紫外-可见分光光度法
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紫外可见分光光度法简介
紫外-可见分光光度法简介紫外-可见分光光度法(ultraviolet-visible spectrophotometry, UV-VIS)，它是利用物质的分子或离子对某一波长范围的光的吸收作用，对物质进行定性分析、定量分析及结构分析, 所依据的光谱是分子或离子吸收入射光中特定波长的光而产生的吸收光谱。
按所吸收光的波长区域不同，分为紫外分光光度法和可见分光光度法，合称为紫外-可见分光光度法。
紫外--可见分光光度法：是根据物质分子对波长为200-760nm这一范围的电磁波的吸收特性所建立起来的一种定性、定量和结构分析方法。
操作简单、准确度高、重现性好。
波长长（频率小）的光线能量小，波长短（频率大）的光线能量大。
分光光度测量是关于物质分子对不同波长和特定波长处的辐射吸收程度的测量。
吸收光谱描述物质分子对辐射吸收的程度随波长而变的函数关系曲线，称为吸收光谱或吸收曲线。
紫外-可见吸收光谱通常由一个或几个宽吸收谱带组成。
最大吸收波长（λmax）表示物质对辐射的特征吸收或选择吸收，它与分子中外层电子或价电子的结构（或成键、非键和反键电子）有关。
朗伯-比尔定律是分光光度法和比色法的基础。
这个定律表示：当一束具有I0强度的单色辐射照射到吸收层厚度为b，浓度为c的吸光物质时，辐射能的吸收依赖于该物质的浓度与吸收层的厚度。
其数学表达式为：式中的A 叫做吸光度；I0为入射辐射强度；I为透过吸收层的辐射强度；（I/I0）称紫藤为透射率T；ε是一个常数，叫做摩尔吸光系数，ε值愈大，分光光度法测定的灵敏度愈高。
紫外-可见分光光度计有稳定的、有足够输出功率的、能提供仪器使用波段的连续光谱，如钨灯、卤钨灯（波长范围350～2500纳米），氘灯或氢灯（180～460纳米），或可调谐染料激光光源等。
②单色器[1]。
它由入射、出射狭缝、透镜系统和色散元件（棱镜或光栅）组成，是用以产生高纯度单色光束的装置，其功能包括将光源产生的复合光分解为单色光和分出所需的单色光束。
紫外-可见分光光度法
30.01mg→100ml 5→50ml 浓度为30.01ug/ml
E=A / C C为100ml溶液中所含被测物质的重量 （按干燥品或无水物计算），g
（C = 0.003001g ×（1-水分）/ 100ml)
二.鉴别: 按各该品种项下的规定，测定供试品
溶液在有关波长处的最大及最小吸收，有 的并须测定其各最大吸收峰值或最大吸收 与最小吸收的比值，均应符合规定。
在高精度的分析测定中（紫外区尤其 重要），吸收池要挑选配对。因为吸收池 材料本身的吸光特征以及吸收池的光程长 度的精度等对分析结果都有影响。
玻璃吸收池因为能吸收紫外光，故只 能用于320nm以上的可见光区。
石英吸收池因不吸收紫外光而常用 于3０0nm以下的紫外光区，但也可用于 可见光区。
最常用的光路长度为: 1cm的吸收池。
表示方法：
（1）百分吸收系数（E）：
以
E 1% 1cm
表示。
E=A/C(%)×L(cm)
中国药典规定的吸收系数即为
E 1% 1cm
。
在用吸收系数法计算含量时，E11c%m 通常要
大于100
（2）摩尔吸收系数（ε）：
当溶液的浓度（C）为1mol/L,光路长 度（L）为1cm时，相应的吸光度为摩尔吸 收系数，以ε表示。
通常使用的紫外-可见分光光度计的工作波长 范围为190～900nm。
第二节 光吸收基本定律和吸收系数
1.光吸收基本定律： 比尔—郎伯（Beer—Lambert）定律
为光吸收基本定律，是分光光度分析的 理论基础。 Lambert于1730年提出了光 强度与吸收介质厚度的关系。1852年 Beer提出了光强度与吸收介质中吸光物 质浓度之间的关系。
光源为空心阴极灯。每种元素都 有各自的空心阴极灯，因此原子 吸收光谱是锐线光谱。
E=A / C C为100ml溶液中所含被测物质的重量 （按干燥品或无水物计算），g
（C = 0.003001g ×（1-水分）/ 100ml)
二.鉴别: 按各该品种项下的规定，测定供试品
溶液在有关波长处的最大及最小吸收，有 的并须测定其各最大吸收峰值或最大吸收 与最小吸收的比值，均应符合规定。
在高精度的分析测定中（紫外区尤其 重要），吸收池要挑选配对。因为吸收池 材料本身的吸光特征以及吸收池的光程长 度的精度等对分析结果都有影响。
玻璃吸收池因为能吸收紫外光，故只 能用于320nm以上的可见光区。
石英吸收池因不吸收紫外光而常用 于3０0nm以下的紫外光区，但也可用于 可见光区。
最常用的光路长度为: 1cm的吸收池。
表示方法：
（1）百分吸收系数（E）：
以
E 1% 1cm
表示。
E=A/C(%)×L(cm)
中国药典规定的吸收系数即为
E 1% 1cm
。
在用吸收系数法计算含量时，E11c%m 通常要
大于100
（2）摩尔吸收系数（ε）：
当溶液的浓度（C）为1mol/L,光路长 度（L）为1cm时，相应的吸光度为摩尔吸 收系数，以ε表示。
通常使用的紫外-可见分光光度计的工作波长 范围为190～900nm。
第二节 光吸收基本定律和吸收系数
1.光吸收基本定律： 比尔—郎伯（Beer—Lambert）定律
为光吸收基本定律，是分光光度分析的 理论基础。 Lambert于1730年提出了光 强度与吸收介质厚度的关系。1852年 Beer提出了光强度与吸收介质中吸光物 质浓度之间的关系。
光源为空心阴极灯。每种元素都 有各自的空心阴极灯，因此原子 吸收光谱是锐线光谱。
紫外-可见分光光度法测定
紫外-可见分光光度法测定1. 引言1.1 引言紫外-可见分光光度法是一种常用的分析化学方法，通常用于测定物质的浓度或测定物质的吸光度。
该方法利用紫外-可见光谱仪测量样品对紫外和可见光的吸收情况，从而推断样品中所含物质的浓度或结构。
在化学分析实验中，紫外-可见分光光度法具有灵敏度高、准确性高和简便易行的优点，因此被广泛应用于药物分析、环境监测、食品检测等领域。
本实验旨在通过该方法测定样品中目标物质的浓度，并探讨影响测定结果的因素。
通过对仪器原理、操作步骤、实验结果、数据分析和影响因素的详细讨论，我们将深入了解紫外-可见分光光度法的原理和应用，并为今后在相关领域的研究提供参考和借鉴。
希望本实验能够为我们提供更多关于分光光度法的实际操作经验，提升我们的实验技能和分析能力。
1.2 背景介绍紫外-可见分光光度法是一种广泛应用于化学分析领域的分析方法，通过测定物质在紫外-可见光区域的吸收特性，从而确定物质的浓度或者进行定性分析。
紫外-可见分光光度法具有操作简单、灵敏度高、选择性强的特点，被广泛应用于环境监测、食品安全检测、药品质量控制等领域。
随着科学技术的不断发展，紫外-可见分光光度法在实验室分析中扮演着越来越重要的角色。
通过测定物质在特定波长范围内的光吸收情况，我们可以获得关于物质性质的重要信息，如浓度、溶解度、稳定性等。
掌握紫外-可见分光光度法的原理和操作方法，对于提高实验准确性和效率具有重要意义。
在本文中，我们将介绍紫外-可见分光光度法的仪器原理、操作步骤、实验结果、数据分析和影响因素，希望能够为读者提供一份系统全面的紫外-可见分光光度法测定指南。
通过总结和展望，我们也希望能够进一步探讨该方法在化学分析领域的应用前景。
1.3 研究目的紫外-可见分光光度法是一种常用的分析化学技术，可以用于测定物质的吸光度，从而推断物质的浓度。
本实验的研究目的主要分为以下几点：1. 研究紫外-可见分光光度法在测定物质浓度方面的应用。
第二章 紫外-可见分光光度法
入射光通过溶液时，除一部分被吸光粒子吸收
外，还有部分因散射而损失，使透光度减小，
A实。所以往往发生正偏离。 • 化学因素引起的偏离 吸光物质常因离解、缔合而形成新化合物或 互变异构等化学变化而改变其浓度，导致了偏 离。例如 K2Cr2O7在水溶液中存在下列平衡：
2 2CrO4 Cr2O H 2O + 2 H 2 2 7 稀释或增大pH值 浓缩或减小pH值
如图所示，假设有一束强度为I0的单色平行
光，垂直通过一横面积为s的均匀介质。 当光强度为Ix的单色光通过
吸收层(db)后，光强度减弱
了dIx，则厚度为db的吸收
层对光的吸收率为-dIx/Ix，
另一方面，由于db为无限小，所以截面积上所有 吸光质点所占的面积之和(ds)与横截面积(s)之 比(ds/s)可视为该截面积上光子被吸收的几率， 即：-dIx/Ix=ds/s
降低由于单色光不纯造成负偏的方法： • 选择吸收曲线的max作入射光波长。因为吸收 曲线峰值顶部曲线较平坦，入射光谱带内各波长 的值相近。选择max，偏离光吸收定律较小。 只有当干扰物质存在并对待测物质的max产生
吸收时，才选择没干扰的其它波长作入射光波
长。
• 选择高分辨率仪器，使入射光波长范围尽可
5.传播速度c
c=· 单位：cm/s 二.微粒性 光的微粒性特征为：光由光子组成，而光子 具有能量，其能量与波长之间的关系为： E=h· =hc/ h—普朗克常数 6.626×10-34J· s 由上式可知，不同波长的光具有不同的能量， 波长愈长，光的能量愈低；反之，则愈高。
§2-2 分子光谱概述
若干个振动能级；在同一 电子能级和同一振动能级 中，因转动能量不同而分 为若干个转动能级。 若用E电、E振、E转分别表示三个能级， 则三者的关系为：E电＞E振＞E转。
外，还有部分因散射而损失，使透光度减小，
A实。所以往往发生正偏离。 • 化学因素引起的偏离 吸光物质常因离解、缔合而形成新化合物或 互变异构等化学变化而改变其浓度，导致了偏 离。例如 K2Cr2O7在水溶液中存在下列平衡：
2 2CrO4 Cr2O H 2O + 2 H 2 2 7 稀释或增大pH值 浓缩或减小pH值
如图所示，假设有一束强度为I0的单色平行
光，垂直通过一横面积为s的均匀介质。 当光强度为Ix的单色光通过
吸收层(db)后，光强度减弱
了dIx，则厚度为db的吸收
层对光的吸收率为-dIx/Ix，
另一方面，由于db为无限小，所以截面积上所有 吸光质点所占的面积之和(ds)与横截面积(s)之 比(ds/s)可视为该截面积上光子被吸收的几率， 即：-dIx/Ix=ds/s
降低由于单色光不纯造成负偏的方法： • 选择吸收曲线的max作入射光波长。因为吸收 曲线峰值顶部曲线较平坦，入射光谱带内各波长 的值相近。选择max，偏离光吸收定律较小。 只有当干扰物质存在并对待测物质的max产生
吸收时，才选择没干扰的其它波长作入射光波
长。
• 选择高分辨率仪器，使入射光波长范围尽可
5.传播速度c
c=· 单位：cm/s 二.微粒性 光的微粒性特征为：光由光子组成，而光子 具有能量，其能量与波长之间的关系为： E=h· =hc/ h—普朗克常数 6.626×10-34J· s 由上式可知，不同波长的光具有不同的能量， 波长愈长，光的能量愈低；反之，则愈高。
§2-2 分子光谱概述
若干个振动能级；在同一 电子能级和同一振动能级 中，因转动能量不同而分 为若干个转动能级。 若用E电、E振、E转分别表示三个能级， 则三者的关系为：E电＞E振＞E转。
紫外可见分光光度法简介
吸光度: 为透光度倒数的对数，用A表示， 即
A=lg1/T=lgI0/It
二、朗伯-比尔定律 朗伯-比尔定律：当一束平行单色光通过含有 吸光物质的稀溶液时，溶液的吸光度与吸光 物质浓度、液层厚度乘积成正比，即
A= κ cl 式中比例常数κ与吸光物质的本性，入射光 波长及温度等因素有关。c为吸光物质浓度，l 为透光液层厚度。
子时，可引起吸收峰的位移和吸收强度的改变，这些基团称为助 色团。如苯环的一个氢原子被一些基团取代后，苯环在254nm处 的吸收带的最大吸收位置和强度就会改变。
化合物 苯 氯苯 溴苯 苯酚 苯甲醚
取代基
max / nm 254
Cl 264
Br 262
OH 273
OCH3 272
m ax
300 320 325 1780 2240
1.定性分析 每一种化合物都有自己的特征光谱。测出未
知物的吸收光谱，原则上可以对该未知物作出定 性鉴定，但对复杂化合物的定性分析有一定的困 难。
2.纯度的鉴定 用紫外吸收光谱确定试样的纯度是比较方便
的。
如蛋白质与核酸的纯度分析中，可用 A280/A260的比值，鉴定其纯度。
3.结构分析 紫外-可见吸收光谱一般不用于化合物的
光源不是点光源，比色皿光径长度不一 致，光学元件的缺陷引起的多次反射等，均 造成光径不一致，从而与定律偏离。
紫外-可见分光光度计
一、主要部件的性能与作用 基本结构:
光源→单色器→吸收池→检测器→信号显示系统 ↑ 样品
1 光源
在紫外可见分光光度计中，常用的光源 有两类：热辐射光源和气体放电光源
热辐射光源用于可见光区，如钨灯和 卤钨灯；气体放电光源用于紫外光区，如 氢灯和氘灯。
结构分析，但利用紫外吸收光谱鉴定化合物 中的共轭结构和芳环结构还是有一定价值。
A=lg1/T=lgI0/It
二、朗伯-比尔定律 朗伯-比尔定律：当一束平行单色光通过含有 吸光物质的稀溶液时，溶液的吸光度与吸光 物质浓度、液层厚度乘积成正比，即
A= κ cl 式中比例常数κ与吸光物质的本性，入射光 波长及温度等因素有关。c为吸光物质浓度，l 为透光液层厚度。
子时，可引起吸收峰的位移和吸收强度的改变，这些基团称为助 色团。如苯环的一个氢原子被一些基团取代后，苯环在254nm处 的吸收带的最大吸收位置和强度就会改变。
化合物 苯 氯苯 溴苯 苯酚 苯甲醚
取代基
max / nm 254
Cl 264
Br 262
OH 273
OCH3 272
m ax
300 320 325 1780 2240
1.定性分析 每一种化合物都有自己的特征光谱。测出未
知物的吸收光谱，原则上可以对该未知物作出定 性鉴定，但对复杂化合物的定性分析有一定的困 难。
2.纯度的鉴定 用紫外吸收光谱确定试样的纯度是比较方便
的。
如蛋白质与核酸的纯度分析中，可用 A280/A260的比值，鉴定其纯度。
3.结构分析 紫外-可见吸收光谱一般不用于化合物的
光源不是点光源，比色皿光径长度不一 致，光学元件的缺陷引起的多次反射等，均 造成光径不一致，从而与定律偏离。
紫外-可见分光光度计
一、主要部件的性能与作用 基本结构:
光源→单色器→吸收池→检测器→信号显示系统 ↑ 样品
1 光源
在紫外可见分光光度计中，常用的光源 有两类：热辐射光源和气体放电光源
热辐射光源用于可见光区，如钨灯和 卤钨灯；气体放电光源用于紫外光区，如 氢灯和氘灯。
结构分析，但利用紫外吸收光谱鉴定化合物 中的共轭结构和芳环结构还是有一定价值。
第一章 紫外-可见分光光度法
➢ *跃迁：可以发生在任何具有不饱和键的 有机化合物分子中，其最大摩尔吸光系数max 很大。
➢ n*跃迁：发生在含有杂原子（O、N、S、P 、卤素等）的不饱和化合物中，其最大摩尔吸 光系数max 比较小。
二、常用术语
➢ *生色团：分子中可以吸收光子产生电子跃迁的基团 。含有键的不饱和基团
➢ *助色团：有些基团本身没有生色作用，但却能增强 生色团的生色能力，即它们与生色团相连时，会使其 吸收带最大吸收波长发生红移，并且增加其强度。通 常是带有非键电子对的杂原子的饱和基团，如-OH、 -NH2、-OR、-SH、-SR、-Cl、-Br、-I等。
不需参比液(消除了由于参比池的不同和制备空白溶液等产生 的误差)、克服了电源不稳而产生的误差，灵敏度高。
（4）光多道二极管阵列检测分光光度计
具有快速扫描的特点
可在0.1秒内获得190～ 820nm范围的全光光谱。 用于追踪化学反应的反应 动力学研究。 操作简单，只需将样品放 入无盖开放式样品室，并 点击“开始”即可。
音：
1 暗噪音：检测器与放大电路等各部件不确定性引起。
2 讯号噪音：亦称讯号散粒噪音 电子跃迁的不相等性
测量光强的不确定性
c 0.434K 1 1 c lgT T
➢ 当相对误差 c/c 最小时，求得T=0.368 或 A=0.4343。即当 A=0.4343 时，误差最小！
➢ 通常可通过调节溶液浓度或改变光程l 来控制 A 的读数在 0.2~0.7 范围内。
2. 杂散光 从单色器得到的单色光中与所需波长相 隔较远的光。
3. 散射光与反射光 使透光强度减弱 ，吸光度值偏高。
4. 非平行光 使l 增大影响测量值
（三）透光率测量误差T
由于光源不稳定性、读数不准等带来的误差。
紫外可见分光光度法
ΔT =1%, 溶液浓度相对误差Δc/c 与其透光度T 的关系曲线如右图。
由图可见ΔT =1%, T 在20%～ 65%之间时, 浓度相对误差较小, 此为 最佳读数范围。
所以要求选择适宜的吸光度范围 （0.2-0.7）, 以使测量结果的误差最 小。
2024/10/5
措施: （a）控制溶液的浓度；（b） 选择不同厚度的比色
2024/10/5
2
溶液颜色与光吸收的关系
当一束太阳光照射某一溶液时, 太阳光中某一颜色的光 被吸收, 其互补色光透过溶液, 刺激人的眼睛, 使人感觉到它 的颜色。
实例:
1)高锰酸钾吸收绿光显紫 红色；
2)重铬酸钾吸收蓝光显黄 色；
3)邻菲罗啉铁溶液吸收蓝 绿光显红色。
2024/10/5
可见光波长及其互补光
(如国产710型，730型)； 3.双波长双光束分光光度计
(如国产WFZ800-5型）
2024/10/5
20
紫外可见分光光度的使用
2024/10/5
21
2024/10/5
22
721分光光度计操作步骤
➢ 1.预热仪器。为使测定稳定, 将电源开关打开, 使仪器预热20min, 为了防止光电管疲劳, 不要连续光照。预热仪器和不测定时应将比 色皿暗箱盖打开, 使光路切断。
ε: 摩尔吸收系数，单位L·mol -1·cm-1。（讲解78页 例题）
摩尔吸收系数越大表明该物质的吸光能力越强，用光度法测
定该物质的灵敏度越高。
ε > 105: 超高灵敏；
ε = (6～10）×104 : 高灵敏；
ε < 2×104
: 不灵敏。
2024/10/5
10
吸光度的加和性
由图可见ΔT =1%, T 在20%～ 65%之间时, 浓度相对误差较小, 此为 最佳读数范围。
所以要求选择适宜的吸光度范围 （0.2-0.7）, 以使测量结果的误差最 小。
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措施: （a）控制溶液的浓度；（b） 选择不同厚度的比色
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2
溶液颜色与光吸收的关系
当一束太阳光照射某一溶液时, 太阳光中某一颜色的光 被吸收, 其互补色光透过溶液, 刺激人的眼睛, 使人感觉到它 的颜色。
实例:
1)高锰酸钾吸收绿光显紫 红色；
2)重铬酸钾吸收蓝光显黄 色；
3)邻菲罗啉铁溶液吸收蓝 绿光显红色。
2024/10/5
可见光波长及其互补光
(如国产710型，730型)； 3.双波长双光束分光光度计
(如国产WFZ800-5型）
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紫外可见分光光度的使用
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721分光光度计操作步骤
➢ 1.预热仪器。为使测定稳定, 将电源开关打开, 使仪器预热20min, 为了防止光电管疲劳, 不要连续光照。预热仪器和不测定时应将比 色皿暗箱盖打开, 使光路切断。
ε: 摩尔吸收系数，单位L·mol -1·cm-1。（讲解78页 例题）
摩尔吸收系数越大表明该物质的吸光能力越强，用光度法测
定该物质的灵敏度越高。
ε > 105: 超高灵敏；
ε = (6～10）×104 : 高灵敏；
ε < 2×104
: 不灵敏。
2024/10/5
10
吸光度的加和性
第十一章 紫外-可见分光光度法
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分子中价电子能级及跃迁示意图
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→* →* n→* n→*
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轨道和轨道示意图
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C
C
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C
C
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–
CC
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–
+
+
CC
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共轭双键的离域作用
４
*
３
*
最高空轨道
E>E →跃迁几率↑→↑ ； E↓→↑
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11.1.2 紫外-可见吸收光谱中的常用术语
• 吸收光谱的特征 • 生色团和助色团 • 红移与蓝(紫)移 • 增色效应和减色效应 • 强带和弱带 强带(strong band) max>104
弱带(weak band) max<102
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吸收光谱(absorption spectrum)的特征
吸收峰 末端吸收A(end abso↓rption)
谷
肩峰(shoulder peak)
↓
吸收峰
↓ 谷
↓
min max sh
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min max λ
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及转化等实验中需要一定的浓度和纯度要求，因此要测定DNA的浓度和纯度。
• 组成DNA的碱基均具有一定的吸收紫外线特性，最大吸收值在波长为250～270nm之间，腺嘌呤
的最大紫外线吸收值在260.5nm，胞嘧啶：267nm，鸟嘌呤：276nm，胸腺嘧啶：264.5nm，尿嘧啶： 259nm。这些碱基与戊糖、磷酸形成核苷酸后其最大吸收峰不会改变，但核酸的最大吸收波长是 260nm，吸收低谷在230nm。这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。在波长260nm紫外线 下，10OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA或RNA为40μg/ml；单链寡聚核 苷酸为20μg/ml。可以此来计算核酸样品的浓度。 分光光度法不但能够确定核酸的浓度，还可以通过测定在260nm和280nm的紫外线吸收值的比值 （A260/A280）估计核酸的纯度。DNA的比值为1.8，RNA的比值为2.0。若DNA比值高于1.8，说 明制剂中RNA尚未除尽。RNA、DNA溶液中含有酚和蛋白质将导致比值降低。270nm存在高吸收 表明有酚的干扰。当然也会出现既含蛋白质又含RNA的DNA溶液比值为1.8的情况，所以有必要 结合凝胶电泳等方法鉴定有无RNA，或用测定蛋白质的方法检测是否存在蛋白质。紫外分光光度 法只用于测定浓度大于0.25μg/ml的核酸溶液。
• Tips：当A260/ A280比值<1.9时，该样品可适当稀释，用饱和的酚、
氯仿、异戊醇抽一次，再用无水乙醇沉淀、抽干。
• 当A260/ A280比值大于2时，则RNA浓度过高，要去RNA
谢谢聆听
Thanks
• c为100ml溶液中所含物质的重量（按干燥品或无水物计算），g； • l（L）为液层厚度，cm。 • 上述公式中吸收系数也可以摩尔吸收系数ε来表示，其物理意义为溶液浓度c为1mol/L和液层厚度
为1cm时的吸光度数值。在最大吸收波长处摩尔吸收系数表示为εmax。
• 物质对光的选择性吸收波长，以及相应的吸收系数是该物质的物理常数。在一定条件下，物质的
分光光度计使用方法
Use method of spectrophotometer
分光光度计使用方法
①选取合适的按键
• • • •
待测定样品为dsDNA（如PCR产物），按下键“7/dsDNA”
待测定样品为ssDNA（如反转录合成的第一链cDNA产物），按下键“8/ssDNA”
待测定样品为RNA，按下键“9/RNA” 待测定样品为Oligo（如PCR引物），按下键“6/Oligo”。
紫外验原理
• 紫外-可见分光光度法是在190～800nm波长范围内测定物质的吸光度，用于
鉴别、杂质检查和定量测定的方法。当光穿过被测物质溶液时，物质对光 的吸收程度随光的波长不同而变化。因此，通过测定物质在不同波长处的 吸光度，并绘制其吸光度与波长的关系图即得被测物质的吸收光谱。从吸 收光谱中，可以确定最大吸收波长λmax和最小吸收波长λmin。物质的吸收 光谱具有与其结构相关的特征性。因此，可以通过特定波长范围内样品的 光谱与对照光谱或对照品光谱的比较，或通过确定最大吸收波长，或通过 测量两个特定波长处的吸收比值而鉴别物质。用于定量时，在最大吸收波 长处测量一定浓度样品溶液的吸光度，并与一定浓度的对照溶液的吸光度 进行比较或采用吸收系数法求算出样品溶液的浓度。
仪器分类
• 依据光谱区，分光光度计可分为：紫外分光
光度计，可见分光光度计（或比色计）、红 外分光光度计。如果吸光质点是原子，其仪 器称为原子吸收分光光度计。
• 仪器组成 • 各种分光光度计的基本组成是：光源系统、
分光系统、吸收系统和检测系统。
• 仪器精度 • 为保证测量的精密度和准确度，所有仪器应
吸收系数是恒定的，且与入射光的强度、吸收池厚度及样品浓度无关。当已知某纯物质在一定条 件下的吸收系数后，可用同样条件将该供试品配成溶液，测定其吸光度，即可由上式计算出供试 品中该物质的含量。在可见光区，除某些物质对光有吸收外，很多物质本身并没有吸收，但可在 一定条件下加入显色试剂或经过处理使其显色后再测定，故又称之为比色分析。
操作步骤
• 吸取5µ L DNA样品或4µ L RNA样品，加水至1ml混匀后，转入分光光度计的石英比
色杯中。如果样品很少，可以用0.5ml的比色杯，上述核酸样品与水的用量缩小一 半。 先用1ml水对分光光度计校正为零点。 在260nm和280nm分别读出光密度，DNA样品的浓度OD260 × 核酸稀释倍数 × 50/1000；RNA样品的浓度OD260 × 核酸稀释倍数 × 40/1000；浓度单位为μg/µ L。 按步骤1的稀释方式，DNA或RNA的浓度（μg/µ L）均为OD260的10倍；如OD260 为0.1，则样品的浓度就为1μg/µL DNA或RNA。这样稀释倍数非常便于计算。 若为DNA样品，OD260/OD280比值大于1.8，说明仍存在RNA，可以考虑用RNA酶 处理样品；小于1.6，说明样品中存在蛋白质或酚，应再用酚/氯仿抽提，用乙醚抽 提后，以乙醇沉淀纯化DNA。RNA样品OD260/OD280比值小于2，也应该考虑再 用酚/氯仿抽提。
按照国家计量检定规程，定期进行校正检定。
分光光度法测定DNA的浓度和纯 度
Determination of DNA concentration and purity by spectrophotometry
分光光度法测定DNA的浓度和纯度
• 在实验过程中，很多时候提取得到的DNA的浓度和纯度都是未知的，在后续的DNA酶切、连接
②将空白对照置入样品孔。
• 注意：空白对照是空白液，并非所有情况都是水。例如，用Tris溶液溶解DNA样
品，则要用Tris液做空白对照。
分光光度计使用方法
• ③按下 “Blank”键。仪器记录空白对照，设置为0.000A。 • ④将样品置入样品孔，按下“Sample”键，仪器显示样品的吸光度
和浓度值，以及其他相关参考比值。
• 单色光辐射穿过被测物质溶液时，在一定的浓度范围内被该物质吸收的量与该物质的浓度和液层
的厚度（光路长度）成正比，其关系可以用朗伯-比尔定律表述如下：
• • • •
A=lg 1/T=Ecl
A为吸光度； T为透光率； E为吸收系数，常用的表示方法 ，其物理意义为当溶液浓度为1%（g/ml）,液层厚度为1cm时的吸 光度数值；
• 组成DNA的碱基均具有一定的吸收紫外线特性，最大吸收值在波长为250～270nm之间，腺嘌呤
的最大紫外线吸收值在260.5nm，胞嘧啶：267nm，鸟嘌呤：276nm，胸腺嘧啶：264.5nm，尿嘧啶： 259nm。这些碱基与戊糖、磷酸形成核苷酸后其最大吸收峰不会改变，但核酸的最大吸收波长是 260nm，吸收低谷在230nm。这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。在波长260nm紫外线 下，10OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA或RNA为40μg/ml；单链寡聚核 苷酸为20μg/ml。可以此来计算核酸样品的浓度。 分光光度法不但能够确定核酸的浓度，还可以通过测定在260nm和280nm的紫外线吸收值的比值 （A260/A280）估计核酸的纯度。DNA的比值为1.8，RNA的比值为2.0。若DNA比值高于1.8，说 明制剂中RNA尚未除尽。RNA、DNA溶液中含有酚和蛋白质将导致比值降低。270nm存在高吸收 表明有酚的干扰。当然也会出现既含蛋白质又含RNA的DNA溶液比值为1.8的情况，所以有必要 结合凝胶电泳等方法鉴定有无RNA，或用测定蛋白质的方法检测是否存在蛋白质。紫外分光光度 法只用于测定浓度大于0.25μg/ml的核酸溶液。
• Tips：当A260/ A280比值<1.9时，该样品可适当稀释，用饱和的酚、
氯仿、异戊醇抽一次，再用无水乙醇沉淀、抽干。
• 当A260/ A280比值大于2时，则RNA浓度过高，要去RNA
谢谢聆听
Thanks
• c为100ml溶液中所含物质的重量（按干燥品或无水物计算），g； • l（L）为液层厚度，cm。 • 上述公式中吸收系数也可以摩尔吸收系数ε来表示，其物理意义为溶液浓度c为1mol/L和液层厚度
为1cm时的吸光度数值。在最大吸收波长处摩尔吸收系数表示为εmax。
• 物质对光的选择性吸收波长，以及相应的吸收系数是该物质的物理常数。在一定条件下，物质的
分光光度计使用方法
Use method of spectrophotometer
分光光度计使用方法
①选取合适的按键
• • • •
待测定样品为dsDNA（如PCR产物），按下键“7/dsDNA”
待测定样品为ssDNA（如反转录合成的第一链cDNA产物），按下键“8/ssDNA”
待测定样品为RNA，按下键“9/RNA” 待测定样品为Oligo（如PCR引物），按下键“6/Oligo”。
紫外验原理
• 紫外-可见分光光度法是在190～800nm波长范围内测定物质的吸光度，用于
鉴别、杂质检查和定量测定的方法。当光穿过被测物质溶液时，物质对光 的吸收程度随光的波长不同而变化。因此，通过测定物质在不同波长处的 吸光度，并绘制其吸光度与波长的关系图即得被测物质的吸收光谱。从吸 收光谱中，可以确定最大吸收波长λmax和最小吸收波长λmin。物质的吸收 光谱具有与其结构相关的特征性。因此，可以通过特定波长范围内样品的 光谱与对照光谱或对照品光谱的比较，或通过确定最大吸收波长，或通过 测量两个特定波长处的吸收比值而鉴别物质。用于定量时，在最大吸收波 长处测量一定浓度样品溶液的吸光度，并与一定浓度的对照溶液的吸光度 进行比较或采用吸收系数法求算出样品溶液的浓度。
仪器分类
• 依据光谱区，分光光度计可分为：紫外分光
光度计，可见分光光度计（或比色计）、红 外分光光度计。如果吸光质点是原子，其仪 器称为原子吸收分光光度计。
• 仪器组成 • 各种分光光度计的基本组成是：光源系统、
分光系统、吸收系统和检测系统。
• 仪器精度 • 为保证测量的精密度和准确度，所有仪器应
吸收系数是恒定的，且与入射光的强度、吸收池厚度及样品浓度无关。当已知某纯物质在一定条 件下的吸收系数后，可用同样条件将该供试品配成溶液，测定其吸光度，即可由上式计算出供试 品中该物质的含量。在可见光区，除某些物质对光有吸收外，很多物质本身并没有吸收，但可在 一定条件下加入显色试剂或经过处理使其显色后再测定，故又称之为比色分析。
操作步骤
• 吸取5µ L DNA样品或4µ L RNA样品，加水至1ml混匀后，转入分光光度计的石英比
色杯中。如果样品很少，可以用0.5ml的比色杯，上述核酸样品与水的用量缩小一 半。 先用1ml水对分光光度计校正为零点。 在260nm和280nm分别读出光密度，DNA样品的浓度OD260 × 核酸稀释倍数 × 50/1000；RNA样品的浓度OD260 × 核酸稀释倍数 × 40/1000；浓度单位为μg/µ L。 按步骤1的稀释方式，DNA或RNA的浓度（μg/µ L）均为OD260的10倍；如OD260 为0.1，则样品的浓度就为1μg/µL DNA或RNA。这样稀释倍数非常便于计算。 若为DNA样品，OD260/OD280比值大于1.8，说明仍存在RNA，可以考虑用RNA酶 处理样品；小于1.6，说明样品中存在蛋白质或酚，应再用酚/氯仿抽提，用乙醚抽 提后，以乙醇沉淀纯化DNA。RNA样品OD260/OD280比值小于2，也应该考虑再 用酚/氯仿抽提。
按照国家计量检定规程，定期进行校正检定。
分光光度法测定DNA的浓度和纯 度
Determination of DNA concentration and purity by spectrophotometry
分光光度法测定DNA的浓度和纯度
• 在实验过程中，很多时候提取得到的DNA的浓度和纯度都是未知的，在后续的DNA酶切、连接
②将空白对照置入样品孔。
• 注意：空白对照是空白液，并非所有情况都是水。例如，用Tris溶液溶解DNA样
品，则要用Tris液做空白对照。
分光光度计使用方法
• ③按下 “Blank”键。仪器记录空白对照，设置为0.000A。 • ④将样品置入样品孔，按下“Sample”键，仪器显示样品的吸光度
和浓度值，以及其他相关参考比值。
• 单色光辐射穿过被测物质溶液时，在一定的浓度范围内被该物质吸收的量与该物质的浓度和液层
的厚度（光路长度）成正比，其关系可以用朗伯-比尔定律表述如下：
• • • •
A=lg 1/T=Ecl
A为吸光度； T为透光率； E为吸收系数，常用的表示方法 ，其物理意义为当溶液浓度为1%（g/ml）,液层厚度为1cm时的吸 光度数值；