冷冻干燥的保护剂及添加剂
兽用疫苗保护剂和佐剂
兽医生物制品常用的保护剂
1．5%蔗糖（乳糖）脱脂乳保护剂
蔗糖（或乳糖） 5g，加脱脂乳至 100ml，充分溶解后，110~116℃高压灭菌 30~40 min。
2．明胶蔗糖保护剂
明胶 2%~3%（g/m1）、蔗糖5%（g/m1）、硫脲 1%~2%（g/m1）。先 将 12%~18%明胶液、 30%蔗糖液和 6%~12%硫脲液加热溶解， 116℃高压 灭菌30~40min；
1. 营养液： • 可修复因冻干而受损的细胞，使冻干制品含有一定量水分；
• 可促进高分子物质形成骨架，使冻干制品呈多孔的海绵状，
增加溶解度 2. 赋形剂： • 防止低分子物质的碳化和氧化，保护活性物质不受加热影响 • 使冻干制品形成多孔性、疏松的海绵状物，增加溶解度 3. 抗氧化剂： • 抑制冻干制品中的酶作用，增加生物活性物质在冻干后贮存
7．脂质分子类佐剂：脂多糖、Vit A和Vit E等脂溶性维生素
8．其他：霍乱毒素（CT）、百日咳毒素（PT）和破伤风类 毒素（TT）等；脂磷壁酸（LTA）；维生素B12等。
氢氧化铝胶 (铝胶）
合成方法:
（1）用铝粉加烧碱合成法
2Al(OH)3+12H2O+3H2SO4→Al2(SO4)3· 18H2O
兽用疫苗冻干保护剂 和佐剂
冻干保护剂（稳定剂）
保护剂：又称稳定剂（stabilizer） ，是指一类能防止生 物活性物质在冷冻真空干燥时受到破坏的物质。（指对疫 苗生产、血清制备等） 保护剂用途（不同用途加不同保护剂, 主要针对活的微生 物或细胞） ① 菌种或毒种保存：常用甘油作保护剂 ② 细胞株保存：常用二甲基亚砜(DMSO) DMSO:二甲基亚砜，一种细胞的保护剂 ③ 疫苗冷冻真空干燥制备时：加脱脂乳（或二甲基亚 砜）和蔗糖等（不同国家有不同配方） ④ 干扰素类生物活性物质的保存：加葡聚糖
冷冻干燥过程中保护剂对脂质体粒径影响的实验研究
冷冻干燥过程中保护剂对脂质体粒径影响的
实验研究
冷冻干燥是一种常用的制备脂质体的方法，但该过程中脂质体容易发生聚集和脱水等问题。
为了解决这些问题，可以向冻干液中添加保护剂。
在实验中，可以选择不同的保护剂，并对脂质体的粒径进行测定。
常用的保护剂包括蔗糖、甘露醇和羟丙基-β-环糊精等。
实验步骤如下：
1. 制备脂质体悬浮液：根据所需的脂质体组成，将所需的磷脂和胆固醇等溶解在有机溶剂中，并用旋转蒸发仪将有机溶剂蒸发干净，制得脂质体固体膜。
随后，向固体膜中加入含磷酸盐缓冲液，使其形成悬浮液。
2. 冷冻：将脂质体悬浮液分装到合适的容器中，然后将容器放入液氮中进行冷冻。
冷冻速度要尽可能快，以避免脂质体的聚集。
3. 冻干：将冷冻后的样品置于真空条件下，使用冻干机进行冻干。
通过升温并施加负压，将样品中的水分从冰晶直接转化为气态，使样品变得干燥。
4. 粒径测定：使用粒径分析仪，如动态光散射仪（DLS）或激光衍射仪等，测定冷冻干燥后脂
质体的粒径。
可以比较不同保护剂条件下的粒径差异。
通过以上实验，可以得到不同保护剂对脂质体粒径的影响。
保护剂可提供一定的保护作用，减少脂质体的聚集和脱水现象，从而得到较为均匀的粒径分布。
不同保护剂的选择可以根据所需的应用和研究目的进行优化。
兽用疫苗保护剂和佐剂讲解
一些常用的冷冻干燥保护剂
分类
保护剂
复合物 糖类 盐类 醇类 酸类 聚合物
脱脂乳、明胶、蛋白质、蛋白胨、糊精、血清、甲基纤维素等 蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖等 乳酸钙、谷氨酸钠、氯化钠、氯化钾、醋酸铵、硫代硫酸钠等 山梨醇、甘油、甘露醇、肌醇、木糖醇等 柠檬酸、酒石酸、氨基酸等 葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮 (PVP) 等
助于抗原性物质在胞内被加工，被 MHC 分子特异性的结合、保护、运输并递 呈给效应细胞。
②抗原寻的（ antigen targeting ）
指抗原传递给免疫系统中适当效应细胞的效率。包括 吸引巨噬细胞到达组织部位、活化吞噬细胞、促进抗原 与细胞受体的结合等有重要作用。
③免疫调节（immune modulation ） 是指任何可以修饰的免疫效应细
２、保护剂浓度：严格按照配方执行。 ３、保护剂配制方法：糖类不能用121℃高压灭菌处理。 ４、保护剂酸碱度（PH 值）：主要对M的影响。
三、常用的冻干保护剂（稳定剂） 明确不同种类微生物需要添加不同保护剂
（一）细菌的保护剂 ① 需氧或兼氧厌氧菌：５％蔗糖脱脂乳或５％蔗糖、 1.5％明胶； ② 厌氧性细菌：含1.5％谷氨酸钠的１％乳糖或10％脱 脂乳或7.5％葡糖血清。 注：脱脂乳：20％脱脂奶粉溶于水配制而成。
疫苗冻干保护剂组成
1. 营养液： ? 可修复因冻干而受损的细胞，使冻干制品含有一定量水分； ? 可促进高分子物质形成骨架，使冻干制品呈多孔的海绵状， 增加溶解度 2. 赋形剂： ? 防止低分子物质的碳化和氧化，保护活性物质不受加热影响 ? 使冻干制品形成多孔性、疏松的海绵状物，增加溶解度 3. 抗氧化剂： ? 抑制冻干制品中的酶作用，增加生物活性物质在冻干后贮存 期间的稳定性，如维生素C、维生素E和硫代硫酸钠等。
冻干保护剂的筛选
冻干保护剂的筛选
一、材料、仪器：
2ml装的蛋白原液、1000iu/ml青链霉素、伊利高蛋白脱脂高钙奶粉、蔗糖、高压蒸汽灭菌锅、真空冷冻干燥机
脱脂奶粉配料表：
配料：脱脂牛奶、食品添加剂：大豆磷脂
维生素：维生素A醋酸酯、胆钙化醇、维生素E醋酸酯、抗坏血酸。
二、方法：
表1 冻干剂配方
1、在超净工作台中用三角烧瓶中按表1配方配好保护剂，混匀，包好，放入高压蒸汽灭菌锅中，115℃高压灭菌30分钟；
2、高压后取出，加抗原，即与1000 iu/ml青链霉素按1：1比例混合；
3、分装：摇匀后，与蛋白原液按1：1的比例按分装于高压过的玻璃瓶中；
4、预冻：将分装好的玻璃瓶放于-70℃冰箱预冻2h；
5、冻干：预冻完成后，将瓶盖拔开一些，将青霉素瓶转移到预冷过的冷冻干燥机内进行冻干；
6、冻干进行中，注意观察样品冻干的状态和结构，如形成乳白色疏松多孔的海绵状物质即可取出，放于-20℃保存备用；
7、观察各瓶的形态、外观，进行效价的测定。
8、活性测定，包括CEF成纤维细胞的培养，接种VSV病毒，以及结果的判定。
鸡传染性法氏囊病病毒X-28弱毒株的致病性试验。
冷冻干燥工艺
冷冻干燥工艺本工艺适用于细菌、酵母等菌体的冷冻干燥。
冻干后物品为固态、干燥、结块，保存应低温避湿。
1．工艺流程图保护剂配制→菌体与保护剂混合→分装入柜→冷冻干燥→出柜→保存2．操作过程及要点：2.1保护剂配制：按照保护剂配方（见附录），根据菌体重量计算和称取试剂，加入适量的水搅拌溶解（水的体积以能溶解保护剂为准）。
2.2菌体与保护剂混合：保护剂溶液完全溶解后，加入菌体，搅拌混匀。
2.3 分装入柜：用量杯量取一定体积（通常为1L）的菌液到托盘上，轻微晃动托盘，使物料均匀分布在托盘上。
将托盘置于隔板上，放置温度探头，每层放一个探头，探头需接触到菌液。
2.4冷冻干燥：2.4.1物料冷却：物料降温后，温度在-40℃～-50℃间冷却3-4小时后开始抽真空。
2.4.2升华：分三阶段第一阶段，快速升温阶段，物料温度由-50℃降至-30℃，升温速度控制在10℃～5℃/小时（通过间隙开循环泵来实现）。
第二阶段，温度维持阶段，物料温度维持在-30℃～-25℃间（通过间隙开循环泵来实现），维持时间为10小时，第三阶段，快速升温阶段，物料温度由-25℃升至20℃，升温速度控制在5℃/小时（开自动加热）。
2.5出柜：收集冻干菌体，取样，并贴上标签。
2.6保存：菌体置于-20℃冰箱保存，填写物品保存记录。
3．生产过程的质量控制●配制保护剂的水体积不能太多，以能溶解保护剂为宜。
●保护剂必须完全溶解后方可加入菌体混匀。
●每个托盘的装液量不要大于1L。
●物料冷却时间控制在3-4小时，时间不宜过长。
●升华过程的温度维持阶段，间断开循环泵，频率控制在每小时两次以上。
●出柜物品必须贴上标签。
4．物料、中间产品、成品的质量标准。
保护剂和菌体混匀后取样；出柜物品取样。
5．卫生●使用前清洗隔板；●每批冻干完后，用水泡洗托盘（若下批次冻干物品与上批冻干物品相同，可不用清洗），冲洗隔层板，清洗温度探头。
●每次使用完搅拌机后应立即清洗。
6．冻干失败物品处理：若冻干失败的物品数量多（10盘以上），应重新进行冷冻干燥。
冷冻干燥的保护剂和添加剂解读
School of Medical Instrument and Food Engineering
University of Shanghai for Science and Technology
5.1 冻干过程和储藏过程的变性机理 1. 冷冻和干燥过程
在生物制品的冷冻干燥过程中，主要有三种效应会导致生物制 品中活性组分的变性：低温效应、冻结效应和脱水效应。
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第五章 冷冻干燥的保护剂和添加剂
冻干过程和储藏过程的变性机理 冷冻干燥保护添加剂的分类 糖/多元醇类保护剂 聚合物类保护剂 表面活性剂类、氨基酸类的保护剂
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• 如前所述，生物制品的冷冻干燥过程是一个多步骤过 程，会产生低温、冻结和脱水等多种效应；即使成功 完成冷冻干燥过程后，在长期保存过程中也很难保证 冻干生物制品活性组分的稳定性。为了防止生物制品 在冷冻干燥和贮藏过程中活性组分的变性，研究者们 研究和探索了大量有效的保护添加剂。
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• 冻结效应（包括离子浓度的增加、冰晶的形成与生长、pH值变化 以及相分离等 ）
（1）在生物制品的冻结过程中，不断结晶会导致溶液的浓度快速 升高。小分子糖在最大冻结浓缩基质中的计算浓度高达80%。当 溶液浓度发生变化时，离子浓度增加，促进了化学反应。
冷冻干燥的保护剂和添加剂
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5.1 冻干过程和储藏过程的变性机理 1. 冷冻和干燥过程
在生物制品的冷冻干燥过程中，主要有三种效应会导致生物制 品中活性组分的变性：低温效应、冻结效应和脱水效应。
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• 在食品、药品以及生物体的冷冻干燥和贮藏过程中，很多因素 （例如，化学成分、冻结速率、冻结和脱水应力、玻璃化转变 温度、干燥固体中剩余水分、贮藏环境的温度和湿度等）都会 影响其中活性组分的稳定性甚至会导致失活。 • 大量的实验研究表明，除了一些食品、人血浆、牛奶等少数物 除了一些食品、人血浆、 除了一些食品 料可以直接冷冻干燥外；大多数的药品和生物制品，都需要添 料可以直接冷冻干燥外；大多数的药品和生物制品， 加合适的冷冻干燥保护剂和添加剂， 加合适的冷冻干燥保护剂和添加剂，配制成混合液后，才能进 行有效的冷冻干燥和贮藏。
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2. 储藏过程
• 蛋白质凝聚：是冻干生物制品活性组分在贮藏过程中发生变 蛋白质凝聚： 性的主要因素之一。导致蛋白质凝集可能是物理（非共价） 相互作用，也可能是蛋白质发生化学凝集（共价）。 • 脱酰胺作用：也是蛋白质发生变性的主要途径之一。天冬酰 脱酰胺作用： 胺（Asn）和谷氨酰胺（Gln）是蛋白质中易于发生脱酰胺作 用的两种氨基酸。 • 非酶褐变：也称作Maillard反应。它使得还原性糖（如葡萄糖） 非酶褐变： 与蛋白质中的赖氨酸（lysine）和精氨酸（arginine）形成碳水 络合物。 • 氧化反应：蛋白质中蛋氨酸Met，胱氨酸Cys，组氨酸His，色 氧化反应： 氨酸Trp和酪氨酸Tyr残基的侧链是发生氧化反应的可能位置。 • 水解作用 虽然冻干的蛋白质中含有极少量的水分，但在贮藏 水解作用: 过程中仍然会发生水解作用。
兽用疫苗保护剂和佐剂讲解
②抗原寻的（antigen targeting）
指抗原传递给免疫系统中适当效应细胞的效率。包括 吸引巨噬细胞到达组织部位、活化吞噬细胞、促进抗原 与细胞受体的结合等有重要作用。
③免疫调节（immune modulation） 是指任何可以修饰的免疫效应细
（二）病毒的保护剂 ① 5%蔗糖 脱脂乳； ② 马立克814活细胞疫苗:保存液氮.稳定剂为10%二 甲基亚砜和50%犊牛血清的199液。 注意: 微生物保护剂缓冲液的组成比例，不同厂家有 不同的配方。
兽医生物制品常用的保护剂
1．5%蔗糖（乳糖）脱脂乳保护剂
蔗糖（或乳糖）5g，加脱脂乳至100ml，充分溶解后，110~116℃高压灭菌 30~40 min。
一些常用的冷冻干燥保护剂
分类
保护剂
复合物 糖类 盐类 醇类 酸类 聚合物
脱脂乳、明胶、蛋白质、蛋白胨、糊精、血清、甲基纤维素等 蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖等 乳酸钙、谷氨酸钠、氯化钠、氯化钾、醋酸铵、硫代硫酸钠等 山梨醇、甘油、甘露醇、肌醇、木糖醇等 柠檬酸、酒石酸、氨基酸等 葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等
• 注意:佐剂和免疫增强剂的关系?
•
有时佐剂也是免疫增强剂.
作用特点：
① 明显增强抗原性微弱的物质诱导机体产生 特异性免疫应答。
② 用最少的抗原和最少的接种次数，产生足 够的免疫应答。
免疫佐剂作用机理
作用方式
① 改变正常免疫机能，吸引大量巨噬细胞以吞噬抗原； ② 改变抗原的构型，使抗原物质降解，并加强其免疫原性； ③ 延长抗原在组织内的贮存时间，使抗原缓慢降解和缓释，
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• 脱水效应
（1）水溶液中蛋白质经过充分水合作用后，在蛋白质分子表面附 着一单层水，这就是所说的水合层(hydration shell)。一般来讲， 参与完全水合作用的水含量为0.3-0.35g（水）/g（蛋白质）。 而在冻干蛋白质产品中水的含量一般不超过10%，因此，必定 有一部分结合水在干燥过程中被除去。 （2）结合水的去除很可能破坏蛋白质的天然结构，最终导致蛋白 质变性。这是因为富含结合水的蛋白质在脱水过程中暴露在乏 水环境中，将质子转化为带电羧酸基团，破坏了蛋白质中电荷 平衡，电荷密度的降低可能促进蛋白质分子之间的疏水作用， 从而使蛋白质发生聚集 。
• 低温效应
生物制品中活性组分在降温与复温过程的一定温度范围内会发 生变性。如对卵清蛋白(ovalbumin)的研究发现，在-10℃~-40℃ 之间，其活性显著降低，而继续降温到在-192℃，活性几乎没 有变化。
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• 在食品、药品以及生物体的冷冻干燥和贮藏过程中，很多因素 （例如，化学成分、冻结速率、冻结和脱水应力、玻璃化转变 温度、干燥固体中剩余水分、贮藏环境的温度和湿度等）都会 影响其中活性组分的稳定性甚至会导致失活。 • 大量的实验研究表明，除了一些食品、人血浆、牛奶等少数物 料可以直接冷冻干燥外；大多数的药品和生物制品，都需要添 加合适的冷冻干燥保护剂和添加剂，配制成混合液后，才能进 行有效的冷冻干燥和贮藏。
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（2）在生物制品溶液在冻结过程中也会产生大量的冰-水界面。 其中活性组分分子，如蛋白质，可能会被吸附到界面上，从而可 能破坏蛋白质的天然褶皱结构，最终导致蛋白质变性。 （3）在有些生物制品溶液的冻结过程中，溶液的pH值也会发生 变化。如在添加有pH值为7的磷酸盐缓冲液（NaH2PO4和 Na2HPO4的摩尔比为0.72）的蛋白质溶液冻结过程中，由于 NaH2PO4的溶解度远远大于Na2HPO4，当溶液达到三相共晶点时， 它们之间的摩尔比为57，最终导致了pH值的很大改变。蛋白质 发生物理聚集和化学变性。
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2. 储藏过程
• 蛋白质凝聚：是冻干生物制品活性组分在贮藏过程中发生变 性的主要因素之一。导致蛋白质凝集可能是物理（非共价） 相互作用，也可能是蛋白质发生化学凝集（共价）。 • 脱酰胺作用：也是蛋白质发生变性的主要途径之一。天冬酰 胺（Asn）和谷氨酰胺（Gln）是蛋白质中易于发生脱酰胺作 用的两种氨基酸。 • 非酶褐变：也称作Maillard反应。它使得还原性糖（如葡萄糖） 与蛋白质中的赖氨酸（lysine）和精氨酸（arginine）形成碳水 络合物。 • 氧化反应：蛋白质中蛋氨酸Met，胱氨酸Cys，组氨酸His，色 氨酸Trp和酪氨酸Tyr残基的侧链是发生氧化反应的可能位置。 • 水解作用: 虽然冻干的蛋白质中含有极少量的水分，但在贮藏 过程中仍然会发生水解作用。
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5.2 冷冻干燥保护添加剂的分类
按分子量分类
• 低分子量化合物：又可以分为酸性物质、中性物质和碱性物质。 酸性物质主要为谷氨酸、天冬氨酸、苹果氨酸、乳酸等；中性 物质主要为葡萄糖、肌醇、乳糖、蔗糖、棉籽糖、海藻糖、山 梨醇D、L-苏氨酸、肌醇、木糖醇等；碱性物质主要为精氨酸 和组氨酸等。 • 高分子化合物：主要如白蛋白、明胶、蛋白胨、可溶性淀粉、 糊精、肉汁、果胶、阿拉伯胶、羟甲基纤维素、藻类等以及天 然混合物如脱脂牛奶、血清等。 • 一般认为，低分子化合物在冻干过程中直接发挥作用；而高分 子化合物则是促进低分子化合物的保护作用。因此，制备保护 剂配方时，一般多将低、高分子化合物配合使用。
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第五章 冷冻干燥的保护剂和添加剂
冻干过程和储藏过程的变性机理 冷冻干燥保护添加剂的分类 糖/多元醇类保护剂 聚合物类保护剂 表面活性剂类、氨基酸类的保护剂
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• 冻结效应（包括离子浓度的增加、冰晶的形成与生长、pH值变化 以及相分离等 ）
（1）在生物制品的冻结过程中，不断结晶会导致溶液的浓度快速 升高。小分子糖在最大冻结浓缩基质中的计算浓度高达80%。当 溶液浓度发生变化时，离子浓度增加，促进了化学反应。
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5.1 冻干过程和储藏过程的变性机理 1. 冷冻和干燥过程
在生物制品的冷冻干燥过程中，主要有三种效应会导致生物制 品中活性组分的变性：低温效应、冻结效应和脱水效应。
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• 如前所述，生物制品的冷冻干燥过程是一个多步骤过 程，会产生低温、冻结和脱水等多种效应；即使成功 完成冷冻干燥过程后，在长期保存过程中也很难保证 冻干生物制品活性组分的稳定性。为了防止生物制品 在冷冻干燥和贮藏过程中活性组分的变性，研究者们 研究和探索了大量有效的保护添加剂。