酶在生物技术领域的应用解析PPT课件
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这是一类以脱氧核糖核酸(DNA)分子末端开始逐个除去末端核 苷酸的酶。这些酶中有些可以从DNA链的5‘-末端开始作用，有 些从3’-末端开始作用，有些则可同时作用于5‘-末端和3’-末端。 它们的作用方式如图所示。
2020年9月28日
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③碱性磷酸酶
碱性磷酸酶可以除去DNA或 RNA链中的5＇-磷酸。在基因 工程中主要用在为防止质粒 DNA的自我环化而除去5＇-磷 酸，或在用32P对DNA或RNA 进行5＇-末端标记之前除去 5＇-磷酸。
利用酶除去细胞壁，除了要根 据细胞的结构特点选用适宜的酶 之外，还必须控制好酶作用条件 和时间。此外，若用酶除去细胞 壁以制备原生质体时，必须在反 应系统中添加渗透压稳定剂，维 持高渗状态而使制备得到的原生 质体不致破裂。
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二、酶在大分子切割方面的应用
生物工程经常与生物大分子打交道。 在许多情况下需要把大分子切割成较小的 分子或片断，以便在生物工程的有关领域 使用。在生物大分子的切割过程中往往要 求在特定的位点上进行，这就只能借助于 具有专一性的各种水解酶或其他酶类才能 做到
微生物和植物细胞的许多物质，如胞内酶、胰岛素及干扰素等 基因工程菌的产物，天然抗氧化剂等植物细胞次级代谢产物 都存在于细胞内。为了将这些细胞内物质提取出来,很多时候 都需要将细胞壁破坏或除去。
原生质体的制备
在制备原生质体或提取胞内某些稳定性较差的活性物质时,既要 除去细胞壁,又要不损伤其他成分。这样就不能采用激烈的破 碎方法,而只能利用各种具有专一性的酶。
酶的应用 ——生物技术领域
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生物技术又称生物工程，主要包括基因工程、 细胞工程、酶工程和发酵工程等四个方面的内 容，这些内容都是以生物体及其代谢产物为主 要研究对象。酶是生物催化剂，在生物体及其 代谢过程中是必不可少的。现在介绍酶在细胞 工程和基因工程中起着关键性作用的几个方面 的应用情况。
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酶在生物技术领域的应用主要有三种：
I. 用酶除去细胞壁 II.用酶进行大分子切割 III.用酶进行分子拼接
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一、酶在除去细胞壁方面的应用
微生物细胞和植物细胞的表层都有细胞壁。细胞壁对 微生物和植物维持其细胞的形状和结构起着重要作 用，可保护细胞遭外界因素的破坏。但在生物工程 方面，很多时候都需要除去细胞壁。 例如：胞内物质的提取
2020年9Baidu Nhomakorabea28日
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根据不同细胞的结构和细胞壁组分的不同, 除去细胞壁时所采用的酶也有所区别。
①除去细菌细胞壁 细菌的细胞壁主要成分是肽多糖。
革兰氏阴性细菌的细胞壁除了肽多糖 以外，还有一层脂多糖。
除去革兰氏阳性细菌的细胞壁是采 用从蛋清中分离得到的溶菌酶。该酶 专一地作用于细菌细胞壁的肽多糖分 子中N-乙酰胞壁酸与N-乙酰氨基葡萄 糖之间的α-1，4-键。而对于革兰氏阴 性菌需由溶菌酶和EDTA共同作用才能 达到较好地除去细胞壁的效果。这是 由于EDTA可作用于脂多糖的缘故。
②除去酵母细胞壁 酵母的细胞壁分为两层，外层由磷酸
甘露糖和蛋白质组成，内层由β-葡聚糖构 成细胞壁的骨架。
除去酵母细胞壁主要采用β-1，3-葡聚 糖酶。该酶作用于细胞壁内层的β-葡聚糖 分子中β-1，3-糖苷键，使作为细胞壁骨架 的β-葡聚糖水解，而使细胞壁破坏。由于 蜗牛的消化液中含有较多的β-1，3-葡聚糖 酶，故常用于酵母的破壁。此外，若β-葡 聚糖酶与磷酸甘露糖酶及蛋白酶联合作用， 则可使细胞壁的内外两层同时被破坏，而 显著提高破壁效果。
2）Asu I酶识别顺序有5个核苷酸，作用后产生黏性末端：
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②DNA外切核酸酶
DNA外切核酸酶在基因工程中用于载体或基因片段的切割加 工。当获得的基因载体或基因片段太大时，可利用DNA外切酶 从两条链的末端各除去若干个核苷酸，而使DNA片段变小一些, 以满足使用的需要;当获得的DNA片段为平整末端时,为使它变成 粘性末端,可以采用从5′端或3′端作用的DNA外切酶,以获得所 需的带有粘性末端的DNA片段,以利于体外重组DNA。该酶还可 从DNA生产脱氧核苷酸
米曲霉、黑曲霉和青霉等半知菌纲 霉菌的细胞壁的主要组分是几丁质和 β-葡聚糖等。破壁时主要使用β-1，3葡聚糖酶和几丁质酶的混合物。
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④植物细胞壁的破除 植物细胞壁主要由纤维素、半
纤维素、木质素和果胶等组成。 破除植物细胞壁主要采用纤维素 酶、半纤维素酶和果胶酶组成的 混合酶。这几种酶大多数是由霉 菌发酵产生。
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③除去霉菌细胞壁 毛霉、根霉等藻菌纲霉菌的细胞壁
主要由几丁质(N-乙酰-D-氨基葡萄糖以 β-1，4-键结合而成)和壳多糖(氨基葡 萄糖以β-1，4键结合而成)等多种物质 组成。破壁时主要采用放线菌或细菌 产生的壳多糖酶、几丁质酶及蛋白酶 等多种酶的混合物。这些混合多酶制 剂一般称之为细胞壁溶解酶 。
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⑤自我剪切酶
自我剪切酶(self-cleavage ribozyme)是一类催化本身 RNA分子进行剪切反应的核酸类酶。具有自我剪切功 能的R酶RNA的前体。它可以在一定条件下催化本身 RNA进行剪切反应，使RNA前体生成成熟的RNA分子 和另一个RNA片段。 1984年，阿比利安(Apirion)发现T4噬菌体RNA前体 可以进行自我剪切，将含有215个核苷酸(nt)的前体剪 切成为含139个核苷酸的成熟RNA和另一个76核苷酸的 片段。 已发现的具有自我剪切功能的R酶越来越多，通 过自我剪切酶对自身RNA的剪切作用，可以获得各种 所需的RNA或多聚核苷酸。
碱性磷酸酶还可以用于水解 核苷酸生成核苷，并在酶标免 疫测定方面应用。
④核酸酶S1
该酶作用于单链DNA或 RNA。在基因工程中，用 于从具有单链末端的DNA 分子中除去单链部分的核 苷酸，而变成平整末端的 双链DNA。在以mRNA为 模板，合成互补DNA (cDNA)时，往往会发生 “发夹状环”，用核酸酶 S，就可使这些“发夹状 环”除去。
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①限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶在基因工程中用以从双链DNA 分子中切取所需的基因，并用同一种酶将质粒DNA或 噬菌体DNA切开,以便进行DNA的体外重组。在应用时 可根据需要选用适宜的限制性核酸内切酶。
如： 1）Alu I酶识别顺序有4个碱基，作用位点在识别顺序内(箭头 表示切点位置)，作用后产生平整末端：
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③碱性磷酸酶
碱性磷酸酶可以除去DNA或 RNA链中的5＇-磷酸。在基因 工程中主要用在为防止质粒 DNA的自我环化而除去5＇-磷 酸，或在用32P对DNA或RNA 进行5＇-末端标记之前除去 5＇-磷酸。
利用酶除去细胞壁，除了要根 据细胞的结构特点选用适宜的酶 之外，还必须控制好酶作用条件 和时间。此外，若用酶除去细胞 壁以制备原生质体时，必须在反 应系统中添加渗透压稳定剂，维 持高渗状态而使制备得到的原生 质体不致破裂。
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二、酶在大分子切割方面的应用
生物工程经常与生物大分子打交道。 在许多情况下需要把大分子切割成较小的 分子或片断，以便在生物工程的有关领域 使用。在生物大分子的切割过程中往往要 求在特定的位点上进行，这就只能借助于 具有专一性的各种水解酶或其他酶类才能 做到
微生物和植物细胞的许多物质，如胞内酶、胰岛素及干扰素等 基因工程菌的产物，天然抗氧化剂等植物细胞次级代谢产物 都存在于细胞内。为了将这些细胞内物质提取出来,很多时候 都需要将细胞壁破坏或除去。
原生质体的制备
在制备原生质体或提取胞内某些稳定性较差的活性物质时,既要 除去细胞壁,又要不损伤其他成分。这样就不能采用激烈的破 碎方法,而只能利用各种具有专一性的酶。
酶的应用 ——生物技术领域
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生物技术又称生物工程，主要包括基因工程、 细胞工程、酶工程和发酵工程等四个方面的内 容，这些内容都是以生物体及其代谢产物为主 要研究对象。酶是生物催化剂，在生物体及其 代谢过程中是必不可少的。现在介绍酶在细胞 工程和基因工程中起着关键性作用的几个方面 的应用情况。
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酶在生物技术领域的应用主要有三种：
I. 用酶除去细胞壁 II.用酶进行大分子切割 III.用酶进行分子拼接
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一、酶在除去细胞壁方面的应用
微生物细胞和植物细胞的表层都有细胞壁。细胞壁对 微生物和植物维持其细胞的形状和结构起着重要作 用，可保护细胞遭外界因素的破坏。但在生物工程 方面，很多时候都需要除去细胞壁。 例如：胞内物质的提取
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根据不同细胞的结构和细胞壁组分的不同, 除去细胞壁时所采用的酶也有所区别。
①除去细菌细胞壁 细菌的细胞壁主要成分是肽多糖。
革兰氏阴性细菌的细胞壁除了肽多糖 以外，还有一层脂多糖。
除去革兰氏阳性细菌的细胞壁是采 用从蛋清中分离得到的溶菌酶。该酶 专一地作用于细菌细胞壁的肽多糖分 子中N-乙酰胞壁酸与N-乙酰氨基葡萄 糖之间的α-1，4-键。而对于革兰氏阴 性菌需由溶菌酶和EDTA共同作用才能 达到较好地除去细胞壁的效果。这是 由于EDTA可作用于脂多糖的缘故。
②除去酵母细胞壁 酵母的细胞壁分为两层，外层由磷酸
甘露糖和蛋白质组成，内层由β-葡聚糖构 成细胞壁的骨架。
除去酵母细胞壁主要采用β-1，3-葡聚 糖酶。该酶作用于细胞壁内层的β-葡聚糖 分子中β-1，3-糖苷键，使作为细胞壁骨架 的β-葡聚糖水解，而使细胞壁破坏。由于 蜗牛的消化液中含有较多的β-1，3-葡聚糖 酶，故常用于酵母的破壁。此外，若β-葡 聚糖酶与磷酸甘露糖酶及蛋白酶联合作用， 则可使细胞壁的内外两层同时被破坏，而 显著提高破壁效果。
2）Asu I酶识别顺序有5个核苷酸，作用后产生黏性末端：
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②DNA外切核酸酶
DNA外切核酸酶在基因工程中用于载体或基因片段的切割加 工。当获得的基因载体或基因片段太大时，可利用DNA外切酶 从两条链的末端各除去若干个核苷酸，而使DNA片段变小一些, 以满足使用的需要;当获得的DNA片段为平整末端时,为使它变成 粘性末端,可以采用从5′端或3′端作用的DNA外切酶,以获得所 需的带有粘性末端的DNA片段,以利于体外重组DNA。该酶还可 从DNA生产脱氧核苷酸
米曲霉、黑曲霉和青霉等半知菌纲 霉菌的细胞壁的主要组分是几丁质和 β-葡聚糖等。破壁时主要使用β-1，3葡聚糖酶和几丁质酶的混合物。
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④植物细胞壁的破除 植物细胞壁主要由纤维素、半
纤维素、木质素和果胶等组成。 破除植物细胞壁主要采用纤维素 酶、半纤维素酶和果胶酶组成的 混合酶。这几种酶大多数是由霉 菌发酵产生。
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③除去霉菌细胞壁 毛霉、根霉等藻菌纲霉菌的细胞壁
主要由几丁质(N-乙酰-D-氨基葡萄糖以 β-1，4-键结合而成)和壳多糖(氨基葡 萄糖以β-1，4键结合而成)等多种物质 组成。破壁时主要采用放线菌或细菌 产生的壳多糖酶、几丁质酶及蛋白酶 等多种酶的混合物。这些混合多酶制 剂一般称之为细胞壁溶解酶 。
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⑤自我剪切酶
自我剪切酶(self-cleavage ribozyme)是一类催化本身 RNA分子进行剪切反应的核酸类酶。具有自我剪切功 能的R酶RNA的前体。它可以在一定条件下催化本身 RNA进行剪切反应，使RNA前体生成成熟的RNA分子 和另一个RNA片段。 1984年，阿比利安(Apirion)发现T4噬菌体RNA前体 可以进行自我剪切，将含有215个核苷酸(nt)的前体剪 切成为含139个核苷酸的成熟RNA和另一个76核苷酸的 片段。 已发现的具有自我剪切功能的R酶越来越多，通 过自我剪切酶对自身RNA的剪切作用，可以获得各种 所需的RNA或多聚核苷酸。
碱性磷酸酶还可以用于水解 核苷酸生成核苷，并在酶标免 疫测定方面应用。
④核酸酶S1
该酶作用于单链DNA或 RNA。在基因工程中，用 于从具有单链末端的DNA 分子中除去单链部分的核 苷酸，而变成平整末端的 双链DNA。在以mRNA为 模板，合成互补DNA (cDNA)时，往往会发生 “发夹状环”，用核酸酶 S，就可使这些“发夹状 环”除去。
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①限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶在基因工程中用以从双链DNA 分子中切取所需的基因，并用同一种酶将质粒DNA或 噬菌体DNA切开,以便进行DNA的体外重组。在应用时 可根据需要选用适宜的限制性核酸内切酶。
如： 1）Alu I酶识别顺序有4个碱基，作用位点在识别顺序内(箭头 表示切点位置)，作用后产生平整末端：