医学分子生物学21Nov基因操作1(10分子生物学)精品PPT课件
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分子生物学的核心技术 克隆和重组结合的一种技术
26
基源自文库克隆的条件
目的基因---- 研究的基因 克隆载体---- 能携带目的基因在宿主细胞内
进行扩增或表达的DNA分子 DNA连接酶 宿主细胞
27
基因克隆载体 复制子---能在宿主细胞内携带目的基因复 制扩增 一个或多个单一限制性内砌酶位点---可使 目的基因插入到载体DNA分子中 有筛选标志，用于重组子的筛选 表达载体，还需能使目的基因表达的转录 单位
19
标准的RT-PCR程序包括 提取细胞总mRNA mRNA反转录为cDNA cDNA的PCR扩增
20
➢RT-PCR的基本原理和操作程序
21
三、从基因文库中获取基因
基因组文库或cDNA文库中获取基因
基因组文库----含有某中生物体全部基因片段的 重组DNA克隆群体
cDNA文库----以mRNA为模板，逆转录合成 cDNA，然后重组得到含有一个细胞全部mRNA 信息的克隆群体
已知目的基因片段序列（两侧序列） 引物的基本长度 与模板的匹配程度 一定比例的GC含量 合适的末端连接序列 引物自身的二级结构特点
18
二、用反转录PCR技术获取基因
➢RT-PCR
RT-PCR是一种直接以mRNA为模板，先 通过反转录过程制备cDNA；然后再以cDNA 为模板进行PCR扩增合成目的基因的技术。
只改变DNA的二级结构，不改变它的核苷酸排列 顺序
3
➢变性后理化性质变化
增色效应(hyperchromic effet)
• 内部的碱基暴露，OD260 值大大增加，并与解链程 度有一定比例关系
DNA的紫外吸收光谱 1. 天然DNA 2. 变性DNA
3. 核苷酸总吸光度值
4
解链曲线 • 如果缓慢加热DNA溶液，
8
这种杂化双链可以在不同的DNA-DNA、DNARNA或RNA-RNA分子间形成，这种现象称为 核酸分子杂交
复性
RNA
DNA
9
10
第二节 基因操作技术
基因的获取
PCR
PCR（聚合酶链反应）----体外基因扩增的一种 方法，是体外有引物介导的特定DNA序列的酶扩 增反应
基础是DNA的半保留复制和DNA聚合酶的特点
并在不同温度测定其A260 (OD260)值，可得到“S”形 DNA解链曲线 • DNA变性作用是在一个相 当窄的温度范围内完成的
5
Tm(melting temperature)----溶解温度 • 加热变性时DNA溶液A260升高达到最大值一半
时的温度称为该DNA的融解温度(Tm) • Tm值与DNA分子中GC含量成正比，与DNA的
5
5
5
Cycle 1
Primer 1 5 Primer 2
5 5
5 5
5 5
5 5
Cycle 2
5 5
5 5
14
5 5
5 5
Cycle 3
5
5
5
5
5
5
5
5
5 5
5 5
25～30 次循环后，模板DNA的含 量可以扩大100万倍以上。
15
16
➢通过PCR技术实现特定长度DNA片段的扩增
17
PCR反应的条件
基因操作
DNA 或者RNA操作的技术 基因工程和基因工程相关的技术
1
一、核酸的一般理化特性
酸性 黏度大 机械力的作用下易断裂 240～290nm的紫外波段有强烈吸收：OD260
2
二、核酸分子杂交的原理是DNA的变性与复性
➢DNA变性(denaturation)
在某些理化因素(温度、pH、离子强度等)作用下， DNA双链互补碱基对间氢键断裂，使DNA双螺旋 结构松散，成为单链的现象称为变性
28
载体的分类
29
➢基因工程常用载体
30
基本过程
酶切目的基因和载体，使之形成相同的粘性末端 DNA连接酶连接基因和载体，形成重组分子 重组分子导入宿主细胞，进行复制扩增 筛选及克隆化，获得克隆基因
31
32
第四节 克隆基因的表达
原核表达载体系统
宿主细胞 ---- 大肠杆菌 载体必须具备原核生物表达的调控序列
镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析
MstⅡ酶切位点
﹣
(GCTNAGG)
1.35kb
5´ 1.15kb
正常基因
3´ 1.15kb
物进行加工,从而能得到具有活性的表达产物
34
第五节 基因结构分析 基因的一级结构分析
直接分析基因的一级结构 经典的双脱氧末端终止法---- DNA的测序
36
37
DNA 自动测序
38
间接法分析DNA一级结构 通过基因扩增、酶切片断等来比较基因的片 断的大小
39
限制性内切酶谱分析法
12
一、用PCR技术获取基因
➢PCR(聚合酶链式反应)技术
以模板链为模板，根 据碱基配对原则，Taq DNA聚合酶从每个引 物的3’端开始合成一条 新链。
延伸 72℃
变性 94℃
30
高温破坏DNA双螺旋 结构，解离成单链。
两个引物分别 和模板互补。
退火 Tm－5℃
13
➢PCR的基本反应步骤
模板DNA
22
23
四、人工合成基因 ➢用PCR技术人工合成DNA片段
24
第三节 基因的克隆 基因克隆（DNA克隆）
把一个生物体的遗传信息（基因片段）通过 无性繁殖转入另一个生物体的过程。从而得 到一群完全相同的基因片段
25
基因重组
将不同基因片段连接起来构成一个新的 DNA分子过程
基因重组技术
启动子、终止子、核蛋白结合位点等 影响因素----启动子的强弱、RNA翻译的效率、
密码子的选择、表达产物的大小、稳定等
真核表达系统
宿主细胞----酵母、昆虫、哺乳类细胞等 条件----真核表达的调控序列（大多来自病毒载
体） 穿梭载体 ---- 可以在原核中复制和扩增,在真核
细胞中表达 优点 ---- 具有表达后的修饰系统,可以对表达产
分子大小也成正比
6
➢复性(renaturation)
变性DNA在适当条件下，两条互补链可重新配对， 恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性
热变性的DNA经缓慢冷却后复性称为退火 (annealing)
7
➢核酸分子杂交
DNA变性后在复性过程中，如果把不同种类的DNA 单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要两种单 链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适 宜的条件(温度及离子强度)下，就可以在不同的分 子间形成杂化双链
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基源自文库克隆的条件
目的基因---- 研究的基因 克隆载体---- 能携带目的基因在宿主细胞内
进行扩增或表达的DNA分子 DNA连接酶 宿主细胞
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基因克隆载体 复制子---能在宿主细胞内携带目的基因复 制扩增 一个或多个单一限制性内砌酶位点---可使 目的基因插入到载体DNA分子中 有筛选标志，用于重组子的筛选 表达载体，还需能使目的基因表达的转录 单位
19
标准的RT-PCR程序包括 提取细胞总mRNA mRNA反转录为cDNA cDNA的PCR扩增
20
➢RT-PCR的基本原理和操作程序
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三、从基因文库中获取基因
基因组文库或cDNA文库中获取基因
基因组文库----含有某中生物体全部基因片段的 重组DNA克隆群体
cDNA文库----以mRNA为模板，逆转录合成 cDNA，然后重组得到含有一个细胞全部mRNA 信息的克隆群体
已知目的基因片段序列（两侧序列） 引物的基本长度 与模板的匹配程度 一定比例的GC含量 合适的末端连接序列 引物自身的二级结构特点
18
二、用反转录PCR技术获取基因
➢RT-PCR
RT-PCR是一种直接以mRNA为模板，先 通过反转录过程制备cDNA；然后再以cDNA 为模板进行PCR扩增合成目的基因的技术。
只改变DNA的二级结构，不改变它的核苷酸排列 顺序
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➢变性后理化性质变化
增色效应(hyperchromic effet)
• 内部的碱基暴露，OD260 值大大增加，并与解链程 度有一定比例关系
DNA的紫外吸收光谱 1. 天然DNA 2. 变性DNA
3. 核苷酸总吸光度值
4
解链曲线 • 如果缓慢加热DNA溶液，
8
这种杂化双链可以在不同的DNA-DNA、DNARNA或RNA-RNA分子间形成，这种现象称为 核酸分子杂交
复性
RNA
DNA
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第二节 基因操作技术
基因的获取
PCR
PCR（聚合酶链反应）----体外基因扩增的一种 方法，是体外有引物介导的特定DNA序列的酶扩 增反应
基础是DNA的半保留复制和DNA聚合酶的特点
并在不同温度测定其A260 (OD260)值，可得到“S”形 DNA解链曲线 • DNA变性作用是在一个相 当窄的温度范围内完成的
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Tm(melting temperature)----溶解温度 • 加热变性时DNA溶液A260升高达到最大值一半
时的温度称为该DNA的融解温度(Tm) • Tm值与DNA分子中GC含量成正比，与DNA的
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Cycle 1
Primer 1 5 Primer 2
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Cycle 2
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Cycle 3
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25～30 次循环后，模板DNA的含 量可以扩大100万倍以上。
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➢通过PCR技术实现特定长度DNA片段的扩增
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PCR反应的条件
基因操作
DNA 或者RNA操作的技术 基因工程和基因工程相关的技术
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一、核酸的一般理化特性
酸性 黏度大 机械力的作用下易断裂 240～290nm的紫外波段有强烈吸收：OD260
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二、核酸分子杂交的原理是DNA的变性与复性
➢DNA变性(denaturation)
在某些理化因素(温度、pH、离子强度等)作用下， DNA双链互补碱基对间氢键断裂，使DNA双螺旋 结构松散，成为单链的现象称为变性
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载体的分类
29
➢基因工程常用载体
30
基本过程
酶切目的基因和载体，使之形成相同的粘性末端 DNA连接酶连接基因和载体，形成重组分子 重组分子导入宿主细胞，进行复制扩增 筛选及克隆化，获得克隆基因
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第四节 克隆基因的表达
原核表达载体系统
宿主细胞 ---- 大肠杆菌 载体必须具备原核生物表达的调控序列
镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析
MstⅡ酶切位点
﹣
(GCTNAGG)
1.35kb
5´ 1.15kb
正常基因
3´ 1.15kb
物进行加工,从而能得到具有活性的表达产物
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第五节 基因结构分析 基因的一级结构分析
直接分析基因的一级结构 经典的双脱氧末端终止法---- DNA的测序
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DNA 自动测序
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间接法分析DNA一级结构 通过基因扩增、酶切片断等来比较基因的片 断的大小
39
限制性内切酶谱分析法
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一、用PCR技术获取基因
➢PCR(聚合酶链式反应)技术
以模板链为模板，根 据碱基配对原则，Taq DNA聚合酶从每个引 物的3’端开始合成一条 新链。
延伸 72℃
变性 94℃
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高温破坏DNA双螺旋 结构，解离成单链。
两个引物分别 和模板互补。
退火 Tm－5℃
13
➢PCR的基本反应步骤
模板DNA
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四、人工合成基因 ➢用PCR技术人工合成DNA片段
24
第三节 基因的克隆 基因克隆（DNA克隆）
把一个生物体的遗传信息（基因片段）通过 无性繁殖转入另一个生物体的过程。从而得 到一群完全相同的基因片段
25
基因重组
将不同基因片段连接起来构成一个新的 DNA分子过程
基因重组技术
启动子、终止子、核蛋白结合位点等 影响因素----启动子的强弱、RNA翻译的效率、
密码子的选择、表达产物的大小、稳定等
真核表达系统
宿主细胞----酵母、昆虫、哺乳类细胞等 条件----真核表达的调控序列（大多来自病毒载
体） 穿梭载体 ---- 可以在原核中复制和扩增,在真核
细胞中表达 优点 ---- 具有表达后的修饰系统,可以对表达产
分子大小也成正比
6
➢复性(renaturation)
变性DNA在适当条件下，两条互补链可重新配对， 恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性
热变性的DNA经缓慢冷却后复性称为退火 (annealing)
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➢核酸分子杂交
DNA变性后在复性过程中，如果把不同种类的DNA 单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要两种单 链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适 宜的条件(温度及离子强度)下，就可以在不同的分 子间形成杂化双链