高效液相色谱-HPLC
高效液相色谱法
2．高效液相色谱法与气相色谱法的比较
（l）气相色谱法：分析对象仅占有机物总数的20％。 高效液相色谱法：分离和分析占有机物总数近80％的那些 高沸点、热稳定性差、离子型化合物及摩尔质量大的物质。
（2）气相色谱：流动相与组分不产生相互作用力，仅起运 载作用。 高效液相色谱法：流动相对组分可产生一定亲和力，并参与 固定相对组分作用的剧烈竞争，流动相对分离起很大作用， 相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数；
高压输液泵应符合下列要求：密封性好，输出 流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速 更换溶剂及耐腐蚀。
高压输液泵
常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。 恒流泵特点是在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱 柱引起阻力变化无关； 恒压泵是指能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统阻力 而变化，故保留时间的重视性差。 目前主要使用恒流泵，又称机械泵，它又分机械注射泵和机械 往复泵两种，应用最多的是机械往复泵。
（四）检测系统
两种基本类型的检测器： 溶质型检测器：它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应， 属于这类检测器的有紫外、荧光、安培检测器等。 总体检测器：它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应， 属于这类检测器的有示差折光，电导检测器等。 （l）紫外检测器 （2）荧光检测器 （3）示差折光率检测器 （4）电化学检测器
高效液相色谱法
High Performance Liquid Chromatography，HPLC
§1
概 述
Introduction
一、高效液相色谱法概述
高效液相色谱法（HPLC）吸取了气相色谱与经典液相色谱优 点，并用现代化手段加以改进。
引入了气相色谱的理论;
在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器; 具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点;
hplc高效液相色谱
hplc高效液相色谱HPLC高效液相色谱简介高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC），也被称为液相色谱法（Liquid Chromatography），是一种广泛应用于药物分析、环境监测、食品检测等领域的分离技术。
HPLC色谱技术通过物质在液体流动相和固定相之间的相互作用，实现对分子化合物的分离、检测和定量。
相对于传统的柱层析技术，HPLC具有分离效率高、分析灵敏度高、分析速度快等特点，被广泛应用于科学研究和工业生产。
HPLC的基本原理HPLC色谱技术是建立在分配系数理论的基础上。
它通过固定填料上溶解物质与流动相中溶解物质之间的分配与再分配，实现目标化合物在固定相中的分离。
HPLC色谱法的基本步骤包括：样品制备、装柱、选择流动相、进样、洗脱分离、检测及数据处理等。
HPLC的主要组成部分HPLC主要由一系列组成部分组成，包括：溶剂输送系统、无菌进样器、色谱柱、检测器和数据处理系统等。
其中，溶剂输送系统用于控制流动相的输送速率和压力，确保流动相以一定速率通过色谱柱；无菌进样器用来将样品进样并转送到色谱柱中；色谱柱是分离目标化合物的关键组成部分，根据所分离物质的化学性质和目标要求选择合适的色谱柱；检测器用来检测溶质的浓度，并将信号转换为电信号输出；数据处理系统用来处理和分析检测到的信号，得出结果。
HPLC的种类和应用领域根据不同的分离机制和柱填料，HPLC可以分为很多不同的类型，包括：反相色谱、离子交换色谱、分子筛色谱等。
反相色谱是最常用的一种HPLC技术，其应用领域非常广泛。
例如，在药物研究领域，HPLC被广泛应用于药物分析、药代动力学研究、质量控制等方面。
在环境监测领域，HPLC被用来检测土壤和水体中的有机污染物、重金属和农药等化学物质。
在食品安全检测领域，HPLC被用来检测食品中的添加剂、农药残留和重金属等有害物质。
HPLC的发展和进展自HPLC技术在20世纪60年代首次提出以来，随着科学技术的不断发展，HPLC技术也在不断进步和改进。
高效液相色谱-HPLCppt课件.ppt
色谱法的分类
按固定相的形态分:
平面色谱 o 纸色谱
o 薄层色谱
柱色谱
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色谱法的分类示意图
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▪ 高压梯度洗脱（高压混合，高压进柱，2个 泵。）
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪安捷伦泵：小视频 ▪色谱学堂：泵
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色谱法原理及分类
什么是色谱法 色谱法溯源 Tswett（茨维特)的实验 色谱法原理 色谱法的分类
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什么是色谱法
色谱法是一种现代的分离分析方法 1906年正式命名(见诸文献) 20世纪30年代开始广泛研究和应用 高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪70年代
1. 紫外—可见光度检测器：
①固定波长：254nm ， 低压汞 灯。
② 可 调 波 长 ： 190 ～ 800mm ， 钨灯，氘灯。
UV
③光电二极管矩阵检测器： 190～700nm。
接色谱柱 石英窗 光电倍增管
废液
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hplc高效液相色谱法
HPLC高效液相色谱法简介高效液相色谱法（HPLC）是一种利用液体作为流动相，通过高压输液系统，将样品中的各组分在固定相和流动相之间进行分配或吸附等作用而实现分离和检测的色谱技术。
HPLC具有分离效率高、灵敏度高、选择性强、分析速度快、样品适用范围广等优点，已成为化学、生物、医药、环境等领域中最重要的分析方法之一。
本文将简要介绍HPLC的基本原理、仪器组成、常用的色谱模式和应用领域，以期对HPLC感兴趣的读者有所帮助。
一、HPLC的基本原理HPLC的基本原理是利用样品中的各组分在固定相和流动相之间的不同亲和力，使其在色谱柱内以不同的速度移动，从而达到分离的目的。
固定相是填充在色谱柱内的颗粒状物质，可以是固体或涂于固体载体上的液体。
流动相是通过高压泵送入色谱柱的溶剂或溶剂混合物，可以是极性或非极性的。
样品是通过进样器注入流动相中，并随流动相进入色谱柱。
当样品中的各组分经过固定相时，会发生吸附、分配、离子交换、排阻等作用，导致它们在固定相中停留不同的时间。
这个时间称为保留时间（retention time），通常用tR表示。
保留时间是反映样品组分在色谱柱内分离程度的重要参数，不同的组分有不同的保留时间。
当样品组分从色谱柱出口流出时，会被检测器检测到，并产生一个信号。
这个信号随时间变化而变化，形成一个色谱峰（chromatographic peak）。
色谱峰的位置反映了样品组分的保留时间，色谱峰的面积或高度反映了样品组分的含量或浓度。
将检测器信号随时间变化而绘制出来，就得到了一条色谱图（chromatogram）。
色谱图上可以看到不同的色谱峰，每个峰对应一个样品组分。
通过比较保留时间和色谱峰面积或高度，就可以对样品进行定性和定量分析。
二、HPLC仪器组成HPLC仪器主要由以下几个部分组成：溶剂供给系统（solvent delivery system）：负责提供恒定压力和流速的流动相，并将溶剂混合成所需比例。
20-高效液相色谱
5. 离子色谱
其分离原理与离子交换色谱原理一样， 电导检测器检测。 问题：由于流动相都是强电解质，其电导率比 待测离子约高 2 个数量级，这种强背景电导会完
全掩盖待测离子信号。
1975年Small提出，在离子交换柱之后，再串结一根
抑制柱。该柱装填与分离柱电荷完全相反的离子交 换树脂。通过分离柱后的样品再经过抑制柱，使具 有高背景电导的流动相转变为低背景电导的流动相， 从而可用电导检测器检测各种离子的含量。
在反相色谱法中，通过调节流动相的pH，抑制样品组 分的解离，增加它在固定相中的溶解度，以达到分离 有机弱酸、弱碱的目的，称为离子抑制色谱法（ISC）
（1）适用范围 弱酸 3.0≤pKa≤ 7.0 弱碱 7.0≤pKa≤ 8.0
（2）抑制剂 弱酸（乙酸）、弱碱（氨水）或缓冲盐 （3）影响k的因素 a．与流动相的极性有关（同反相色谱） b．与流动相pH有关：弱酸 pH≤pKa k↑， tR↑ 弱碱 反之
由苯乙烯与二乙烯苯交联而成
21
20.4.2 化学键合相
化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相； 一般的键合相用硅胶为载体： a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C (ODS）
1. 非极性键合相 键合相表面基团为非极性烃基， 如C18 、C8、 C1 和苯基等。一般用于反相色谱
33
选择流动相时应注意的几个问题
（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累 积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。 （2）使用前需要用微孔滤膜过滤，除去固体颗粒。
（3）流动相使用前最好脱气。
34
20.6 高效液相色谱仪
35
记录系统
输液系统
高效液相色谱
高效液相色谱高效液相色谱，又称高压液相色谱（HPLC，High Performance Liquid Chromatography），是一种重要的色谱技术，广泛应用于药物分析、食品安全检测、环境监测等领域。
相较于传统液相色谱，高效液相色谱具有分离效果好、分析速度快、灵敏度高等优势，因此成为现代分析实验的核心技术之一。
高效液相色谱的原理基于物质在不同相互作用力下的差异，通过样品在固定相上的分配行为，实现对不同成分的分离和分析。
其核心部分是色谱柱，包括固定相、流动相和样品分子。
其中，固定相是一种特定的固体或液体材料，具有一定的孔隙结构和表面特性，用于捕获和分离样品成分。
流动相则由溶剂组成，可以通过与固定相的相互作用调节分离效果。
而样品分子则根据其在固定相上的亲疏性，相继被吸附、扩散和解吸，最终实现分离。
高效液相色谱的分离过程包括样品进样、柱温控制、流速调节等步骤，每个步骤都需要严格控制，以保证分离效果和结果准确性。
在样品进样之前，通常需要采用样品前处理方法，如固相萃取、溶剂萃取等，以去除杂质和提高分析物的浓度。
然后，样品通过进样器进入色谱柱，通过控制流速和柱温，使样品成分在固定相上发生分配行为，从而实现分离。
最后，通过采集柱洗脱出来的物质，并通过检测器检测其浓度变化，得到分析结果。
高效液相色谱的关键是选择适当的固定相和流动相。
不同的样品性质和分析要求需要选择不同的固定相。
常见的固定相包括疏水相、离子交换相、亲水相等。
此外，流动相的选择也非常重要，常见的流动相溶剂有水、有机溶剂（如甲醇、乙腈）等。
合理选择固定相和流动相能提高分离效果，提高检测灵敏度。
高效液相色谱有多种检测器可供选择，常用的有紫外-可见光谱检测器（UV-Vis）、荧光检测器、质谱检测器等。
通过检测器的信号，可以得到样品的浓度信息，从而进行定量分析。
高效液相色谱在药物分析中的应用广泛。
例如，针对不同药物的检测需求，可以选择不同的色谱柱和流动相，在合适的检测器下进行分析。
高效液相色谱法(HPLC)
高效液相色谱法(HPLC) High Performance LiquidChromatography§3-1 高效液相色谱法概述一、定义以高压输出液体为流动相，以小粒径填料填充色谱柱的色谱分析方法。
高效液相色谱法是继气相色谱之后，70年代初期发展起来的一种以液体做流动相的新色谱技术.二、HPLC特点1、高压经典的液相色谱法，流动相在常压下输送，所用的固定相柱效低，分析周期长。
而现代液相色谱法中，流动相改为高压输送（150～350 ⨯105 Pa，最高输送压力可达450⨯105 Pa）;2、高速由于流动相流速高，分析时间大大缩短，几min、十几min可完成一个分析任务。
3、高效HPLC色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）。
4、高灵敏度利用高灵敏度的检测器，检测灵敏度大大提高。
紫外检测器10-9g荧光检测器10-11g高效液相色谱三、液相色谱分离原理及分类液相色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶剂（即流动相或洗脱液）以及固定相分子间的作用，作用力的大小，决定色谱过程的保留行为。
根据分离机制不同，液相色谱可分为：液固吸附色谱、液液分配色谱、化学键合相色谱、离子交换色谱以及分子排阻色谱等类型。
四、液相色谱与气相色谱的比较1、相同点（1）基本原理一致：不同组分在两相中的作用力不同。
（2）基本概念一致：基本概念：保留值、塔板数、塔板高度、分离度、选择性等与气相色谱一致。
（3）基本理论一致：塔板理论与速率方程也与气相色谱基本一致。
2、不同点由于在液相色谱中以液体代替气相色谱中的气体作为流动相，而液体和气体的有性质本质不同，因此，两种方法也有不同之处：（1）仪器设备和操作条件不同；（2）应用范围不同；气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不分解的物质。
对高沸点化合物、非挥发性物质、热不稳定化合物、离子型化合物及高聚物的分离、分析较为困难。
高效液相色谱HPLC基本原理
色谱柱的温度控制：优化色谱柱的 温度提高分离效率
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色谱柱的维护：定期清洗和维护色 谱柱保证其性能稳定
色谱柱的填充：优化色谱柱的填充 方式提高分离效果
流动相的组成：有机溶剂和水
流动相的选择原则：根据样品性质和检测器类型选择
流动相的优化方法：通过改变有机溶剂和水的比例、改变有机溶剂的种类、改变有机 溶剂的浓度等方法进行优化
流动相的优化效果：提高分离效果、提高检测灵敏度、降低检测时间等
固定相的选择： 根据样品性质 和分离要求选 择合适的固定
相
固定相的粒径： 粒径越小分离 效果越好但会 增加压力和延
长分析时间
固定相的表面 处理：表面处 理可以提高固 定相的稳定性
和选择性
固定相的填充： 填充方式会影 响柱效和分离 效果常用的填 充方式有轴向 填充、径向填 充和螺旋填充
汇报人：
智能化：I技术在HPLC中的应用提 高分析效率和准确性
高通量：高通量HPLC技术的发展提 高分析速度和通量
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微型绿色环保：环保型HPLC技术的发展 降低对环境的影响和污染
气相色谱-质 谱联用：提高 检测灵敏度和
准确性
样品采集：选择合适的样品采 集方法如抽样、取样等
样品预处理：对样品进行预处 理如过滤、离心、稀释等
样品保存：选择合适的样品保 存方法如冷藏、冷冻等
样品分析：对样品进行分析如 定性、定量等
进样器选择：根据样品性质 和实验要求选择合适的进样 器
样品准备：选择合适的样品 进行适当的处理和稀释
进样操作：将样品注入进样 器确保样品完全进入色谱柱
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（一）高效液相基础知识
高志国
（2017.03.29）
高效液相色谱基础知识
色谱法原理与分类
HPLC的组成
HPLC的应用 HPLC色谱图名词术语 HPLC定量分析原理
色谱法原理及分类
什么是色谱法 色谱法溯源 Tswett（茨维特)的实验 色谱法原理 色谱法的分类
什么是色谱法
色谱法是一种现代的分离分析方法 1906年正式命名(见诸文献) 20世纪30年代开始广泛研究和应用 高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪70年代
色谱法(Chromatography)溯源
100多年前俄国植物学家Tswett(茨维特)分离植物色 素时采用的实验方法 他将植物色素的石油醚提取液倒入装有碳酸钙的直 立玻璃管,再加入石油醚使其自由流下,结果色素中 各组份互相分离形成各种不同颜色的谱带 Tswett用希腊语chroma(色)和graphos(谱)描述他的 实验方法，即现在的 Chromatography(色谱法)
适用：高沸点、热不稳定有机及生化 试样的高效分离
液相色谱法的分类
按流动相和固定相的相对极性分:
正相色谱(Normal Phase Chromatography)
o 固定相的极性大于流动相 反相色谱(Reversed Phase Chromatography) o 固定相的极性小于流动相 有机化合物的极性
分子间作用力(静电引力,偶分子间作用力(静电引力,偶极力,色散 力,氢键力)综合表现的一种表述
有机化合物极性示例
液相色谱法的分类
按分离过程的机理分:
1 吸附色谱(Absorption Chromatography)
根据样品组分对活性固定相表面吸附亲和力的不同实现分离 2 分配色谱(Partition Chromatography) 分离基于样品组分在固定相和流动相中的溶解度(分配系数)不同 3 离子交换色谱(Ion Exchange Chromatography) 根据样品组份离子交换亲和力的差异分离,简称离子色谱(IC) 4 体积排除色谱(Size Exclusion Chromatography) GPC(Gel Permeation Chromatography) • 固定相是疏水性凝胶,流动相是有机溶剂 GFC(Gel Filtration Chromatography) • 固定相是亲水性凝胶,流动相是水溶液
Tswett（茨维特)的实验
一根长玻璃管填充碳酸钙的颗粒
将碾碎之植物叶片的提取液灌入柱中
随着石油醚提取液向下流过柱子，现出展宽的色带 分离出不同的化合物 Chromato -- 颜色 Graphy -- 图象
色谱法原理
是利用混合物中各组份在不同的两相中溶解,分配,吸 附等化学作用性能的差异,当两相作相对运动时,使各 组分在两相中反复多次受到上述各作用力而达到相 互分离 两相中有一相是固定的,叫作固定相(Stationary Phase) 有一相是流动的,称为流动相(Mobile Phase),流动相 又叫洗脱剂,溶剂
HPLC的组成
由五大部分组成：： 溶剂输送系统（贮液器，高压泵） 进样系统（进样阀等） 分离系统（色谱柱等） 检测系统（检测器等）
记录及数据处理系统
1. 高压输液泵
为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液体 的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速 是高效液相色谱的特点之一 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性
安捷伦泵：小视频
色谱学堂：泵
在线脱气机
高效液相色谱仪流动相脱气的目的 1、使色谱泵输液均匀准确，减小脉动。 2、提高保留时间和色谱峰面积的重现性。 3、防止气泡引起尖峰。 4、使基线稳定，提高信噪比。 5、降低溶剂的紫外吸收本底。 6、减少死体积。 7、防止填料氧化。 视频 ：脱气目的 语,特指在某一系统中,具有相同成 分及相同物理、化学性质的均匀物质部分。各相 之间有明显可分的界面
色谱分离原理
色谱法的分类
按流动相的物态分: 气相色谱 (Gas Chromatography, GC) 用气体作为流动相(又叫载气) 液相色谱 (Liquid Chromatography, LC) 用液体作为流动相(又叫洗脱剂)
色谱法的分类
按固定相的形态分: 平面色谱 o 纸色谱 o 薄层色谱 柱色谱
色谱法的分类示意图
什么是HPLC？
高效液相色谱法 –HPLC(High Performance Liquid Chromatography ) –是一种区别于经典液相色谱,基于仪器方法的 高效能分离手段: o High 高 o Performance 性能 o Liquid 液体的 o Performance 色谱
高压输液泵： 恒压泵（流量随阻力变化重现性差）
恒流泵（多用）：往复式
注射式
作用：将流动相在高压下连续不断地送入液路系统。 性能：①有足够的压力 ②输出流量恒定，可调 ③输出压力平稳 ④泵室体积小 ⑤泵体抗腐蚀、耐酸
梯度洗脱装置
作用：将两种或两种以上溶剂按一定程序连续 改变配比，以改变流动相极性、离子强度、 PH值、提高分离效率。 低压梯度洗脱（常压混合，高压进柱， 1 个 泵。） 高压梯度洗脱（高压混合，高压进柱， 2 个 泵。）
2. 进样装置
进样视频：安捷伦 进样视频：岛津
3. 分离系统
包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。 色谱柱一般用内部抛光的不锈钢制成。其内径为2 ~ 6mm， 柱长为10 ~50cm，柱形多为直形，内部充满3～10 mm高效微 粒固定相。柱温一般为室温或接近室温
HPLC特点
特点：高压、高效、高速、高灵敏度 1. 高效分离 ： n =105 /米 2. 高速 ：使用高压泵，出峰时间几分钟到几十分钟 3. 高灵敏度 ：检测下限：10-9-10-13g（最小检测量） 4. 自动化程度高：仪器分析、电脑控制、色谱工作站 5. 应用范围广 ：可测有机物75%-80%