化。 可用受体范围广泛，单、双子叶植物均可，许多单子叶植物 遗传转化的主要方法。
外壳蛋白基因及复制 细胞间传递
注射
DNA A-NPT II
双元表达载体
三周后
LB 2020/11/22
RB
叶片组织产
生kan抗性
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农杆菌
高等植物细胞直接转化法
❖ 基因枪转化法 ❖ 电击法 ❖ 生殖细胞原位转化法（花粉管通道法） ❖ 显微注射法 ❖ 激光微束穿刺法 ❖ PEG介导法（化学共培法）
第六讲 高等植物遗传转化系统
The System for Plant Gene Manipulation
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高等植物遗传转化系统
❖ 农杆菌介导转化方法 ❖ 直接转化（理化法） ❖ 病毒感染
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病毒载体介导的植物遗传转化
植物病毒可以感染植物寄主细胞，并进行复制和表达植物外源 DNA。利用植物病毒的特性有希望发展成为一种有价值的植物 遗传转化体系。
优点： ➢部分植物病毒对寄主的感染是系统性的，可扩散到寄主所有 细胞，故无需组培再生； ➢可对单子叶植物进行高效浸染； ➢病毒感染的植物能够繁殖大量病毒颗粒，有望大量生产外源 蛋白。
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2 花粉介导法：收集成熟花粉，基因枪等转化 花粉，后用转化后的花粉授于成熟的柱头上， 最后搜集成熟的种子。
优点：避开组织培养再生的过程，技术简单， 不需要装备精良的实验室，适合于难以再生 的植物，常规育种工作者易于掌握 。
缺点：技术MAU, Huo XW
缺点：工作效率低，需要特殊显微操作系统，操作
复杂。 2020/11/22
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五 激光微束穿刺法
利用激光微束（0.3-0.5uM）射击靶细胞，引起可逆性穿孔， 从而直接导入外源DNA。首先在动物与人的细胞中获得成功， 80年代后期用于植物。 技术原理：激光照射系统产生高能量激光脉冲，照射经高渗处 理的材料，产生穿孔后，外源DNA向靶细胞渗入。然后培养靶 组织，产生转化植株。
国际公认的一种成熟可靠转化法，对受体无限制， 可用于胚性愈伤组织、悬浮细胞、分生组织、器官等。 但需对转化参数进一步优化，转化效率低。
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三 生殖细胞原位转化法
植物生殖细胞指雌雄配子体中形成的或参与生殖 过程的有关细胞，如大小孢母细胞、卵细胞与花粉。 生殖细胞原位转化法利用天然繁殖过程为转化系统 进行遗传转化。