质粒DNA提取方法与原理
质粒DNA的提取
质粒DNA的提取一、原理采用碱变性发抽提取质粒DNA。
该法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性预复性的差异而达到分离目的的。
在PH大于12的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开变性。
质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当以pH5.2的乙酸钠高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，保存在溶液中。
而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。
通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
二、方法1.挑取一环在LB固体培养基平板上生长的含PUC57质粒的大肠杆菌，接在含有100μg/ml氨苄青霉素（Amp）的LB液体培养基（5ml/15ml试管）中，37℃震摇培养过夜。
2.将1.5ml菌液加入微离心管中，14000r/min，离心10秒，其取上清液。
反复数次，收集全部菌体。
3.倾去上清，滤纸吸干。
4.加30μlTE缓冲液（10mmol/L Tris—HCl,1mmol/L EDTA,pH8.0）,振荡起菌体。
5.加30μlTENS溶液（10mmol/L Tris—HCl, pH8.0，1mmol/L EDTA,0.1mol/LNaOH,0.5%SDS）,震荡10秒至溶液变粘稠。
6.加150μl 3.0mol/LnaAC,震荡3—5S，14000r/min，离心3分钟，沉淀细胞碎片及染色体DNA。
7.上清液转移至另一微离心管中，甲等体积胞和酚，混匀，12000r/min,离心2分钟。
8.上层水相转移至另一位离心管，加2倍量冷水乙醇，14000r/min，离心20分钟。
9．倾去乙醇，加入7o％冷乙醇淋洗。
10．倾去乙醇，滤纸吸于，真空抽吸2～3分钟。
lI．加人50μlTE缓冲液，溶解DNA。
12，加入1μl核糖核酸酶(10mg／m1)，14000r/min,离心2s，使核糖核酸酶与管底液体混匀。
质粒dna提取原理
质粒dna提取原理
质粒DNA提取原理是通过破坏细菌细胞壁和细胞膜结构，释
放质粒DNA，并利用化学方法提取纯化质粒DNA。
质粒DNA提取的步骤如下：
1. 细胞裂解：将细菌培养物经过离心，得到菌体沉淀，然后加入裂解缓冲液，破坏细菌细胞壁和细胞膜，释放质粒DNA。
2. 质粒DNA纯化：加入一定量的碱性溶液，使细菌染色体DNA变性沉淀，而质粒DNA仍溶于溶液中。
然后通过离心，将质粒DNA沉淀下来。
3. 质粒DNA沉淀：将溶液中的质粒DNA与乙醇混合，使质
粒DNA沉淀成片状。
通过离心，得到质粒DNA沉淀。
4. 质粒DNA溶解：将质粒DNA沉淀洗涤去除杂质，并用适
当的缓冲液将质粒DNA溶解，得到高浓度的质粒DNA。
质粒DNA提取的关键在于破坏细菌细胞结构，释放质粒DNA，然后利用沉淀和溶解等步骤进行纯化。
通过以上步骤，可以提取到纯化后的质粒DNA，用于后续实验或分析。
质粒小提的原理和提取过程中的注意事项
质粒小提的原理和提取过程中的注意事项质粒小提是一种常用的实验方法，用于从细菌中提取质粒DNA。
其原理和提取过程中有一些注意事项，下面是详细介绍。
质粒小提的原理：质粒小提的原理是利用离心法将大量细菌聚集在一起，然后使用碱解液溶解细菌细胞壁和膜，将质粒DNA释放到溶液中。
接下来，通过加入特定的盐和有机溶剂，将质粒DNA与其他细胞成分分离开来。
最后，通过离心将质粒DNA沉淀下来，即完成了质粒小提。
质粒小提的提取过程中的注意事项：1.使用无菌操作：在整个提取过程中，确保使用无菌操作，以防止外源性DNA的污染。
使用无菌平台和器具，并且在实验室操作台上清洁表面。
2.选择适当的细菌培养基：选择适当的培养基和条件来培养细菌，以获得最佳的质粒DNA产量。
选择含有适当选择抗生素的培养基，以确保只有含有目标质粒的细菌生长。
3.对细菌进行预处理：在提取过程之前，对细菌进行适当的预处理是很重要的。
通常，细菌应该处于对质粒DNA产生最佳条件的生长阶段。
此外，使用良好的细菌培养方法，以确保质粒DNA在细菌中的稳定和延长拷贝数。
4.合理选择裂解液：选择适当的裂解液可以有效地裂解细菌细胞壁和膜，释放质粒DNA。
常用的裂解液包括碱、酶和界面活性剂。
根据不同的细菌类型和质粒特性，选择合适的裂解液方法。
5.应用适当的离心条件：离心是质粒小提过程中一个非常重要的步骤，可以将质粒DNA与其他组分分离开来。
确定适当的离心速度和离心时间，以确保质粒DNA能够沉淀下来，并且去除其他细胞残留物。
6.保存提取的质粒DNA：提取到的质粒DNA需要正确保存，以避免降解和污染。
使用无菌的保存管和适当的缓冲液，如TE缓冲液，在低温（通常-20°C）下保存质粒DNA。
以上是质粒小提的原理和提取过程中的注意事项的详细介绍。
在操作过程中要严格控制操作条件，以获得高质量的质粒DNA。
质粒提取 原理及步骤
质粒提取原理及步骤质粒提取是分子生物学中的一项重要实验技术，被广泛应用于基因克隆、基因转染、基因表达等方面。
本文将重点介绍质粒提取的原理及步骤。
一、原理质粒提取的原理基于质粒和细胞的生化学性质差异。
质粒是一种独立复制的DNA分子，可以自主复制并传递给细胞的子代。
而在真核细胞中，大多数DNA都位于细胞核中，很难获得足够的DNA量进行实验。
质粒提取利用了这一差异，将大量的质粒从细胞中提取出来。
质粒提取的主要步骤如下：二、步骤1. 细胞培养首先需要选择适当的细胞类型并在培养基中培养，使细胞处于最佳生长状态。
对于大多数细胞类型，建议在对数生长期时采集，因为此时细胞数量最多且代谢活跃，可以有效提高质粒提取的DNA量和质量。
同时，还需注意避免细胞因为过于密集而形成聚集体或凝胶。
2. 细胞收获收获细胞的方法取决于细胞类型和实验的目的。
常见的方法包括用PBS或细胞培养液将细胞冲洗下来，或者用胶体离心等方法进行细胞收获。
收获的细胞量需要根据实验需求进行调整，一般建议在0.1-1g的范围内收获细胞。
3. 细胞裂解细胞裂解是质粒提取过程中最关键的步骤之一，它能有效破坏细胞膜和核膜，释放细胞内的DNA。
常用的细胞裂解剂包括SDS、Triton X-100和Tween-20等，同时还需要将细胞裂解液加入蛋白酶抑制剂和DNA酶切酶，以避免核酸降解和一些酶促反应的发生。
细胞裂解后，将细胞裂解液转移到离心管中，并进行离心分离，将细胞碎片等大分子杂质通过离心将其剔除。
4. DNA纯化DNA纯化是质粒提取的最后一步，目的是将提取得到的DNA从其他杂质中纯化出来。
不同的实验需求需要不同级别的DNA纯化，从而需要使用不同种类的DNA纯化试剂盒。
目前常用的DNA纯化试剂盒包括酚/氯仿提取法、离子交换柱纯化法、硅胶膜纯化法等。
在DNA纯化后，通过分析电泳和UV测定等方法进行检测，以确保提取的DNA质量和浓度满足实验需求。
总结质粒提取是分子生物学中非常基础和常用的实验技术，其所涉及的步骤包括细胞培养、细胞收获、细胞裂解和DNA纯化等步骤。
质粒DNA提取方法与原理
质粒提取的原理、操作步骤、各溶液的作用细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。
各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。
目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和 SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA 发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。
纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。
例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。
对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。
一、试剂准备1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。
1M Tris-HCl (pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。
在10 lbf/in2高压灭菌15min ，贮存于4℃。
任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液。
50 mM葡萄糖最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。
碱裂解法提取质粒DNA的实验原理和操作步骤
碱裂解法提取质粒DNA的实验原理和操作步骤碱裂解法是一种常用的方法，用于提取质粒DNA（plasmid DNA）纯化。
以下是具体的实验原理和操作步骤。
实验原理：碱裂解法利用碱性溶液将细菌细胞的细胞壁和细胞膜溶解，使细菌细胞内的质粒DNA被释放出来。
接着，使用中性化剂中和碱性溶液，使DNA带正电荷，而细胞中的蛋白质则带负电荷，从而能够通过离心将DNA与蛋白质分离。
最后，通过浓缩、洗涤和纯化，得到高质量的质粒DNA。
操作步骤：1.培养细菌：选取含有质粒DNA的细菌菌株，如大肠杆菌。
在含有适当抗生素的培养基中培养细菌菌株。
2.收获细菌：当菌液呈现较稠的浑浊状态时，收取细菌培养物。
使用离心机将菌液离心，分离菌体沉淀和上清液。
将上清液倒掉，保留菌体沉淀。
3.碱裂解：将菌体沉淀溶解于碱性溶液中，如盐酸和十二烷基硫酸钠（SDS）溶液。
轻轻混合并将溶液放入水浴中加热，使细菌细胞壁和细胞膜被溶解。
4.中和：使用中性化剂，如醋酸，使溶液中的酸性物质中和。
这样可以确保DNA带正电荷，而蛋白质和其他污染物则带负电荷。
5.离心：将溶液离心，在离心过程中，DNA会与细胞内其他分子分离，形成一个DNA沉淀。
上清液中含有蛋白质和其他污染物。
6.洗涤：使用洗涤缓冲液，如乙酸盐缓冲液，洗涤DNA沉淀，去除残留的污染物。
7.纯化：用去离子水溶解DNA沉淀，使其溶解在水中。
将溶解的DNA沉淀通过滤纸等过滤装置过滤掉残余杂质。
8.浓缩：通过酒精沉淀法或其他方法，将DNA溶液浓缩到所需的浓度。
9.检测：使用紫外分光光度计等方法，测定提取的质粒DNA的纯度和浓度。
注意事项：1.在实验过程中保持操作环境和仪器无菌。
2.碱裂解法中使用的溶液需准备新鲜，并避免受到污染。
3.操作过程中需要低温处理和离心操作，以保护DNA的完整性。
4.质粒DNA的提取可以根据实验目的进行进一步的扩增、测序或转染等应用。
总结：通过碱裂解法，可以从细菌中提取纯化的质粒DNA。
质粒DNA的提取实验报告
质粒DNA的提取一、实验方法碱裂解法抽提质粒DNA二、实验原理基于质粒DNA与染色体DNA变性与复性的差异。
三、实验步骤1）质粒提取1. 10,000g,1min离心收集1.5－5ml菌液沉淀于1.5ml离心管中。
2. 加入100μl溶液1，振荡至彻底悬浮。
3. 加入200μl溶液2，立即轻柔颠倒离心管6次，使菌体充分裂解，随后将离心管冰上放置3分钟4. 加入150μl溶液3，立即温和颠倒离心管数次，冰上放置3分钟，10，000g离心10min。
5. 将步骤4的上清转移至新的离心管（尽量去除杂质），加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合均匀10，000g离心5min。
6. 将步骤5的上清转移至新的离心管，加入2倍体积的无水乙醇，室温放置5－10min，沉降DNA7. 10，000g离心10分钟,弃乙醇，保留沉淀，加入1ml 70％的乙醇洗涤沉淀，10，000g离心5分钟8. 倒掉乙醇溶液，用吸水纸吸净管壁上的水珠，室温蒸发痕量乙醇9. 加入适量含RNase的TE或灭菌双蒸水溶解质粒DNA2）质粒鉴定→琼脂糖凝胶电泳灌胶：胶中加入荧光染料(SYBR Green I)加样：质粒+上样缓冲液→混匀电泳结果观察：UV灯下四、实验结果五、实验分析裂解细胞中除含有质粒DNA外，还含有基因组DNA、各种RNA、蛋白质和脂类等物质，因此用碱裂解法除去杂质1、防止DNA裂解：Solution 11）、所含糖增加溶液黏度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切作用降解2）、所含EDTA抑制酶活性2、溶解与变性：Solution21)强碱使质粒DNA和染色体DNA变性2）离子型表面活性剂SDS可溶解膜蛋白3、沉降与复性：Solution31)质粒DNA复性2）在钾盐中，染色体DNA形成缠连的不溶性网状结构，和不稳定的大分子RNA以及变性的蛋白质和细菌碎片等一起沉淀预期结果为剩余质粒DNA4、琼脂糖凝胶电泳1）荧光染色染料分子可嵌入双链DNA分子配对碱基之间2）琼脂糖可起到电泳和分子筛的作用，因所带电荷、分子量大小和构型不同，泳动速度不同六、误差分析实验失败，本组实验出现4条带，3明1暗，明亮处应为DNA分子数最多的，为质粒DNA，质粒DNA前有较暗的两条带，推测其中一条为未复性质粒DNA，可能Solution2处变性过长，不易复性，或Solution3处时间过短，复性不充分。
质 粒 提 取 原理及步骤
质粒提取原理及步骤一、导论已经提出过许多方法用于从细菌中提纯质粒DNA，这些方法都含有以下3个步骤：1. 细菌培养物的生长。
2. 细菌的收获和裂解3. 质粒DNA的纯化。
（一）细菌培养物的生长从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中(有含有行当抗生素的液体培养基中生长)，然后从中纯化质粒，质粒的提纯几乎总是如此。
现在使用的许多质粒载体（如pUC系列）都能复制到很高的拷贝数，惟致只要将培养物放在标准LB 培养基中生长到对数晚期，就可以大量提纯质粒。
此时，不必造反性地扩增质粒DNA。
然而，较长一代的载体(如pB R322)由于不能如此自由地复制，所以需要在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行性扩增。
氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而，松弛型质粒仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续递增。
这样，像pBR３２２－类的质粒，从经氯霉素处理和未经处理的培养物中提取质粒的产量迥然不同，前者大为增高。
多年来，加入足以完全抑制蛋白质合成的氯霉素μg/ml)已成为标准的操作、用该方法提取的质粒DNA量，对于分子克隆中几乎所有想象到的工作任务。
（二）细菌的收获和裂解细菌的收获可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采用多种方法中的任意一种，这些方法包括用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。
选择哪一种方法取决于３个因素：质粒的大小、小肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒DNA的技术。
尽管针对质粒和宿主的每一种组合分别提出精确的裂解条件不切实际，但仍可据下述一般准则来选择适当方法，以取得满意的结果。
1)大质粒(大于15kb)容易受损，故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来。
将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，然后用溶菌酶和EDTA进生处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入SDS一类去污剂溶解球形体。
这种方法最大限度地减小了从具有正压的细菌内部把质粒释放出来所需要的作用力。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
质粒提取的原理、操作步骤、各溶液的作用细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。
各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。
目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和 SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA 发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。
纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。
例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。
对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。
一、试剂准备1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。
1M Tris-HCl (pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。
在10 lbf/in2高压灭菌15min ，贮存于4℃。
任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液。
50 mM葡萄糖最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。
因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。
所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。
EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。
在溶液I中加入高达 10 mM 的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。
如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。
如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢？实话告诉你，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。
NaOH也使DNA变性，但只是个副产物，在溶液3加入后其中的醋酸和NaOH中和，质粒DNA恢复活性2. 溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS。
2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。
使用前临时配置。
这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。
要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。
很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。
事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向 micelle（微囊）结构的相变化所导致。
用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS 也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试一下），自然就难高效率抽提得到质粒。
如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为 SDS也是碱性的，只是弱了点而已。
很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。
有人不禁要问，既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS 呢？那是为下一步操作做的铺垫。
这一步要记住两点：第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合（象对待女孩子一样），不然基因组DNA也会断裂。
基因组 DNA 的断裂会带来麻烦。
3.溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH4.8。
5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml。
4℃保存备用。
溶液III加入后就会有大量的沉淀，但大部分人却不明白这沉淀的本质。
最容易产生的误解是，当SDS碰到酸性后发生的沉淀。
如果你这样怀疑，往1%的 SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了。
大量沉淀的出现，显然与SDS的加入有关系。
如果在溶液II中不加SDS会怎样呢，也会有少量的沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。
既然SDS不是遇酸发生的沉淀，那会不会是遇盐发生的沉淀呢？在1％的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，你会发现SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。
因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀。
但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你会发现沉淀的量要多的多。
这其实是十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。
如此看来，溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。
大家知道SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。
这个过程不难想象，因为基因组DNA太长了，长长的DNA自然容易被SDS给共沉淀了，尽管SDS并不与DNA分子结合。
那么2 M的醋酸又是为什么而加的呢？是为了中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和之。
基因组DNA一旦发生断裂，只要是50－100 kb大小的片断，就没有办法再被PDS共沉淀了。
所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带。
很多人误认为是溶液III加入后基因组DNA无法快速复性就被沉淀了，这是天大的误会，因为变性的也好复性的也好，DNA分子在中性溶液中都是溶解的。
NaOH本来是为了溶解细胞而用的，DNA分子的变性其实是个副产物，与它是不是沉淀下来其实没有关系。
溶液 III加入并混合均匀后在冰上放置，目的是为了PDS沉淀更充分一点。
4. TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。
1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O 至100ml。
15 lbf/in2高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。
5.苯酚/氯仿 /异戊醇（25：24：1）不要以为PDS沉淀的形成就能将所有的蛋白质沉淀了，其实还有很多蛋白质不能被沉淀，因此要用酚/氯仿/异戊醇进行抽提，然后进行酒精沉淀才能得到质量稳定的质粒DNA，不然时间一长就会因为混入的DNase而发生降解。
这里用25/24/1的酚/氯仿/异戊醇是有很多道理的，这里做个全面的介绍。
酚（Phenol）对蛋白质的变性作用远大于氯仿，按道理应该用酚来最大程度将蛋白质抽提掉，但是水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液（比如4M的异硫氰酸胍），离心后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收；还有一点，酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），因此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行。
至于异戊醇的添加，其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收。
6.乙醇（无水乙醇、70%乙醇）回收后的水相含有足够多的盐，因此只要加入2倍体积的乙醇，在室温放置几分钟后离心就可以将质粒DNA沉淀出来。
这时候如果放到－20℃，时间一长反而会导致大量盐的沉淀，这点不同于普通的DNA酒精沉淀回收，所以不要过分小心了。
高浓度的盐会水合大量的水分子，因此DNA分子之间就容易形成氢键而发生沉淀。
如果感觉发生了盐的沉淀，就用70％的乙醇多洗几次，每次在室温放置一个小时以上，并用tip将沉淀打碎，就能得到好的样品。
得到的质粒样品一般用含 RNase （50 ug/ml）的TE缓冲液进行溶解，不然大量未降解的RNA会干扰电泳结果的.7. 5×TBE：Tris 碱54g，硼酸27.5g，EDTA-Na2·2H2O 4.65g，加ddH2O 至1000ml。
15 lbf/in2高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。
8．溴化乙锭（EB）：10mg/ml9.RNase A（RNA酶A）：不含DNA酶(DNase-free) RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加热15min，分装后贮存于-20℃。
10. 6×loading buffer（上样缓冲液）：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。
11. 1% 琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖于三角烧瓶中，加100ml 0.5×TBE，微波炉加热至完全溶化，冷却至60℃左右，加EB 母液（10mg/ml）至终浓度0.5μg/ml（注意：EB为强诱变剂，操作时带手套），轻轻摇匀。
缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却30min以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中（电泳缓冲液0.5×TBE），即可上样。
二、操作步骤1. 挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于2.0ml LB（含相应抗生素）液体培养基中，37℃、250g振荡培养过夜（约12-14hr）。
2.取1.5ml培养物入微量离心管中，室温离心8000g×1min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。
3.将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ（50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0））中，剧烈振荡，使菌体分散混匀，（且不至于沉淀）。
4. 加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ，颠倒数次混匀（不要剧烈振荡），并将离心管放置于冰上2-3min，使细胞膜裂解（溶液Ⅱ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。