酵母双杂交自激活现象
组蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及其自激活作用检测
人CDK2-AP1(DOC-1)酵母双杂交诱饵质粒自激活作用鉴定
Ｃ Ａ Ｏ Ｌ ｉ － ｘ ｕ ｅ Ｊ ｌ Ｎ Ｗ ｅ ｉ ， Ｚ Ｈ Ｅ ＮＧＪ ｕ ｎ ， Ｌ Ｉ Ｊ ｉ ａ ｎ — Ｄ ｅ ｐ ａ ｒ ｔ ｍ ｅ ｎ ｔ ｏ ｆＯ ｒ ａ ｌ ａ ｎ ｄ Ｍａ ｘ ｉ ｌ ｌ ｏ ｆ ａ ｃ ｉ ａ ｌ Ｓ ｕ ｒ ｇ ｅ ｒ ｙ ， Ｓ ｗｍ ａ ｔ ｏ ｌ ｏ ｇ ｉ ｃ ａ ｌ Ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ， Ｆ ｏ ｕ ｒ ｔ ｈ
ｈ ｙ ｂ ｉ ｒ ｄ ｓ ｖ ｓ ｔ ｅ ｍ ａ ｎ ｄ ｔ ｏ ｓ ｃ ｒ ｅ ｅ ｎ ｔ ｈ ｅ ｐ ｏｔ ｒ ｅ ｉ ｎ ｔ ｈ ａ ｔ ｉ ｎ ｔ ｅ ｒ ａ ｃ ｔ ｓ ｗ ｉ ｔ ｈ ｐ １ ２ Ｄ ０ ｃ 。 ‘ ｃ ０ Ｋ ２ ‘ Ａ Ｐ １Ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｓ Ｔ ｈ ｅ ｂ ａ ｉ ｔ ｐ ｌ ａ ｓ ｍｉ ｄ ｐ ＢＤ． Ｄ ＯＣ． １ ｗ ａ ｓ
倪 前伟 孙 沫逸 戴 建武 韩津 曹立 雪 金 伟 郑军 李建虎
【 摘要 】 目的 验证诱饵质粒 ｐ Ｂ Ｄ — Ｄ Ｏ Ｃ 一 １ 在酵母双杂 交系统 的 自 激 活性及毒性 作用 ， 为应用 酵母双杂交 系
统（ ｙ ｅ ａ ｓ ｔ ｔ ｗ ｏ — ｈ ｙ ｂ ｉ ｒ ｄ ｓ ｙ ｓ ｔ ｅ ｍ） 筛选与 ｐ １ ２ 。 ｃ Ｄ Ａ Ｐ 相互作用 的蛋 白建立实验基 础。方法 将诱饵质粒 ｐ Ｂ Ｄ — Ｄ Ｏ Ｃ 一 １ 转化到酵母细胞 ＭＡ Ｖ ２ ０ ３中， 检测诱饵蛋 白有无毒性和 自激 活作用 。同时利用 对照质粒组筛选 组氨酸 （ Ｈ ｉ ｓ ） 本 底 表达抑 制剂 ３ Ａ Ｔ（ ３ 一 氨 基． １ ， ２ ， ４ 一 三唑） 的合适 工 作浓 度 。结 果 诱 饵 质粒 ｐ Ｂ Ｄ ・ Ｄ Ｏ Ｃ — ｌ成 功转 化 到 酵母 细 胞 ＭＡ Ｖ ２ ０ ３中， 对宿 主酵母细胞无毒性 ， 对报告基 因无 自激 活作用 。确定 了组氨酸 （ Ｈｉ ｓ ） 本底 表达抑制 剂 ３ Ａ Ｔ（ ３ ・ 氨 基． １ ， ２ ， ４ ． 三唑 ） 的合适工作浓度。结论 诱饵 质粒 ｐ Ｂ Ｄ — Ｄ Ｏ Ｃ 一 １ 可 以用于酵母 双杂交实验 ， 为进一步运用酵。
酵母双杂（共转）
酵母双杂（共转）酵母双杂交的原理及实验步骤吴健2015.12.25一酵母双杂交的原理在酵母细胞中，有半乳糖存在的情况下，GAL4 可以激活半乳糖代谢酶GAL1的转录。
GAL4 蛋白包含两个结构域，单独的N 端的结构域(BD)可以特异地结合DNA 但是不能够激活转录；单独的C 端包含一个激活区域（AD）但是如果不能结合到17-mer 上游激活序列USA G 也不能激活转录。
将来自大肠杆菌的LecA DNA 结合域BD 和酵母的GAL4 转录激活域AD 重组后，在酵母中实现了下游基因的转录激活。
说明转录因子的BD 和AD 功能域可相互独立地发挥各自的作用，并且在重组后仍然具有基因转录的活性(Brent and Ptashne, 1985)。
酵母双杂交系统就是在这一分子基础上开发出来的，GAL4 的BD 和AD，分别与能够互作的蛋白X 和Y 融合表达。
由于XY 蛋白的结合，实现了GAL4 的BD 和AD 重组，GAL4 就重新获得了转录活性，转录因子就可以驱动报告基因表达(Fields and Song, 1989)。
除了将两个杂合载体BD-X 或AD-Y 转化入同一酵母细胞外，利用两个不同性别的酵母杂交（mating）也是实现BD 和AD 蛋白重组和蛋白互作检测的有效方法(Bendixen et al., 1994)。
Fig1. 酵母双杂原理图Fig2. 常用两种酵母菌的基因型Fig3. 常用两种酵母菌的报告基因Fig4. 常用AD和BD载体图Fig5. 酵母双杂流程图二酵母双杂交的基本步骤1 酵母感受态的制备配制培养酵母YPAD 培养基，以及筛选和转化酵母的SD 培养基，灭菌备用。
1) 用灭菌的接种环从保存的菌种中挑取一小块，在YPAD 培养基上划线分离单菌落，在30℃培养箱中倒置培养 3 d 活化菌种；2) 用灭菌的接种环挑取一个2-3 mm，生长时间小于一个月的单克隆到3 ml 的YPAD 培养基中，剧烈震荡1 min，打散所有的细胞块，30℃震荡培养8 h；3) 接种5 μl 的培养物到含有50 ml YPAD 的250 ml 的烧瓶中，30℃，250 r/min 震荡培养20 h，直到OD 600 =0.3；4) 700 g 室温离心5 min，去除上清，用100 ml 的YPAD 重悬细胞块，30℃230-250 r/min 震荡培养3-5 h，直到OD 600 =0.4-0.5；5) 700 g 室温离心5 min，去除上清，用60 ml 的灭菌的dd H2O 重悬细胞块；6) 700 g 室温离心5 min，去除上清，用3 ml 的1.1×TE/LiAc 溶液重悬细胞块；7) 将上清分装到2 个无菌的1.5 ml 的离心管，室温13200 g 离心15 sec；8) 去除上清，用600 μl 1.1×TE/LiAc 溶液悬浮细胞块，感受态制备完成。
蛋白的酵母双杂交实验原理及其应用
ds cDNA
在酵母体内利用同源重组 形成完整的质粒3、从cDNA筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白
方法1：将转化诱饵表达）进行mating，然后将mating产物涂SD/-Trp-Leu平 板。随后挑取直径在2-3mm的菌落划线接种在SD/-Ade-His-Trp-Leu/X-
GAL 1 UAS
Promoter
reporter gene
图1 转录因子活化示意图
目前使用的酵母双杂交系统有LexA系统和Gal4系统两种： 1、LexA系统。BD由一个完整的原核蛋白LexA构成，AD由一个88个aa的酸 性的大肠杆菌多肽B42构成，它在酵母中可以活化基因的转录；
2、Gal4系统。BD和AD分别由Gal4蛋白上不同的两个结构域（1-147aa与
HUA等人利用酵母双杂交技术，将所有已之间的联系，建 立基因组蛋白连锁图。对于认识一些重要的生命活动：如信号传导、代谢
途径等有重要意义。 Dyer等通过酵母双杂交技术，绘制出了人与致病性
细菌蛋白间相互作用的基因组蛋白网络连锁图，为深入研究人与致病菌间 的相互作用关系奠定了基础（见图4）。
、SD/-His-Trp/x-α-Gal、SD/-Trp-Leu/x-α-Gal平板上划线，观察
菌落的生长情况和颜色变化。 （2）毒性的检测
挑取一个直径2-3mm的克隆于5mL SD/-Trp液体培养基中培养过夜，
检测其OD600nm。若OD600nm≧0.8，表明没有毒性；若OD600nm＜0.8，表 明诱饵蛋白对酵母细胞有毒性。 只有当诱饵表达载体对报告基因无自激活作用，同时诱饵蛋白对宿 主细胞无毒性作用时才能用于酵母双杂交实验。否则只能重新构建诱饵 表达载体。
Synphilin-1，并证明了Synphilin-1 与alpha-synuclein 之间的相互作用与帕金森病的
酵母双杂实验操作手册和注意事项
酵母双杂（Yeast two-hybrid）实验操作手册和注意事项一. 酵母双杂的原理1989年，Song和Field建立了第一个基于酵母的细胞内检测蛋白间相互作用的遗传系统。
很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异结合域（DNA-binding domain，BD）与转录激活域（Transcriptional activation domain ，AD）。
这两个结构域各具功能，互不影响。
但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域,否则无法完成激活功能。
不同来源激活因子的BD区与AD结合后则特异地激活被BD结合的基因表达。
基于这个原理，可将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。
如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与BD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。
通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。
酵母双杂交系统由三个部分组成：(1)与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)。
(2)与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白(prey)。
(3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。
常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。
而菌株则具有相应的缺陷型。
双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。
这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。
根据目前通用的系统中BD来源的不同主要分为GAL4系统和LexA系统。
后者因其BD来源于原核生物，在真核生物内缺少同源性，因此可以减少假阳性的出现。
二.所用的载体及相关信息1. pGBKT7载体的图谱和相关信息The pGBKT7 vector expresses proteins fused to amino acids 1–147 of the GAL4 DNA binding domain (DNA-BD). In yeast, fusion proteins are expressed at high levels from the constitutive ADH1promoter (PADH1); transcription is terminated by the T7 and ADH1 transcription termination signals(TT7 & ADH1). pGBKT7 also contains the T7 promoter, a c-Myc epitope tag, and a MCS. pGBKT7replicates autonomously in both E. coli and S. cerevisiae from the pUC and 2 m ori, respectively. Thevector carries the Kan r for selection in E. coli and the TRP1 nutritional marker for selection in yeast.Yeast strains containing pGBKT7 exhibit a higher transformation efficiency than strains carrying other DNA-BD domain vectors (1).b. pGADT7载体的图谱和相关信息pGADT7-T encodes a fusion of the SV40 large T-antigen (a.a. 86–708) and the GAL4 AD (a.a. 768–881). The SV40 large T DNA (GenBank LocusSV4CG) was derived from a plasmid referenced in Li & Fields (1993) and was cloned into pGADT7 using the EcoR I and Xho I sites. pGADT7-T has not been sequenced.三．实验主要流程A.需要准备的药品和设备1.两种酵母菌种(AH109,Y187)2.酵母培养所需的药品: Yeast nitrogen base without amino acidsAgar (for plates only)sterile 10×Dropout Solution单缺-T,-L(clontech公司)二缺-T/-L (clontech公司)四缺-T/-L/-Ade/-His(clontech公司)3.酵母转化所需的药品: 10×TE buffer10×LiAc40%PEGcarrier DNA4.酵母显色所需要的药品: x- -GAL5.其他仪器设备: 30℃恒温培养箱30℃摇床.水浴锅分光光度计B．DNA-BD和DN-AD fusion protein 载体的分别构建。
酵母杂交实验常见问题——单杂知识及自激活检测篇
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DLX4基因酵母双杂交系统的构建及自激活检测
DLX4基因酵母双杂交系统的构建及自激活检测乔勤勤;孙云燕;陈玲玲;陆萌;丰有吉【摘要】目的构建DLX4酵母双杂交系统并鉴定其自激活作用.方法构建人胎盘酵母双杂交cDNA文库,并行PCR鉴定;构建3条DLX4诱饵质粒,包括pDEST32-DLX4(4-1C)、pDEST32-DLX4(4-1N)和pDEST32-DLX4(4-2);将DLX4诱饵质粒转入酵母MaV203菌株,并检测其在酵母细胞中有无自激活作用.结果 PCR证实成功构建了人胎盘酵母双杂交文库;3条DLX4诱饵质粒中,pDEST32-DLX4(4-2)和pDEST32-DLX4(4-1C)没有自激活作用,可用于文库筛选.结论成功构建了酵母双杂交文库和DLX4诱饵质粒,可用于筛选与DLX4相互作用的蛋白.【期刊名称】《上海交通大学学报（医学版）》【年(卷),期】2010(030)012【总页数】4页(P1509-1512)【关键词】DLX4;酵母双杂交;克隆【作者】乔勤勤;孙云燕;陈玲玲;陆萌;丰有吉【作者单位】上海交通大学附属第一人民医院妇产科,上海,200080;上海交通大学附属第一人民医院妇产科,上海,200080;上海交通大学附属第一人民医院妇产科,上海,200080;上海交通大学附属第一人民医院妇产科,上海,200080;上海交通大学附属第一人民医院妇产科,上海,200080【正文语种】中文【中图分类】R711.71DLX4属于同源异型盒转录因子家族，该家族典型的特征是包含由60个氨基酸组成的同源异型结构域(homeodomain)，此结构域能特异性地与DNA元件结合，激活或抑制下游基因的表达，从而实现其转录调控。
我们前期研究[1]显示，DLX4在子前期胎盘组织中的表达明显低于正常妊娠对照组，而且在缺氧培养的滋养细胞株中，其表达也显著降低。
DLX4在子前期中发生作用的信号通路目前尚不清楚，因而需要寻找与之相互作用的蛋白，为其功能的研究提供线索。
酵母双杂交技术1
发展背景
酵母双杂交系统是由Fields等在1989年提出的一种在活细 胞中鉴定蛋白质相互作用的遗传系统。
酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始
过程的认识。研究发现，许多真核生物的转录因子都是由 两个可以分开的、功能上相互独立的结构域组成的。
酵母双杂交系统是一种在酵母细胞内分析 蛋白质相互作用的技术。 它可用于： 检验蛋白质间的相互作用； 分析蛋白质相互作用的结构域； 发现新的作用蛋白质。
酵母双杂交技术的原理
基于对真核生物基因调控转录起始过程的认识。 基因转录不仅需要有特定的DNA顺式序列结构，而且也需 要有反式转录激活因子的参与。 转录激活因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构 成,其中有DNA结合结构域(DNA binding domain, DB)和转录激活 结构域(activation domain, AD), 它们都是能激活基因转录，但不同转录激活因子 的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。
酵母双杂交操作主要流程
1. 2. 3. 4. 5. 6. 分别构建BD和AD融合蛋白载体 分别将重组载体转化酵母菌细胞 对酵母转化子进行自激活检测 将重组载体共转化酵母菌细胞 检测报告基因表达产物 分析酵母双杂交实验结果
酵母双杂交技术的优点：
1. 是一种细胞内蛋白质相互作用研究技术，比体外的蛋白 质相互作用技术更接近生物体内的真实情况。
如果要研究两个蛋白之间有无相互作用，可以把这两 个蛋白分别与DB和AD形成的融合蛋白。 与DB 融合的蛋白称为“诱饵”(bait)， 与AD融合的蛋白称为“猎物”(prey)。 如果这两个蛋白能发生相互作用, 这两个融合蛋白上的 DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子, 从而激活报告 基因(reporter gene)的转录与表达。通过检测报告基因的 表达产物, 可判别“诱饵”和“猎物”这两个蛋白质之间是 否存在相互作用。