CRISPR操作-在线设计gRNA教程
基因编辑技术CRISPRCas9的详细操作步骤
基因编辑技术CRISPRCas9的详细操作步骤基因编辑技术CRISPR-Cas9是一种革命性的工具，能够精确切割和修改DNA 序列。
它已被广泛应用于实验室研究、农业、医学和生物技术领域。
CRISPR-Cas9的操作步骤分为设计目标序列、构建修饰体、细胞转染、筛选、验证等几个阶段。
以下是基因编辑技术CRISPR-Cas9的详细操作步骤：1. 设计目标序列首先，确定要编辑的基因序列。
识别目标区域，通常选择高度保守的DNA 区域，以最大程度减少非特异性修饰。
目标序列的设计需要遵循一些规则，例如避免重复、剪切酶的PAM序列靠近目标区域等。
2. 构建修饰体根据设计的目标序列，构建CRISPR修饰体。
修饰体通常由CRISPR核酸（包括crRNA或sgRNA）和Cas9核酸组成。
crRNA（或sgRNA）负责定位到目标序列，Cas9则负责剪切目标序列。
合成修饰体的DNA或RNA序列后，可以使用PCR扩增或化学合成的方法得到修饰体。
3. 细胞转染将构建好的修饰体转染至目标细胞中。
转染可以选择不同的方法，例如化学法、电穿孔法、超声波法或病毒载体等。
转染后，修饰体会逐渐进入目标细胞，并开始作用于基因组。
4. 筛选在转染后，大部分细胞仍然具有未被编辑的基因组。
为了筛选出完成编辑的细胞，可以使用筛选方法。
最常用的方法是通过引入荧光蛋白标记的修饰体，利用流式细胞术或显微镜检查标记的细胞。
5. 验证对于筛选出来的细胞，需要进行进一步的验证。
最常用的方法是通过测序确认基因组是否发生了预期的编辑。
此外，也可以使用T7E1酶切或限制性内切酶消化等方法，进一步验证编辑效果的准确性。
总结起来，基因编辑技术CRISPR-Cas9的详细操作步骤包括设计目标序列、构建修饰体、细胞转染、筛选和验证等几个阶段。
通过遵循这些步骤，研究人员可以实现对目标基因组的精确编辑，进而揭示基因功能、治疗遗传疾病，并在农业和生物技术领域开拓新的应用前景。
CRISPR基因编辑步骤详解
CRISPR基因编辑步骤详解基因编辑是一种通过修改DNA序列来改变有机体基因组的技术，CRISPR （Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）基因编辑技术则是近年来最受关注的一种基因编辑方法。
CRISPR技术不仅简单高效，还可以应用于多种生物体，包括人类，其广泛的应用前景使其成为生命科学领域的重要工具。
本文将详细介绍CRISPR基因编辑的步骤。
CRISPR基因编辑主要由以下几个步骤组成：选择目标基因，设计寡核苷酸，构建脱靶检测系统，编辑基因组，确认编辑效果。
首先，选择目标基因是进行基因编辑的关键步骤之一。
根据研究的需求和目标，科学家们需要仔细选择他们希望编辑的特定基因。
选择目标基因时，需要考虑基因功能和可能的突变对生物体的影响，以及基因的可编辑性等因素。
接下来，设计寡核苷酸是CRISPR基因编辑的重要步骤。
寡核苷酸通常有两种类型：RNA寡核苷酸（sgRNA）和单链DNA寡核苷酸（ssODN）。
sgRNA的作用是指导Cas9蛋白定位到目标基因上，而ssODN则是用于修复基因序列的片段。
因此，设计合适的寡核苷酸是确保编辑效果的关键。
构建脱靶检测系统是CRISPR基因编辑过程中一个重要的质控步骤。
由于CRISPR技术存在一定程度的脱靶效应，可能会对非目标基因进行修改，因此需要设计合适的方法来检测和排除这些脱靶效应。
常用的脱靶检测方法包括PCR扩增和DNA测序等。
编辑基因组是CRISPR技术的核心步骤。
一旦确定了目标基因和寡核苷酸的设计，科学家们就可以使用Cas9蛋白与sgRNA形成复合物，这个复合物会与目标基因的DNA序列配对，并引导Cas9蛋白在目标位点上产生双链切割。
这种双链切割会触发细胞内自然修复机制，从而导致基因组的编辑。
最后，确认编辑效果是CRISPR基因编辑中不可或缺的一步。
为了确定编辑效果，科学家们通常会使用一系列技术和方法来检测是否成功编辑了目标基因。
基因编辑技术CRISPRCas9的使用教程与最佳实践分享
基因编辑技术CRISPRCas9的使用教程与最佳实践分享在现代生物学研究中，基因编辑技术的出现为研究人员提供了一种高效、精确、低成本的方式来研究基因功能和调控机制。
CRISPR-Cas9系统作为一种革命性的基因编辑工具被广泛应用于基因组编辑、疾病治疗和农业改良等领域。
本文将为您介绍CRISPR-Cas9基因编辑技术的使用教程，并分享一些最佳实践。
CRISPR-Cas9基因编辑技术概述CRISPR-Cas9是一种依靠细菌天然的免疫机制发展而来的基因编辑技术。
CRISPR是一种特殊的DNA序列，可与Cas9酶一起，通过识别和切割DNA序列来精确编辑基因组。
CRISPR-Cas9系统的主要组成部分包括CRISPR RNA （crRNA）、转录单元结构化RNA（tracrRNA）和Cas9酶。
crRNA负责识别目标DNA序列，而tracrRNA将crRNA与Cas9酶结合起来形成活跃的CRISPR-Cas9复合物。
CRISPR-Cas9基因编辑技术的使用教程1. 设计并合成RNA引导序列在使用CRISPR-Cas9进行基因编辑之前，首先需要设计并合成RNA引导序列。
该序列用于指导Cas9酶精确识别和切割目标基因组DNA。
合成的RNA引导序列通常由crRNA和tracrRNA合成而成，也可以合成一个融合的single-guide RNA （sgRNA）。
2. 构建CRISPR-Cas9载体CRISPR-Cas9基因编辑需要将Cas9酶和RNA引导序列导入目标细胞内。
可使用载体如质粒或病毒进行基因编辑构建。
选择合适的载体需考虑目标细胞类型、转染效率和所需编辑范围等因素。
将Cas9基因和RNA引导序列克隆至载体后，可通过转染或病毒介导转染等方法将其导入目标细胞。
3. 确定编辑效果在导入CRISPR-Cas9系统后，使用分子生物学方法来验证编辑效果。
例如，PCR、测序、Western blot或免疫组化等技术可以用于检测目标基因的突变、修复或敲除效果。
CRISPR技术操作指南
CRISPR技术操作指南十年前，当研究人员开始解析细菌和古细菌中一个称为CRISPR 结构的时候，他们并没有预料到这会给基因编辑世界带来一场风暴。
在过去的这一年半时间里，CRISPR 方法已迅速席卷了整个动物王国，成为DNA 突变和编辑的一种“马上”技术——迄今为止在几乎每种实验细胞类型中都能起作用，包括人类细胞，小鼠，斑马鱼和果蝇细胞；这种技术也易于操作，已经有两个研究组利用CRISPR 分析了人类细胞中几乎每个基因单突变（详细报道Science：CRISPR/Cas9加速基因挖掘；Science：张峰建立CRISPR/Cas9人细胞敲除体系）。
就在最近，CRISPR 还帮助研究人员完成了携带特殊基因中断（gene disruptions）的工程猴，这项壮举此前曾在小鼠中实现过，但未在灵长类动物中完成过（详细报道Cell：中国科学家利用CRISPR/Cas9技术构建基因工程猴）。
CRISPR 本身是一种防御系统，用以保护细菌和古细菌细胞不受病毒的侵害。
在这些生物基因组中的CRISPR 位点能表达与入侵病毒基因组序列相匹配的小分子RNA。
当微生物感染了这些病毒中的一种，CRISPR RNA 就能通过互补序列结合病毒基因组，并表达CRISPR 相关酶，也就是Cas，这些酶都是核酸酶，能切割病毒DNA，阻止病毒完成其功能。
将CRISPR/Cas 系统用于其它非细菌细胞需要满足两个条件：一个Cas 酶，用于切断靶标DNA，比如目的基因中的DNA 片段，另外一个就是称为导向RNA （gRNA）的RNA 分子，这种分子能通过互补结合靶标。
gRNA 也就是细菌细胞中CRISPR RNA 的一个更短的版本，它能与Cas 形成复合物，指导Cas 到达正确的剪切位点。
不过研究人员也可以通过结合其它元件，或者改变Cas 活性，来调整这种工具在基因校正和基因调控方面的作用。
“目前，非传统基因编辑应用方面的生物学家利用一种新工具，分析细胞中，和整个生物机体中突变的作用”，来自加州大学伯克利分校的生物化学教授Jennifer Doudna 表示，她与她的同事解析了细菌细胞中CRISPR 的作用机制。
cas9 构建基因敲除细胞系 步骤
cas9 构建基因敲除细胞系步骤1. 设计gRNA序列需要设计合适的gRNA（guide RNA）序列。
gRNA是一种由RNA和DNA组成的分子，在CRISPR-Cas9系统中起到引导Cas9蛋白识别和切割目标DNA的作用。
gRNA序列应当与目标基因的特定区域互补，并且要避免与其他基因的序列相互匹配。
2. 合成gRNA和Cas9蛋白合成设计好的gRNA序列，并将其与Cas9蛋白结合。
Cas9蛋白是CRISPR-Cas9系统中的核酸酶，能够与gRNA一起识别目标DNA 序列，并在其靶向区域引发双链断裂。
3. 转染细胞将gRNA和Cas9蛋白复合物转染到目标细胞中。
转染可以使用多种方法，如化学法、电穿孔法或病毒载体介导的转染等。
转染后，gRNA和Cas9蛋白会进入细胞质，并寻找目标基因。
4. 筛选敲除细胞系根据需要敲除的基因，选择适当的筛选方法来鉴定敲除细胞系。
常用的筛选方法包括PCR、Western blot和细胞克隆等。
通过这些方法，可以检测到目标基因的敲除情况。
5. 确认敲除细胞系对筛选出的细胞系进行进一步的确认。
可以使用DNA测序技术对目标基因的敲除位点进行测序验证。
此外，还可以通过功能实验来验证目标基因的敲除效果。
6. 存储和维护敲除细胞系成功敲除目标基因后，需要对敲除细胞系进行存储和维护。
细胞系应当保存在液氮中，以确保其长期保存和使用的稳定性。
同时，细胞系也需要定期培养和检测，以确保其生长状态和敲除效果。
以cas9构建基因敲除细胞系的步骤包括设计gRNA序列、合成gRNA和Cas9蛋白、转染细胞、筛选敲除细胞系、确认敲除细胞系以及存储和维护敲除细胞系。
这些步骤需要在实验室中进行，确保操作的准确性和稳定性。
基因敲除细胞系的建立为研究基因功能和疾病机制提供了有力的工具，对于深入理解生命活动和疾病发生发展具有重要意义。
基因编辑技术CRISPR的应用与操作方法总结
基因编辑技术CRISPR的应用与操作方法总结引言：基因编辑技术是目前生命科学领域的热门研究方向，其中CRISPR是一种反应快速、经济高效的基因编辑技术，已经在各种生物学实验和疾病治疗研究中显示出巨大潜力。
本文将总结CRISPR技术的应用领域，并介绍其操作方法与关键步骤。
一、CRISPR技术的应用领域1. 基因功能研究：CRISPR技术可用于基因靶点的敲除、插入、替代以及突变等操作，帮助科学家们研究某基因或多个基因的功能。
通过CRISPR技术对基因进行编辑，可获得与其相关的生物学信息，了解基因对生物体内各种生理过程的调控机制。
2. 种群基因改良：CRISPR技术可以用于植物、动物以及微生物的种群基因改良，以改善其性状和适应性。
通过敲除或插入特定基因，科学家们能够培育出高产量、抗病性或耐逆性更强的作物品种，提高农作物产量和质量。
3. 疾病治疗：CRISPR技术为疾病治疗提供了新的可能性。
通过编辑患者的遗传物质，科学家们可以纠正某些与疾病相关的基因突变，以达到治疗的目的。
CRISPR技术已被应用于白血病、遗传性疾病等多个领域的研究和治疗实践中。
二、CRISPR技术的操作方法与关键步骤1. 设计sgRNA序列：首先，需要设计用于指导CRISPR-Cas9系统靶向特定基因序列的单导RNA（sgRNA），sgRNA是一段约20个碱基的RNA序列，用于配对目标序列。
sgRNA设计过程需要考虑目标基因序列的特异性和CRISPR系统的有效性。
2. 合成sgRNA和Cas9蛋白质：合成sgRNA后，还需要合成Cas9蛋白质，Cas9是CRISPR系统中的核酸内切酶，负责剪切目标基因的DNA序列。
3. 结合sgRNA和Cas9：将合成的sgRNA与Cas9蛋白结合，形成一个CRISPR-Cas9复合物，该复合物能够识别并结合到目标基因的DNA序列。
4. 导入CRISPR-Cas9复合物：将CRISPR-Cas9复合物导入到目标细胞中，使其能够在细胞内定位并与目标基因发生特异性的结合。
CRISPR流程
CRISPR流程
第二步是CRISPR系统的构建。
该步骤包括合成或克隆CRISPR组分，
包括Cas蛋白和RNA导向序列。
RNA导向序列是由用于选择性识别目标基
因的CRISPR RNA（crRNA）和传导RNA（tracrRNA）组成的复杂结构。
crRNA由科学家设计以与目标DNA序列互补，并激活Cas蛋白的切割功能。
第三步是导入CRISPR系统到靶细胞中。
这可以通过不同的方法实现，如细胞转染、病毒导入或基因递送系统。
将CRISPR组分导入到靶细胞后，它们将会在细胞内自组装形成功能性CRISPR复合物。
第四步是CRISPR组分的定位和识别目标基因。
当CRISPR复合物形成后，Cas9蛋白将与RNA导向序列结合并识别目标基因的DNA序列。
一旦
目标基因被定位，Cas9将通过其核酸内切酶活性剪切DNA，导致DNA双链
断裂。
第五步是DNA修复。
当DNA双链断裂时，细胞会尝试修复断裂，以恢
复DNA序列。
细胞有两种修复机制，即非同源末端连接（NHEJ）和同源重
组（HDR）。
NHEJ是一种错误修复机制，它导致插入或缺失DNA碱基，从
而导致目标基因的突变。
HDR是一种恢复准确DNA序列的修复方法，但它
需要提供一个同源的DNA模板。
crisprcas12流程
crisprcas12流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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CRISPR操作-gRNA设计教程
我们都知道一个基因（一个基因ID）往往可以编码多个转录本（多个NM 号），相应的也对应多个蛋白质（多个NP号）。
一条mRNA上编码蛋白质的区域称为CDS（coding sequence）。
一个基因产生的多个mRNA往往有部分区域是重叠的（图4a红框内的区域），这部分重叠的区域叫做保守的CDS （consensus CDS），简称CCDS。
我们通过基因组编辑破坏一个基因，往往需要破坏所有的mRNA编码的蛋白，因此，我们选择编辑的位点通常位于CCDS区域的上游位置（靠近起始密码子ATG的位置）。
编辑的目的是在CDS区域随机引入碱基的缺失或插入（indels），如此可以破坏三联密码子的阅读框，产生移码突变(图4b)。
图4CCDS和移码突变示意图。
a，方框代表外显子组织情况，黑色方框代表CDS区，红色框内是该基因对应的CCDS；b，移码突变。
一个T碱基的插入改变了阅读框，最终导致终止密码子的提前出现，蛋白质翻译提前终止。
移码突变往往导致蛋白质功能丧失。
SgRNA设计的站点介绍如下：
着重推荐Lei Stanley Qi Lab的
/index.jsp
（打不开请复制到浏览器地址栏）
这个在线站点功能比第一个丰富，可以选择基因编辑工具的其他用途
（激活，抑制基因表达等）（图5）。
下一步就是选择物种（图6）。
但只有常见的9种。
再下一步就是直接输入基因的名称（或序列）即可（图7）。
图5选择编辑类型
图6选择物种
图7选择基因名称。
我们以人的LDLR基因作为例子说明，输入“LDLR“，然后点击“CRISPR-ERA search”，会出来很多设计好的sgRNA（图8），ID编号#1-N（紫色框），后面一系列参数代表sgRNA对应的mRNA、基因组位置等。
绿色框里代表打分，简而言之是E+S分越高越好。
但这个不是很直观，我们可以切换到图示模式，请点击红色框的链接查看排名前50位的sgRNA在基因组上对应的位置（图9）。
图示模式是兼容在UCSC基因组浏览器中的，这一工具包含的信息特别丰富，大家可以自己探索探索其他好玩的功能。
图8LDLR设计的sgRNA页面图。
如图9所示，出来的sgDNA集中分布在距离ATG下游的第3和4个外显子中，我们可以选择打分优先靠前的#1，2，3号sgRNA。
对于做基因的敲除（KO）而言，强烈建议选择ATG下游通常100aa以内范围内的sgDNA 来用（比如图9中的#2，4，9等）；而且，一定要位于CCDS区域内（CCDS 是consensus CDS，即公共的CDS区域，是针对很多个转录本[isoforms]定义，图9中绿色条框即是。
这个很重要！！！如果默认不显示，需要在图示的下面设置一下，如图10）。
图9sgRNA在基因组上的相对各个外显子的位置。
注意对应基因的方
向和CCDS的位置。
图10注意高亮信息的设置。
●Feng Zhang lab：/。
这是最早的一个设计
站点。
包括常见的16个物种。
选中物种，把你要设计的区段序列扔到下面的框里运行就行。
但前提是你自己已经选好了位置（图11）。
图11
●还有其他，如omictools下面的Cas-Designer
/cas-designer/。
这个站点内容更加丰富，比如物种覆盖式最多的，包括植物，昆虫等等（图12左）。
这个站点也是输入目的基因的序列定制的，不同的是可以有较大的自由度选择位置预测。
图12
●还有一些商业公司的，比如Thermo下面的（图13）：
https:///crispr/index.html#/searc h
物种较少，商业性目的特别强，了解下即可。
图13
●手动版设计方法—好用不贵（可能保证不了特异性）
手动版本虽然费事，但有时候却会事半功倍，节约后续鉴定单克隆的成本。
经验表明脱靶也没有那么不堪，完全可以利用。
我们举例来说：
图14
序列中PAM和sgDNA的序列放大如下（前提是sgDNA位于CCDS区域，而且特异性要保证）：
也即，让Cas9切割位置（确定的）跨过一个酶切位点（比如sfcI）。
这样，在Cas9成功编辑靶序列产生indels的时候，酶切位点一定会遭到破坏。
这为后续的单克隆鉴定提供了便利。
请看示意图（图15）：
图15
注意一点：PCR引物设计的时候确保PCR片段内部不要出现第二个SfcI的酶切位点。
这样后面酶切的时候结果是唯一的。
实验流程和鉴定结果应该是这样的（图16）：
图16
对于WT，酶切是充分的，不会残留。
而对于成功编辑的两个mixture：*1和*2，由于产生了indels，部分sfcI的位点造到破坏，sfcI切不动的。
对于成功编辑的单克隆而言，应该是一点都切不动。
后续鉴定只要这样的克隆去测序即可（图17，红色编号为阳性克隆）。
图17
TA克隆测序结果（图18）：
图18
其他Cas9，比如Cpf1和saCas9的设计
因为以上介绍的站点没用涉及Cpf1和saCas9，特别是saCas9（非常适合AAV介导的载体基因编辑）。
http://crispr.cos.uni-heidelberg.de/index.html这个网站兼容几乎所有类型的Cas9设计。
打开页面，输入要编辑区域的基因组碱基序列，然后在PAM类型里选择
你需要的Cas9类型，比如spCas9，saCas9以及cpf1等。
其他条件默认设置即可，然后点击sunmit即可。
非常傻瓜式的操作（图19，20）
图19
图20。