04 冷冻干燥保护剂
细菌冻干保护剂配方
细菌冻干保护剂配方
细菌冻干是一种常见的保存细菌的方法，但在冻干过程中，细菌容易受到氧化、脱水等因素的影响，从而导致细菌数量减少或丧失活性。
为了提高细菌冻干的保护效果，可以添加一些保护剂来保护细菌。
下面是一种常用的细菌冻干保护剂配方：
成分：
1. 磷酸二氢钾 0.1mol/L
2. 葡萄糖 5% (w/v)
3. 甘油 10% (v/v)
4. 酪蛋白酸钠 0.5% (w/v)
5. 硫酸镁 0.01mol/L
6. NaCl 0.9% (w/v)
制作方法：
1. 在一烧杯中加入适量的去离子水，加热至85℃左右。
2. 待水温降至60℃左右时，加入磷酸二氢钾和葡萄糖，充分溶解。
3. 加入甘油和酪蛋白酸钠，充分混合。
4. 最后加入硫酸镁和NaCl，搅拌均匀。
5. 调节pH值至7.0左右，再过滤灭菌即可。
使用方法：
将细菌培养至对数生长期，加入预先配制好的保护剂，混匀后放入冻干机中进行冻干处理。
细菌冻干保护剂配方中的甘油和葡萄糖可以提供必要的营养物质和保护剂，酪蛋白酸钠可以保持细菌的活性，硫酸镁和NaCl则可以调节渗透压和维持细胞的完整性，从而提高细菌的存活率和保护效果。
冷冻干燥过程中保护剂对脂质体粒径影响的实验研究
冷冻干燥过程中保护剂对脂质体粒径影响的
实验研究
冷冻干燥是一种常用的制备脂质体的方法，但该过程中脂质体容易发生聚集和脱水等问题。
为了解决这些问题，可以向冻干液中添加保护剂。
在实验中，可以选择不同的保护剂，并对脂质体的粒径进行测定。
常用的保护剂包括蔗糖、甘露醇和羟丙基-β-环糊精等。
实验步骤如下：
1. 制备脂质体悬浮液：根据所需的脂质体组成，将所需的磷脂和胆固醇等溶解在有机溶剂中，并用旋转蒸发仪将有机溶剂蒸发干净，制得脂质体固体膜。
随后，向固体膜中加入含磷酸盐缓冲液，使其形成悬浮液。
2. 冷冻：将脂质体悬浮液分装到合适的容器中，然后将容器放入液氮中进行冷冻。
冷冻速度要尽可能快，以避免脂质体的聚集。
3. 冻干：将冷冻后的样品置于真空条件下，使用冻干机进行冻干。
通过升温并施加负压，将样品中的水分从冰晶直接转化为气态，使样品变得干燥。
4. 粒径测定：使用粒径分析仪，如动态光散射仪（DLS）或激光衍射仪等，测定冷冻干燥后脂
质体的粒径。
可以比较不同保护剂条件下的粒径差异。
通过以上实验，可以得到不同保护剂对脂质体粒径的影响。
保护剂可提供一定的保护作用，减少脂质体的聚集和脱水现象，从而得到较为均匀的粒径分布。
不同保护剂的选择可以根据所需的应用和研究目的进行优化。
中度嗜热浸矿菌的冷冻干燥保护剂
膜通 透性 的改 变 和 代谢 损 伤 ［ 因此 ， 择适 宜 的 。 选 冷冻 温度 ， 加入 合适 的保 护 剂 减少 细 胞 膜 在 冷冻 干 燥 中的损 伤 ， 提高 菌存 活率 的关键 。 是 研究 了在冷 冻 干 燥前 合 适 的预 冻 温 度 ， 然后 以 甘油 、 蔗糖 、 脱脂 牛奶 、 海藻糖 为保 护剂 ， 采用 正 交试 验设 计 ， 化组 合 ， 优 筛选 出冷冻干 燥保 藏 中度 嗜热菌
２ ０ 高 压 灭 菌 ２ ｍｉ。 Ｂ： 质 硫 粉 高 压 灭 菌 。， ０ ｎ 单
２ ｍｉ 。将 Ｂ硫粉 以 １ ５ ０ ｎ 。 ％的量加 入到 Ａ 培养基 中 ， 作 为 中度 嗜热 菌 的培养基 。
１ １ ３ 保 护剂 系统 。预冻 试 验 保 护 剂 ： 油 ５ ， 。。 甘 ％
１ ％，２ ０ １ ％。正交试 验保 护剂 组合 ： 甘油 （ ％ ，２ ， ６ １％ １ ％） 蔗糖 （ ％ ，２ １ ％） 脱 脂 奶 粉 （ ％， ％ ， ８ ， ６ １ ％， ８ ， ４ ６
８ ％） 海 藻糖 （ ％ ， ％ ，０ 。 ， ２ ６ １ ％）
１ ２ 试 验 过 程 ．
周洪波 ， 曾伟 民 ， 李 莹 ， 刘 晰 ， 冠周 邱
（ 中南 大学 资 源加 工与 生物 工程 学院 ， 长沙 ４ ０ ８ ） １ ０ ３
摘 要 ： 通过正交试验结果 直观分析 、 因素指标分析和方差分析 ， 研究 真空冷冻干燥保藏法 中保护剂 的作用 。结果 表明 ， 保
护剂 的最 佳 组 合 类 型 为 甘 油 １ ％ 、 ２ 蔗糖 ６ 、 脂 牛 奶 ４ 、 藻 糖 １ ％ 。 保 护剂 种 类 对 提 高 存 活 率 的 影 响 依 次 为 ： 油 ＞海 藻 糖 ％ 脱 ％ 海 ０ 甘 ＞脱 脂 牛奶 ＞蔗 糖 。 使 用 最 佳 保护 剂组 合 可 使 冷 冻 干 燥 中度 嗜 热 菌 的 存 活 率 达 到 ８ ． ％ 。 ３７
兽用疫苗保护剂和佐剂讲解
一些常用的冷冻干燥保护剂
分类
保护剂
复合物 糖类 盐类 醇类 酸类 聚合物
脱脂乳、明胶、蛋白质、蛋白胨、糊精、血清、甲基纤维素等 蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖等 乳酸钙、谷氨酸钠、氯化钠、氯化钾、醋酸铵、硫代硫酸钠等 山梨醇、甘油、甘露醇、肌醇、木糖醇等 柠檬酸、酒石酸、氨基酸等 葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮 (PVP) 等
助于抗原性物质在胞内被加工，被 MHC 分子特异性的结合、保护、运输并递 呈给效应细胞。
②抗原寻的（ antigen targeting ）
指抗原传递给免疫系统中适当效应细胞的效率。包括 吸引巨噬细胞到达组织部位、活化吞噬细胞、促进抗原 与细胞受体的结合等有重要作用。
③免疫调节（immune modulation ） 是指任何可以修饰的免疫效应细
２、保护剂浓度：严格按照配方执行。 ３、保护剂配制方法：糖类不能用121℃高压灭菌处理。 ４、保护剂酸碱度（PH 值）：主要对M的影响。
三、常用的冻干保护剂（稳定剂） 明确不同种类微生物需要添加不同保护剂
（一）细菌的保护剂 ① 需氧或兼氧厌氧菌：５％蔗糖脱脂乳或５％蔗糖、 1.5％明胶； ② 厌氧性细菌：含1.5％谷氨酸钠的１％乳糖或10％脱 脂乳或7.5％葡糖血清。 注：脱脂乳：20％脱脂奶粉溶于水配制而成。
疫苗冻干保护剂组成
1. 营养液： ? 可修复因冻干而受损的细胞，使冻干制品含有一定量水分； ? 可促进高分子物质形成骨架，使冻干制品呈多孔的海绵状， 增加溶解度 2. 赋形剂： ? 防止低分子物质的碳化和氧化，保护活性物质不受加热影响 ? 使冻干制品形成多孔性、疏松的海绵状物，增加溶解度 3. 抗氧化剂： ? 抑制冻干制品中的酶作用，增加生物活性物质在冻干后贮存 期间的稳定性，如维生素C、维生素E和硫代硫酸钠等。
冷冻干燥的保护剂及添加剂
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• 脱水效应
（1）水溶液中蛋白质经过充分水合作用后，在蛋白质分子表面附 着一单层水，这就是所说的水合层(hydration shell)。一般来讲， 参与完全水合作用的水含量为0.3-0.35g（水）/g（蛋白质）。 而在冻干蛋白质产品中水的含量一般不超过10%，因此，必定 有一部分结合水在干燥过程中被除去。 （2）结合水的去除很可能破坏蛋白质的天然结构，最终导致蛋白 质变性。这是因为富含结合水的蛋白质在脱水过程中暴露在乏 水环境中，将质子转化为带电羧酸基团，破坏了蛋白质中电荷 平衡，电荷密度的降低可能促进蛋白质分子之间的疏水作用， 从而使蛋白质发生聚集 。
• 低温效应
生物制品中活性组分在降温与复温过程的一定温度范围内会发 生变性。如对卵清蛋白(ovalbumin)的研究发现，在-10℃~-40℃ 之间，其活性显著降低，而继续降温到在-192℃，活性几乎没 有变化。
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• 在食品、药品以及生物体的冷冻干燥和贮藏过程中，很多因素 （例如，化学成分、冻结速率、冻结和脱水应力、玻璃化转变 温度、干燥固体中剩余水分、贮藏环境的温度和湿度等）都会 影响其中活性组分的稳定性甚至会导致失活。 • 大量的实验研究表明，除了一些食品、人血浆、牛奶等少数物 料可以直接冷冻干燥外；大多数的药品和生物制品，都需要添 加合适的冷冻干燥保护剂和添加剂，配制成混合液后，才能进 行有效的冷冻干燥和贮藏。
冻干保护剂及其保护机理的研究进展
冻干保护剂及其保护机理的研究进展生命科学学院动物科学专业2008084533（学号）严忠平（姓名）指导教师郑新添【摘要】进入上个世纪的八九十年代，科学技术的迅猛发展和人民群众对健康保障的需求为药品冷冻干燥技术的飞速发展提供了强大的动力，在药品冻干损伤和保护机理、药品冻干工艺、药品冷冻干燥机等方面取得了巨大的成绩。
但药品冷冻干燥技术是一门边缘学科，需要生物学、药学、制冷、真空和控制等知识的交叉和综合，因此仍存在亟待解决的问题。
冷冻干燥是目前保持微生物、动物组织、细胞及蛋白质等活性物质生物活性的一个有效的、普遍的方法．制品经完全冻结，并在一定的真空条件下使冰晶升华，从而达到低温脱水的目的，此过程即称为冷冻干燥，简称冻干，是冷冻和干燥的结合，其中冷冻与干燥引起的蛋白质变性的机理各不相同．【关键词】冻干保护剂保护机理药品生物自进入上个世纪的八九十年代，科学技术的迅猛发展和人民群众对健康保障的需求为药品冷冻干燥技术的飞速发展提供了强大的动力，在药品冻干损伤和保护机理、药品冻干工艺、药品冷冻干燥机等方面取得了巨大的成绩。
但药品冷冻干燥技术是一门边缘学科，需要生物学、药学、制冷、真空和控制等知识的交叉和综合，因此仍存在亟待解决的问题。
冷冻干燥是目前保持微生物、动物组织、细胞及蛋白质等活性物质生物活性的一个有效的、普遍的方法．制品经完全冻结，并在一定的真空条件下使冰晶升华，从而达到低温脱水的目的，此过程即称为冷冻干燥，简称冻干，是冷冻和干燥的结合，其中冷冻与干燥引起的蛋白质变性的机理各不相同．冷冻干燥技术最早于1813年由英国人华莱斯顿(Wollaston)发明．自Heckly和Hammer(1911年)首次对微生物进行干燥保存以来，经过多年来的完善与发展，国内外学者们发现冷冻干燥技术具有与其他干燥方法无可比拟的优点E23，菌种在低温下干燥，各种成分、酶的活性丧失少；可以保持菌种的形态、色泽；复水性好，能很快地吸水还原成干燥前的鲜活状态；脱水彻底，保存期长，储存运输、销售方便．但是，在真空冷冻干燥过程中，冷冻和干燥不可避免地会造成部分微生物细胞的损伤、死亡，及某些蛋白分子的钝化．为了提高冷冻干燥微生物、蛋白质等生物制品的存活率与生物活性，人们进行了大量的研究，其中包括冷干过程中蛋白质的空间结构的变化，以及各种保护剂对这些变化的影响[1]．1 冷冻干燥保护剂冻干是复杂的相变过程,冻干制品在整个过程存在的各种应力,包括低温应力、冻结应力、干燥应力等,常常是直接或间接导致制品中蛋白质变性的因素 ,所以在冻干过程中需使用保护剂。
冻干保护剂对胶体微粒给药系统包封率和粒径的影响
冻干保护剂对胶体微粒给药系统包封率和粒径的影响张海龙 097211043摘要：衡量脂质体和SLN药物品质的两个重要指标是脂质体和SLN包裹药物的粒径分布和包封率，在冷冻干燥过程中脂质体药物的粒径分布和包封率会发生变化。
本文综述了冻干保护剂的保护机理，在脂质体和SLN冷冻干燥过程中经常使用的四种冻干保护剂——葡萄糖、蔗糖、甘露醇、海藻糖，以及这四种不同保护剂、不同浓度在冻干过程中对脂质体和SLN粒径和包封率的影响。
关键词：冻干保护剂，脂质体，固体脂质纳米粒1前言胶体微粒系统是靶向给药系统常用的载体，可注射给药，也可制成各种剂型，用于皮肤、鼻腔等粘膜，在生物技术药物的给药中亦起重要作用。
脂质体、固体脂质纳米粒（SLN）是胶体微粒系统常用的药物载体。
虽然脂质体和SLN可以利用其独有的特性将毒副作用大、在血液中稳定性差、降解快的药物粉末或溶液包埋在直径为纳米级的脂质体和SLN微粒中，这种微粒与人体细胞膜有相似成分而有良好生物相容性等特点，但它也存在一些缺点，影响着它在临床方面的应用[1]。
脂质体和SLN都是混悬液，易受pH值、温度、环境中物质以及包封的药物性质影响[2]。
在贮存期间易发生聚集、沉降、融合及药物渗漏，且主要脂质材料易氧化、水解，难以满足药物制剂稳定性的要求，使应用受到了很大限制[3]。
因此，通常采用冷冻干燥法提高脂质体和SLN的贮存稳定性。
制成冻干脂质体和冻干SLN可显著降低脂质和药物的水解和氧化速度。
同时，冻干保护剂也保持了脂质体膜结构的完整性，克服脂质体和SLN聚集、融合及药物渗漏等不稳定因素，显著提高贮存稳定性。
虽然冷冻干燥法对于脂质体和SLN的贮存、包装、运输等方面的方便和稳定都不失为一种良好的选择。
但在冷冻过程形成的冰晶会使脂质微粒聚集融合，在冷冻和解冻过程中，膜内外冰晶形成速度不同引起渗透压差，造成微粒裂解，所以在冷冻干燥过程中，应加入冷冻保护剂以减少破坏[4]。
不同种类与浓度的冻干保护剂对脂质体和SLN的保护能力各不相同，本文将讨论葡萄糖、蔗糖、甘露醇和海藻糖等作为冻干保护剂，对胶体微粒给药系统的冻干过程进行研究。
冷冻干燥的保护剂和添加剂解读
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5.1 冻干过程和储藏过程的变性机理 1. 冷冻和干燥过程
在生物制品的冷冻干燥过程中，主要有三种效应会导致生物制 品中活性组分的变性：低温效应、冻结效应和脱水效应。
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第五章 冷冻干燥的保护剂和添加剂
冻干过程和储藏过程的变性机理 冷冻干燥保护添加剂的分类 糖/多元醇类保护剂 聚合物类保护剂 表面活性剂类、氨基酸类的保护剂
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• 如前所述，生物制品的冷冻干燥过程是一个多步骤过 程，会产生低温、冻结和脱水等多种效应；即使成功 完成冷冻干燥过程后，在长期保存过程中也很难保证 冻干生物制品活性组分的稳定性。为了防止生物制品 在冷冻干燥和贮藏过程中活性组分的变性，研究者们 研究和探索了大量有效的保护添加剂。
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• 冻结效应（包括离子浓度的增加、冰晶的形成与生长、pH值变化 以及相分离等 ）
（1）在生物制品的冻结过程中，不断结晶会导致溶液的浓度快速 升高。小分子糖在最大冻结浓缩基质中的计算浓度高达80%。当 溶液浓度发生变化时，离子浓度增加，促进了化学反应。
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04 冷冻干燥保护剂
冻干保护剂
一、冻干损伤机理:
蛋白质冷冻干燥全过程分为预冻、第一阶段升华干燥和第二阶段再干燥。
预冻
过程中水结冰时体积增大，致使活性物质活性部位中一些由弱分子力键连接的键遭到破坏，从而使活性损失;另外，水结冰后引起溶质浓度上升以及由于各种溶质在
不同温度条件下溶解度变化不一致而引起pH值的变化，导致活性物质所处的环境
发生变化而造成失活或变性。
二、冻干保护作用机理:
第一，“水替代假说”:认为由于蛋白质分子中存在大量氢键，结合水通过氢
键与蛋白质分子联结。
当蛋白质在冷冻干燥过程中失去水分后，蛋白的主相变温度会升高，发生变性。
但某些糖类属于亲水性物质，形成氢键能力较强，能替代蛋白表面的水的羟基，与蛋白质中的极性基团形成氢键，使得蛋白的主相变温度变化不大，低于操作温度，从而避免了生物活性物质由于发生相变所造成的机械损伤。
能够直接测量到冻干的蛋白质与保护剂蔗糖间的氢键。
第二，“玻璃态假说”:认为在含糖溶液的干燥过程中，糖-水混合物会玻璃
化，兼有固体和流体的行为，粘度极高，不容易形成结晶;且分子扩散系数很低，
因而具有粘性的保护剂包围在蛋白质分子的周围，形成一种在结构上与玻璃状的冰相似的碳水化合物玻璃体，使大分子物质的链锻运动受阻，阻止蛋白质的伸展和沉淀，维持蛋白质分子三维结构的稳定，从而起到保护作用。
研究表明，单糖、双糖、多羟基化合物以及结构蛋白质、酶都能显示玻璃行
为，只是玻璃化转变温度不同而已。
由于某些糖的玻璃化温度较高，在较高的保存温度下，仍能在蛋白质分子附近形成玻璃态。
(大于玻璃化温度就不形成玻璃态了)
一般说来，如工作温度低于保护剂的玻璃化温度，高于被保护的活性物质的主相变温度，那么该活性物质就能有效地保持活性。
但在目前，这两种假说还不能完全解释现有的实验现象。
三、冻干保护剂的选择:
冻干保护剂需要具备四个特性:玻璃化转变温度高、吸水性差、结晶率低和不含还原基。
常用的保护剂有如下几类物质:
1.糖类/多元醇:蔗糖、海藻糖、甘露醇、乳糖、葡萄糖、麦芽糖等;其中，葡萄糖、乳糖具有还原性，而蔗糖、海藻糖、葡聚糖没有还原性。
2.聚合物:HES、PVP、PEG、葡聚糖、白蛋白等;
3.无水溶剂:乙烯乙二醇、甘油、DMSO、DMF等;
4.表面活性剂:Tween 80等;
5.氨基酸:L-丝氨酸、谷氨酸钠、丙氨酸、甘氨酸、肌氨酸等;
6.盐和胺:磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐等;
具体分类:
(一)按相对分子量分
1.低分子化合物低分子化合物可提高微生物存活率，形成均一悬液，起到水分缓解作用。
如: 酸性物质:谷氨酸、天冬氨酸、乳酸;
中性物质:葡萄糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、山梨醇D;
碱性物质:精氨酸、组氨酸。
2.高分子化合物高分子化合物对微生物有保护作用，可促进其升华形成耐热骨架阻断热传导和热辐射。
如:白蛋白、明胶、蛋白胨、脱脂奶粉。
明胶水解明胶可去掉杂质蛋白、无抗原性、无过敏反应、无热源，并且分子量小、均质、易溶于水，可过滤除菌，共熔点为,12?。
对微生物的保护作用高出普通明胶10,以上。
脱脂奶粉可促进升华、加热灭菌，易取得均质产品，并扩大细胞相互间的距离。
(二)按功能和性质分
1.耐热冻干保护剂耐热冻干保护剂在冻结和干燥过程中，可防止活性组分变性，如海藻糖、蔗糖、聚乙烯吡咯酮(PVP)等。
2.填充剂可防止有效组分随水蒸气一起升华逸散，如:甘露醇、明胶等。
3.抗氧化剂产品的自身氧化可消耗冻干样品内部和环境中的氧;放入电子或氢离子，可阻断冻干样品中氧化链式反应，抑制氧化酶活性，防止样品在冷冻干燥及储藏过程中氧化变质。
如,硫代硫酸钠、维生素E、维生素C等。
4.酸碱调整剂在冷冻干燥、储藏过程中，将生物制品PH值调整到活性物质最稳定区域。
常用的有:磷酸二氢钾、磷酸氢钠。
(三)按物质的种类分
1.糖/多元醇类单糖(葡萄糖、半乳糖): 糖与生物制品活性组分的分子形成氢键而代替了原有水的位置，起保护作用;
低聚糖(蔗糖、海藻糖):低聚糖能起到低温保护功能和脱水保护作用;海藻糖则具有相对较高的玻璃化转变温度。
海藻糖——蛋白质——水微冰晶的形成，有效防止了水对玻璃化态的增塑作用。
并且其内部氢键较少，有利于蛋白质分子间形成氢键。
多元醇(甘露醇、山梨醇、丙三醇):多元醇具有和糖一样的作用。
甘露醇无菌滤液稳定，不易被氧化，可提供支持结构，并且不与活性组分发生反应;山梨醇是甘露醇的同分异构体，但其溶液度比甘露醇大，在常温下呈粘稠的透明状液体，有旋光性，略有甜味，具有吸湿性，高温下不稳定，在冷冻干燥配方中，山梨醇常用作填充剂。
2.表面活性剂类表面活性剂是降低界面的张力，亲水、亲油基组成的化合物。
表面活性剂可分为离子型、非离子型。
凡是溶于水能电离成离子的，称为离子
型表面活性剂，否则称为非离子型表面活性剂。
表面活性剂在冻结和脱水过程中既能降低冰、水界面张力所引起的冻结和脱水变形，又能在复水过程中对活性组分起到润湿剂和重皱褶剂的作用。
但在冻干生物制品测定和长期储藏中，表面活性剂并没有保护作用。
3.氨基酸类氨基酸是蛋白质的基本构成单位，其中最主要的是a-氨基酸。
常用的氨基酸类保护剂有甘氨酸、谷氨酸、精氨酸和组氨酸，试验表明氨基酸是最好的填充剂。
低浓度甘氨酸可通过抑制10或100mmol/L磷酸缓冲盐结晶，所致PH 值的改变而阻止蛋白质药物变性，并且能升高成品的塌陷温度，阻止因塌陷而引起的蛋白质药物的破坏。
4.其它添加剂类其它添加剂类保护剂包括抗氧化剂、缓冲剂和冻干加速剂。
抗氧化剂:一种是抗氧化剂的自身氧化，消耗冻干样品内部和环境中的氧，使冻干样品物料不被氧化;另一种是抗氧化剂给出电子或氢离子，阻断冻干样品中的氧化链式反应;还有一种方式是抗氧化剂通过抑制氧化镁的活性而防止冻干样品的氧化变质，如维生素E、维生素C、硫代硫酸钠、硫脲。
缓冲剂:蛋白质具有两性电解质，既能和酸作用又能和碱作用。
在中性环境中，大多数蛋白质是稳定的，由于蛋白质溶液在冻结过程中溶液的浓度是逐渐升高的，所以在高浓度时可改变溶液的PH值，PH值变化4个单位导致蛋白质变性，使生物制品失活。
因此在冻干保护剂配方中，需添加适量缓冲剂。
如，磷酸二氢钾、磷酸二氢钠。
冻干加速剂:冷冻干燥过程耗时长、耗能多，迫切需要对冻干循环进行优化，降低生产成本。
叔丁醇是一种小分子醇，与水完全互溶，具有低毒性、高蒸汽压。
在药品水溶液中加入叔丁醇能起到以下作用:
可降低干燥层阻力，从而加速干燥过程，缩短干燥时间;对于难溶于水的药品，可使产品具有较高的比表面积、好的外观，并易于复水，提高药品溶液和冻干品的稳定性，且有一定的抑菌作用。