RACE技术
RACE原理及应用
RACE的简介目前,全长基因的获得是生物工程及分子生物学研究的一个重点。
尽管已经有多种方法可以获得基因的全长序列，但在很多生物研究中，由于所研究的目的基因丰度较低，从而使得由低丰度mRNA通过转录获得全长cDNA很困难。
近年来发展成熟的cDNA末端快速扩增(RACE)技术为从低丰度转录快速获得全长cDNA提供了一个便捷的途径。
cDNA 末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术是一种基于mRNA反转录和PCR技术建立起来的、以部分的已知区域序列为起点,扩增基因转录本的未知区域,从而获得mRNA(cDNA)完整序列的方法。
简单的说就是一种从低丰度转录本中快速增长cDNA5’和cDNA3’末端，进而获得获得全长cDNA简单而有效的方法，该方法具有快捷、方便、高效等优点,可同时获得多个转录本。
因此近年来RACE技术已逐渐取代了经典的cDNA文库筛选技术,成为克隆全长cDNA序列的常用手段。
第二RACE的原理RACE 是采用PCR 技术由已知的部分cDNA 顺序来扩增出完整cDNA5’和3’末端,是一种简便而有效的方法, 又被称为锚定PCR (anchoredPCR)和单边PCR(one2side PCR)。
3’RACE的原理一)加入oligo(dT)17和反转录酶对mRNA进行反转录得到(-)cDNA；二)以oligo(dT)l7和一个35bp的接头(dT17-adaptor)为引物，其中在引物的接头中有一在基因组DNA中罕见的限制酶的酶切位点。
这样就在未知cDNA末端接上了一段特殊的接头序列。
再用一个基因特异性引物(3 amp)与少量第一链(-)cDNA退火并延伸，产生互补的第二链(+)cDNA。
三)利用3amp和接头引物进行PCR循环即可扩增得到cDNA双链。
扩增的特异性取决于3amp的碱基只与目的cDNA分子互补．而用接头引物来取代dT17一adaptor则可阻止长(dT)碱基引起的错配。
RACE技术原理
RACE的基本概念 不同厂家RACE试剂盒的介绍 RACE技术的关键环节
存在的问题及解决办法
RACE的基本概念
cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends, RACE)技术是基于PCR技术由已知的部分
cDNA序列来获得完整cDNA序列的一种方法，
在PCR反应中有足够的全长产物能被探测。
TdT加尾反应及其替代反应
第三，若目的cDNA中含有与多聚尾互补的几个核苷酸同 聚区，则在合成第二条cDNA链时引物的延伸会从内部序 列而不是末端序列开始，产生非全长的第二条cDNA链。
我们所使用Invitron公司的RACE试剂盒，采用PCR介导的
连接反应，在一定程度上避免了以上的问题。
RACE试剂盒中末端转移的是多聚C尾，这样在反转录合 成第一链时5’端多聚G的二级结构影响反转录的彻底进行，
会产生提前终止反应。我们改进了加尾的程序，用TdT酶 加上多聚T尾，结果降低了反转录的难度，两个基因最终 均获得了完整的5’末端。
RACE引物的设计
在实验过程中总结如下经验：
1.
2.
引物不能设计在保守区简并引物区。
2.
反转录提前终止
模板中有特殊的二级结构，反转录提前终止。通过提高 反转录的温度，加大反转录的反应体系以及反转录过程 中一直保持已变性的RNA模板处于50℃以上，避免以解
开二级结构的RNA再恢复原来的结构，以达到5’末端。
提供一种改进的反转录方法
1. 2.
3. 4.
5. 6.
7.
在RNase-free的0.2 mL Eppendorf 管中加入以下成分： Oligo(dT)(0.5μg) 1μL Total RNA(4~5μg) 3μL DEPC-H2O To 25 μL 混匀，70℃保温10min；50℃保温5min；稍微离心一下。 在混合物中，依次加入以下成份： 10X SSⅡ（ SSⅢ ）Buffer 5.0μL 10mM dNTP mix 1.0μL 0.1M DTT 2.0μL RNase Inhibitor(40U/μL) 1.0μL DEPC-H2O To 24 μL 轻轻混合，在50℃保温5min后，在50℃下将3号管中的混合成分移入 2号管中。 每个反应加入1μL SuperScriptTM Ⅱ（SSⅢ ），轻轻混匀，50℃反应 50min。 70℃放置15min以终止反应。 -20℃保存。
RACE技术及其在植物基因研究中的应用
这些方法在编辑基因方面具有高准确性和高效率，可以实现对基因组的精细 操作。然而，基因编辑技术也存在一定的局限性，如潜在的脱靶效应、伦理问题 和技术成本高等。
二、药用植物中的应用
基因编辑技术在药用植物领域的应用主要涉及中药材、西药和保健品等方面。
1、中药材
中药材是中医临床用药的主要来源，但其品质和产量的不稳定一直是制约中 医临床疗效的瓶颈。基因编辑技术可以通过精准改良中药材的基因组，提高药材 的疗效和产量。例如，利用CRISPR-Cas9技术对人参基因组进行编辑，成功实现 了提高人参皂苷含量的目标。
RACE技术在植物基因研究中的 应用
1、基因功能分析
RACE技术可以帮助研究人员克隆植物基因，并通过同源重组、转基因等方法 研究基因的功能。例如，通过克隆植物抗病基因，利用RACE技术可以确定该基因 的全序列，进而研究其作用机制和抗病机理。
2、基因表达研究
RACE技术可以用于研究植物在不同生长发育阶段或不同环境条件下的基因表 达模式。研究人员可以通过比较不同样本中基因的表达水平，了解该基因在植物 生长和发育过程中的作用。
RACE技术及其在植物基因研究 中的应用0Fra bibliotek 引言目录
02 RACE技术概述
03 RACE技术在植物基因 研究中的应用
04 RACE技术的实验案例
05 结论
06 参考内容
引言
随着生物技术的不断发展，研究人员越来越多的使用各种新技术来研究植物 基因的特性和功能。其中，RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）技术 是一种广泛使用的基因克隆和表达分析方法。本次演示将介绍RACE技术的原理、 流程及其实验步骤，并探讨该技术在植物基因研究中的应用及优势和不足。
race技术
race技术简介Race技术是一种用于并发编程中的竞态条件检测技术。
竞态条件是指多个线程或进程同时访问共享资源时可能引发的不确定行为。
Race技术旨在通过检测和定位竞态条件，帮助开发人员找出并发程序中的潜在问题并进行修复，提高程序的并发性能和可靠性。
背景在多线程或多进程编程中，线程或进程之间共享资源是非常常见的情况。
然而，当多个线程或进程同时访问并修改同一共享资源时，会引发竞态条件。
竞态条件可能导致程序的行为变得无法预测，从而引发错误和异常。
传统的调试工具无法准确地捕捉并发程序中的竞态条件。
因此，开发人员需要借助专门的竞态检测工具来分析和检测并发程序中的竞态条件。
Race技术的原理Race技术的实现原理通常基于两种方法：静态分析和动态检测。
静态分析静态分析是指在编译阶段分析程序的源代码，通过静态分析工具检测潜在的竞态条件。
静态分析可以查找代码中的潜在问题，如未同步的共享资源访问、没有正确加锁或解锁等。
静态分析可以在编码前发现潜在的竞态条件，减少运行时出错的可能性。
然而，由于静态分析无法获得程序的动态执行信息，它可能会导致一定的误报和漏报。
动态检测动态检测是指在程序运行时通过监控共享资源的访问和修改，来检测并发程序中的竞态条件。
动态检测可以提供更准确的竞态条件信息，并帮助开发人员定位问题所在。
动态检测通常使用基于日志或采样的方法。
基于日志的方法会记录并发程序中的共享资源访问和修改序列，并通过分析记录的日志来检测竞态条件。
这种方法对程序的性能有一定的影响，因为需要记录大量的日志。
采样方法是指定期间隔对并发程序进行采样，记录共享资源的访问和修改情况。
通过对采样数据进行分析，可以检测到竞态条件。
采样方法对程序的性能影响较小，但可能会遗漏一些竞态条件。
Race技术的应用Race技术可以应用于各种类型的并发程序，包括多线程程序、多进程程序和分布式系统。
在以下情况下，Race技术尤为重要：•并发性能调优：通过检测并发程序中的竞态条件，可以定位和解决性能瓶颈，提高并发程序的性能和响应速度。
瞬转过表达测序
瞬转过表达测序全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：瞬转过表达测序（Rapid amplification of cDNA ends, RACE）是一种用于确定基因的末端序列以及寻找基因的转录起始位点的技术。
利用RACE技术，研究人员可以快速准确地获得目标基因的全长序列信息。
本文将介绍瞬转过表达测序的原理、步骤和应用。
一、原理瞬转过表达测序是一种基于PCR扩增的技朮，用于扩增未知序列的末端。
它利用了mRNA转录的3'多聚腺苷酸尾巴和5'端的未知序列，通过扩增这两个端点，从而获得目标基因的全部序列信息。
RACE技术的原理如下：将mRNA转录为cDNA，其中含有未知的末端序列。
然后，通过加入多聚C或多聚G的引物，可以选择性地扩增3'末端或5'末端的序列。
通过PCR扩增和测序，可以获得目标基因的全部序列信息。
二、步骤瞬转过表达测序的步骤如下：1. cDNA合成：将mRNA转录为cDNA，即合成第一链。
通常采用逆转录酶和随机引物对mRNA进行逆转录。
2. RACE反应：根据目标基因的末端序列信息，设计特异性引物。
如果要扩增3'末端，可以加入多聚C引物；如果要扩增5'末端，可以加入多聚G引物。
3. PCR扩增：将cDNA与特异性引物进行PCR扩增，得到预期大小的产物。
4. 凝胶电泳：将PCR产物进行凝胶电泳分析，确认扩增的目的片段。
5. 测序：对扩增的片段进行测序，获得完整的基因序列信息。
三、应用瞬转过表达测序技术在生物学研究中有着广泛的应用，包括：1. 确定基因的未知序列：RACE技术可以帮助研究人员获得目标基因的未知序列信息，为进一步的研究奠定基础。
2. 寻找基因的转录起始位点：通过RACE技术，可以确定基因的5'端序列，从而找到转录起始位点。
3. 进化研究：瞬转过表达测序技术可以用于研究物种之间的基因序列差异，从而揭示生物进化的规律。
4. 新基因的发现：通过RACE技术，可以发现新的基因，为生物学研究提供新的研究对象。
RACE技术
RACE技术第一 RACE的简介目前,全长基因的获得是生物工程及分子生物学研究的一个重点。
尽管已经有多种方法可以获得基因的全长序列，但在很多生物研究中，由于所研究的目的基因丰度较低，从而使得由低丰度mRNA通过转录获得全长cDNA很困难。
近年来发展成熟的cDNA末端快速扩增(RACE)技术为从低丰度转录快速获得全长cDNA提供了一个便捷的途径。
cDNA 末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术是一种基于mRNA 反转录和PCR技术建立起来的、以部分的已知区域序列为起点,扩增基因转录本的未知区域,从而获得mRNA(cDNA)完整序列的方法。
简单的说就是一种从低丰度转录本中快速增长cDNA5’和cDNA3’末端，进而获得获得全长cDNA简单而有效的方法，该方法具有快捷、方便、高效等优点,可同时获得多个转录本。
因此近年来RACE技术已逐渐取代了经典的cDNA文库筛选技术,成为克隆全长cDNA序列的常用手段。
随着分子生物学技术的发展，科学家结合其他不同的分子生物学技术对最初的RACE 技术进行了改进，从而丰富了ＲＡＣＥ技术的类型。
目前使用的RACE技术包括：经典RACE、Adapter Ligated RACE、RLM-RACE、Cap-switching RACE、环形RACE、RAC-RACE和T-RACE等等，但没有一种RACE技术适合克隆所有类型的RNA。
因此，本文将通过介绍各种RACE技术的发展、原理及应用，比较认识各种RACE技术的优缺点，并对RACE的前景进行讨论。
第二RACE的原理1.经典RACERACE 是采用PCR 技术由已知的部分cDNA 顺序来扩增出完整cDNA5’和3’末端,是一种简便而有效的方法, 又被称为锚定PCR (anchoredPCR)和单边PCR(one2side PCR)。
①3’RACE的原理一)加入oligo(dT)17和反转录酶对mRNA进行反转录得到(-)cDNA；二)以oligo(dT)l7和一个35bp的接头(dT17-adaptor)为引物，其中在引物的接头中有一在基因组DNA中罕见的限制酶的酶切位点。
RACE原理及操作
RACE技术的原理和操作点击次数：国1044 作者：yshu3507发表于：2009-10-23 13:55 转载请注明来自丁香园来源：丁香园近年来随着生物技术的不断发展，岀现了许多克隆新基因的方法和手段，如图谱克隆技术、转座子标签技术、mRNA差异显示技术二基因组减法技术以及cDNA文库筛选技术等。
但上述方法人多具有实验周期长、技术步骤烦琐且工作量大等特点。
cDNA末端快速扩增技术（rapid amplification of cDNA ends，RACE）是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5'和3'末端的有效方法，以其简单、快速、廉价等优势而受到越来越多的重视。
经典的RACE技术是由Frohman等（1988 ）发明的一项技术，主要通过RT-PCR技术由已知部分cDNA序列来得到完整的CDNA5'和3'端，包括单边PCR和锚定PCR。
该技术提出以来经过不断发展和完善，克服了早期技术步骤多、时间长、特异性差的缺点（ Frohman等，1995 : Schaefer，l995 : Chen， 1998 : Bespalova 等，1998 : Matz等11999 ）。
对传统 RACE技术的改进主要是引物设计及 RT-PCR技术的改进：改进之一是利用锁定引物（（lock docking primer ）合成第一链cDNA，即在oligo （ dT）引物的3'端引入两个简并的核苷酸【5'-Oligo （ dT）16-30MN-3'，M=A/G/C ； N=A/G/C/T】，使引物定位在 poly （A）尾的起始点，从而消除了在合成第一条cDNA链时oligo （dT）与poly （A）尾的任何部位的结合所带来的影响；改进之二是在5'端加尾时，采用poly （C），而不是poly （A ）;改进之三是采用RNa se H-莫洛尼氏鼠白血。
RACE技术的原理和操作
RACE技术的原理和操作发布日期:2009-11-27 热门指数:15803 分享| 收藏近年来随着生物技术的不断发展，出现了许多克隆新基因的方法和手段，如图谱克隆技术、转座子标签技术、mRNA差异显示技术二基因组减法技术以及cDNA文库筛选技术等。
但上述方法人多具有实验周期长、技术步骤烦琐且工作量大等特点。
cDNA末端快速扩增技术（rapid amplification of cDNA ends，RA CE）是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5'和3'末端的有效方法，以其简单、快速、廉价等优势而受到越来越多的重视。
经典的RACE技术是由Frohman等（1988）发明的一项技术，主要通过RT-PCR技术由已知部分cDN A序列来得到完整的cDNA5'和3'端，包括单边PCR和锚定PCR。
该技术提出以来经过不断发展和完善，克服了早期技术步骤多、时间长、特异性差的缺点（Frohman等，1995：Schaefer，l995：Chen，1 998：Bespalova等，1998：Matz等11999）。
对传统RACE技术的改进主要是引物设计及RT-PC R技术的改进：改进之一是利用锁定引物（（lock docking primer）合成第一链cDNA，即在oligo（d T）引物的3' 端引入两个简并的核苷酸【5'-Oligo（dT）16-30MN-3'，M=A/G/C；N=A/G/C/T】，使引物定位在poly（A）尾的起始点，从而消除了在合成第一条cDNA链时oligo（dT）与poly（A）尾的任何部位的结合所带来的影响；改进之二是在5' 端加尾时，采用poly（C），而不是poly（A）；改进之三是采用RNase H-莫洛尼氏鼠白血。
病毒（MMLV）反转录酶或选择嗜热DNA聚合酶可能在高温（60℃-70℃）有效地逆转录mRNA，从而消除了5'端由于高CC含量导致的mRNA 二级结构对逆转录的影响；改进之四是采用热启动PCR （hot start PCR）技术和降落PCR（touch down PCR）提高PCR反应的特异性。
RACE原理及应用
RACE的简介目前,全长基因的获得是生物工程及分子生物学研究的一个重点。
尽管已经有多种方法可以获得基因的全长序列，但在很多生物研究中，由于所研究的目的基因丰度较低，从而使得由低丰度mRNA通过转录获得全长cDNA很困难。
近年来发展成熟的cDNA末端快速扩增(RACE)技术为从低丰度转录快速获得全长 cDNA 提供了一个便捷的途径。
cDNA 末端快速扩增 (rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术是一种基于mRNA反转录和 PCR技术建立起来的、以部分的已知区域序列为起点,扩增基因转录本的未知区域,从而获得mRNA(cDNA)完整序列的方法。
简单的说就是一种从低丰度转录本中快速增长cDNA5’和cDNA3’末端，进而获得获得全长cDNA简单而有效的方法，该方法具有快捷、方便、高效等优点,可同时获得多个转录本。
因此近年来RACE技术已逐渐取代了经典的cDNA文库筛选技术,成为克隆全长cDNA序列的常用手段。
第二 RACE的原理RACE 是采用PCR 技术由已知的部分cDNA 顺序来扩增出完整cDNA5’和3’末端,是一种简便而有效的方法, 又被称为锚定 PCR (anchoredPCR)和单边PCR(one2side PCR)。
3’RACE的原理一)加入oligo(dT)17和反转录酶对mRNA进行反转录得到(-)cDNA；二)以oligo(dT)l7和一个35bp的接头(dT17-adaptor)为引物，其中在引物的接头中有一在基因组DNA中罕见的限制酶的酶切位点。
这样就在未知cDNA末端接上了一段特殊的接头序列。
再用一个基因特异性引物(3 amp)与少量第一链(-)cDNA退火并延伸，产生互补的第二链(+)cDNA。
三)利用3amp和接头引物进行PCR循环即可扩增得到cDNA双链。
扩增的特异性取决于3amp的碱基只与目的cDNA分子互补．而用接头引物来取代dT17一adaptor则可阻止长(dT)碱基引起的错配。
RACE
??可以利用胶回收试剂盒来回收RACE产物，此试剂盒适合回收2.5kb以下的RACE产物；对于长的片段，可以通过电洗脱获得好的结果。如果你选择使用其他的纯化方法，最后用Tricine－EDTA buffer 30μl重新悬浮DNA样品。 ??电泳5μl回收的样品来鉴定回收的质量。 ??将回收的PCR产物直接克隆到/A型的PCR克隆载体中。另外还可以利用接头和/或cDNA合成引物中的Not1、Srf1、Xma1、ECOR1等酶切位点，将产物克隆到常规载体中 对于5‘端的RACE产物，我们建议挑取至少8－10个不同的克隆以获得5‘端的最大可能性的序列。（反转录并不总是进行到mRNA模板的5’末端，尤其是长模板。另外，T4 DNA聚合酶会移走5‘末端的0－20个碱基。） ??一旦鉴定了含有插入片断的克隆，应该获得多的序列信息。理想的是，可以对整个开放读码框进行测序。包括5‘和3‘的非翻译区。 全长cDNA的获得 ??通过部分或全部测序鉴定了RACE产物后，可以通过两种选择获得全长的cDNA。 通过PCR的方法。 通过克隆的方法。 通过PCR的方法获得全长cDNA： ??扩增长的cDNA需要较长的延伸时间，但是如果延伸的时间过长，可以产生拖带，所以要慎重的设计引物。 ??根据从5‘和3‘RACE产物获得序列信息设计5’和3‘GSP引物。这些引物应该来自cDNA的3’或者5‘的末端，应该是23－28nt长。不应该在引物的末端加上限制性位点，这样会导致高背景。在某些时候可以设计3’和5‘的嵌套引物。但是还是应该先利用一对引物进行PCR反应。 通过PCR的方法获得全长cDNA： ??进行如下的热循环： 94度30秒 25个循环94度5秒 72度2－15分钟 ??延伸的时间应该等于预期的cDNA长度加上2分钟。例如：预期得到6kb的条带，用6＋2＝8分钟的延伸时间。 ??注意：如果没有条带或者条带弱，增加5个循环；或者优化PCR的条件。 通过PCR的方法获得全长cDNA： ??在1.2%的琼脂糖凝胶上分析5μl的样品。通常情况下，可以见到一条单一带，如果这样，利用胶来纯化全长的cDNA。 ??制备1.2%的TAE buffer制备琼脂糖凝胶。不使用TBE buffer，TBE的胶很难制备全长的cDNA。 ??将剩下的45μl反应物点样，选用适当的marker。 ??利用长波紫外观察cDNA（≧300nm）切下全长的cDNA。注意：应该尽量减少紫外对cDNA的照射。 通过PCR的方法获得全长cDNA： ??利用胶回收试剂盒回收cDNA。此试剂盒适合回收2.5kb以下的RACE产物；对于长的片段，可以通过电洗脱获得好的结果。如果你选择使用其他的纯化方法，最后用Tricine－EDTA buffer 30μl重新悬浮DNA样品。 ??将全长的cDNA克隆到T/A型的PCR克隆载体中。 通过克隆产生全长的cDNA： ??如果你已经获得了含有重叠部分的5‘和3’RACE产物，同时在cDNA的重叠部分含有一个酶切位点的话，通过克隆技术可以获得全长的cDNA。 ??利用酶切获得的3‘和5’扩增产物，并且利用T4 DNA连接酶将它们连接起来。利用接头和cDNA合成引物中的内切酶将最终的全长cDNA克隆到载体中。 ??在哺乳动物基因组中，NOT1和Srf1酶切非常稀少，大约106bp才出现一次，因此在绝大多数的cDNA中是不出现的。 Appendix：cDNA接头和引物??接头在设计的时候可以使cDNA的扩增成功进行：??接头的5‘端在第一个循环中没有AP1引物的结合位点。AP1的结合位点只有通过GSP的扩增之后才能够产生。??这些特点中的每一个都可帮助减少cDNA片段扩增过程中出现的非特异性扩增。另外，它们允许从一个复杂的DNA片段的混合物中扩增出靶样品――所有的产物都有相同的末端结构，因为使用了单一的一套GSPs。 在审计的意思 RACE (企业实体与环境调查) 这是在实施审计程序时必要的一个程序。
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RACE技术RACE的扩增原理图RACE(rapid-amplificationofcDNAends)是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术，通过PCR技术实现的，无须建立cDNA文库，可以在很短的时间内获得有利用价值的信息。
RACE是基于PCR技术基础上由已知的一段cDNA片段，通过往两端延伸扩增从而获得完整的3'端和5'端的方法。
RACE技术-主要分类一般分5-和3-RACE两种。
3-RACE较简单，首先将mRNA或总RNA用PolyT引物反转录，根据一般基因具有polyA 尾巴的特点，选用特异引物(根据已知序列设计)和PolyT引物PCR即可。
大多实验者反映一次PCR可以搞定。
5-RACE相对较难，目前流行几种5-RACE。
其一为加接头(传统)，根据接头引物和自己设计特异引物PCR，可以设计巢式PCR二次扩增。
另外，有利用反向PCR技术，连接成环在PCR。
还有，GENE公司一种smartRACEPCR，利用反转酶末断加C特点,直接加上多G接头，转换模板而无需用连接酶加接头。
RACE技术-发展历史RACE技术经典的RACE技术是由Frohman等(1988)发明的一项技术，主要通过RT-PCR技术由已知部分cDNA序列来得到完整的cDNA5’和3’端，包括单边PCR和锚定PCR。
该技术提出以来经过不断发展和完善，克服了早期技术步骤多、时间长、特异性差的缺点(Frohman等，1995：Schaefer，l995：Chen，1998：Bespalova等，1998：Matz等1999)。
对传统RACE技术的改进主要是引物设计及RT-PCR技术的改进：改进之一是利用锁定引物((lockdockingprimer)合成第一链cDNA,即在oligo(dT)引物的3′端引入两个简并的核苷酸【5′-Oligo(dT)16_30MN-3′,M=A/G/C;N=A/G/C/T】，使引物定位在poly(A)尾的起始点，从而消除了在合成第一条cDNA链时oligo(dT)与poly(A)尾的任何部位的结合所带来的影响；改进之二是在5‘端加尾时，采用poly(C)，而不是poly(A)；改进之三是采用RNaseH一莫洛尼氏鼠白血病毒(MMLV)反转录酶或选择嗜热DNA聚合酶可能在高温h(60度-70度)有效地逆转录mRNA，从而消除了5‘端由于高CC含量导致的mRNA二级结构对逆转录的影响；改进之四是采用热启动PCR(hotstartPCR)技术和降落PCR(touchdownPCR)提高PCR反应的特异性。
随着RACE技术日益完善，目前己有商业化RACE技术产品推出，如CLONTECH的MarathoTM技术和SMARTTMRACE技术术。
邢桂春等(2001)先后使用上述两种试剂盒进行RACE反应，结果发现使用MarathonTM所得到的片断总是比采用SMARTsup]TMRACE 试剂盒到所得到的片断短。
其原因在于MarathonTM技术反转录反应往往不能真正达到mRNA的5’末端。
所以认为，进行RACE反应应当优选SMARTTMRACE试剂盒。
RACE技术-引物设计基因特异性引物（GSPs）应该是：1、23－28nt2、50－70％GC3、Tm值≥65度，Tm值≥70度可以获得好的结果需要实验者根据已有的基因序列设计5‘和3‘RACE反应的基因特异性引物（GSP1和GSP2).由于两个引物的存在，PCR的产物是特异性的。
4、cDNA的合成起始于polyA+RNA。
如果使用其它的基因组DNA或总RNA，背景会很高。
5、RACEPCR的效率还取决于总的mRNA中目的mRNA的量和不同的引物有不同的退火和延伸温度。
6、在进行5‘和3’RACEPCR的时候应该使用热启动。
7、重叠引物的设计会对全长的产生有帮助。
另外，重叠的引物可以为PCR反应提供一个对照。
并不是绝对的要利用设计的引物产生重叠片段。
8、引物GSP中的GC含量要在50－70％之间。
这样可以使用降落PCR。
避免使用自身互补性的引物序列，否则会产生回折和形成分子内氢键。
另外，避免使用与AP1互补的引物，尤其是在3‘末端。
9、如果要用重叠片段来检测设计的引物，GSp1和GSp2之间至少是100－200碱基。
只有这样才可以用扩增的产物来鉴定设计的引物是否正确。
10、降落PCR可以明显的增加RACEPCR产物的特异性。
在最开始的循环中，退火温度高于AP1引物的Tm值，可以增加对特异性条带的扩增。
随后的退火和延伸的温度降回到AP1的温度，可以进行随后的PCR循环。
11、验证基因特异性引物的对照：单个引物的阴性对照：只用一个引物GSP来进行阴性对照。
这样不应该产生任何的条带。
如果可以看到明显的产物，应该改变循环的参数，或重新设计原始引物。
利用两个GSPS进行阳性对照：（只有两个GSP可以产生重叠的时候才可以采用此步。
）为了确定RNA样品中目的基因确实表达，利用两个GSP和接头连接的cDNA来产生阳性对照。
可以产生两个引物之间的重叠大小的片段。
如果没有这个片段，应该重复cDNA的合成，或者从一个不同的组织或细胞来源进行cDNA的合成。
12、制备和抽提polyA+RNA不要使用DEPC处理过的水。
纯化完mRNA之后，利用琼脂糖凝胶电泳检测mRNA的质量。
哺乳动物的mRNA样品是0.5－12kb的拖带，在其中有4.5和1.9kb的rRNA的条带。
非哺乳动物的mRNA应略小。
RACE技术-比较与优化RACE技术目的：研究环化法、末端脱氧核糖核酸转移酶法和SMART反转录酶法3种常用5'RACE的技术的特点，并对它们进行了优化。
方法：以播娘蒿RNA为模板，先按文献标准方法进行5'RACE，然后通过增加反应时间，提高部分反应物浓度等方法进行优化。
结果：未优化前环化法和TdT酶法条带几乎不可见，SMART反转录酶法隐约可见条带，但不清晰。
优化条件后，环化法出现弥散条带，TdT酶法胜之，但条带依旧弥散，而SMART 反转录酶法最佳，获得清晰特异性条带。
结论SMART5'RACE效果最好，其次为TdT酶法，环化法效果有待改进，同时通过优化条件可以明显增加产物的特异性，为实验研究中5'RACE方法的选择提供了依据。
RACE技术-实验步骤cDNA第一条链的合成：我们建议进行cDNA合成的对照反应，这样可以对样品的cDNA的合成进行鉴定。
加入各种试剂之后，在气浴中42度保温一个小时。
注意：在水浴或酒精浴中保温回减少反应体积，从而降低第一链的合成效率。
将管放于冰上，以终止第一链的合成反应。
直接进行第二链的合成。
cDNA第二链的合成：第二链合成的酶混合物中，含有聚合酶、RNaseH和连接酶。
T4DNA聚合酶的功能是补平dscDNA的末端。
我们建议做阳性对照，试剂盒中提供人类骨骼肌的mRNA。
1、建议进行阳性对照,cDNA的质量取决于制备的polyA+RNA的质量。
非哺乳动物样品的mRNA大约在0.5－3kb之间。
2、通过电泳检测cDNA的产量，与对照进行对比，这样可以有利于在以后的步骤中对cDNA 进行稀释。
3、按照程序进行连接反应。
4、如果没有对比样品和对照的产量，利用Tricine－EDTAbuffer制备接头连接的dscDNA的1/50和1/250的稀释物，用两种稀释物进行RACEPCR反应，直到鉴定出哪一种稀释可以得到好的效果。
RACE技术-PCR扩增PCR扩增进行5’和3’的RACE－PCR扩增。
利用以下的程序进行降落PCR反应：94度30秒5个循环：（1）94度5秒（2）72度4分5个循环：（1）94度5秒（2）70度4分钟20－25个循环：（1）94度5秒（2）68度4分钟注意：我们建议使用降落PCR反应，这就要求GSP的Tm值≥70度。
1、当循环结束时，利用1.2%琼脂糖凝胶电泳分析每一个管中的产物5μl，使用适当的分子量marker。
2、可以根据你的基因的特异性来设计最理想的循环参数。
如果看不到带或者只有微弱的带，在68度多加5个循环。
最佳的延伸时间取决于扩增条带的长度。
如果片断的长度在2－5kb 的时候，经常使用4min，0.2-2kb的时候将延伸时间减到2－3min，对于5－10kb的条带，延伸时间增加到10min。
RACE技术-产物验证1、应该对RACE的片段进行验证,以此来确定是否已经扩增了理想的产物。
如果得到的是多条带或者研究的是多基因家族的成员，验证是非常有用的。
2、有3种验证RACE产物的方法：（1）比较由GSP和NGSP获得RACE产物。
（2）Southernblot（3）克隆并测序3、建议最好测得RACE产物的部分序列。
有的时候需要嵌套引物的存在。
比较由GSP和NGSP获得RACE产物。
4、对于5‘末端的RACE产物，比较由AP1和GSP1扩增出来的产物和由AP1和NGSP1扩增出来的产物。
5、对于3‘末端的RACE产物，比较由AP1和GSP2扩增出来的产物和由AP1和NGSP2扩增出来的产物。
这对于鉴定多条带是否是上一个PCR的特异性产物是非常有用的。
6、如果条带是正确的，在嵌套PCR反应中的条带应该是略微小一些。
基本PCR和嵌套PCR 产物的迁移率的不同取决于cDNA结构中GSP1和嵌套引物的位置。
RACE技术-克隆和测序1、可以利用胶回收试剂盒来回收RACE产物，此试剂盒适合回收2.5kb以下的RACE产物；对于长的片段，可以通过电洗脱获得好的结果。
如果你选择使用其他的纯化方法，最后用Tricine－EDTAbuffer30μl重新悬浮DNA样品。
2、电泳5μl回收的样品来鉴定回收的质量。
3、将回收的PCR产物直接克隆到/A型的PCR克隆载体中。
另外还可以利用接头和/或cDNA 合成引物中的Not1、Srf1、Xma1、ECOR1等酶切位点，将产物克隆到常规载体中。
4、对于5‘端的RACE产物，我们建议挑取至少8－10个不同的克隆以获得5‘端的最大可能性的序列。
（反转录并不总是进行到mRNA模板的5’末端，尤其是长模板。
另外，T4DNA聚合酶会移走5‘末端的0－20个碱基。
）5、一旦鉴定了含有插入片断的克隆，应该获得多的序列信息。
理想的是，可以对整个开放读码框进行测序。
包括5‘和3‘的非翻译区。
RACE技术-cDNA的获得RACE的扩增原理图通过部分或全部测序鉴定了RACE产物后，可以通过两种选择获得全长的cDNA。
通过PCR 和克隆的方法。
通过PCR的方法获得全长cDNA：1、扩增长的cDNA需要较长的延伸时间，但是如果延伸的时间过长，可以产生拖带，所以要慎重的设计引物。
2、根据从5‘和3‘RACE产物获得序列信息设计5’和3‘GSP引物。