酶的分子修饰-2012
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酶分子的化学修饰
第五章
酶分子的化学修饰
酶分子化学修饰就是在分子水平上 对酶进行改造，以达到改构和改性的目 的。在体外将酶分子通过人工的方法与 一些化学物质，特别是一些有生物相容 性的物质进行共价连接，从而改变酶的 结构和性质。这些化学物质称为修饰试 剂，酶化学修饰主要用于基础酶学的研 究和疾病治疗。
酶化学修饰的应用领域
例如用聚乙二醇共价修饰超氧化物歧化 酶（SOD），不仅可以降低或消除酶的抗 原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延 长了半衰期，从而提高了药效。
PEG是线性大分子，具有良好的生物相容 性和水溶性，在体内无毒性、无残留、 无免疫原性，并可消除酶分子的抗原性， 被广泛用于酶的修饰。
PEG末端活化后可以与酶产生交联，使酶 分子被覆盖上一层疏松的亲水外壳，导 致动力学发生改变，从而产生许多有用 的性质，如可以在广泛的pH范围内溶解、 不被离子交换剂吸附，电泳迁移率下降 等。
加酶液
E E E
S
P
图：反相胶团的结构和酶的分布
二、酶分子的内部修饰 （一）非催化活性基团的修饰：通过对 非催化残基的修饰可以改变酶的动力学 性质，改变酶对特殊底物的亲和力；
（二）酶蛋白主链的修饰：主要是靠酶 法进行修饰，用蛋白酶对主联进行部分 水解，可以改变酶的催化特性。
（三）催化活性基团的修饰：通过选择 性修饰催化活性氨基酸的侧链来实现氨 基酸残基的取代，使一种氨基酸侧链转 化为另一种氨基酸侧链，这种方法又称 为化学突变法。
46
40 20 50 0
64
90 99 95 80
二、抗原性：修饰酶的抗原性与修饰剂 有关，目前比较公认的是PEP和人血清白 蛋白在消除酶分子抗原性方面效果较好。
修饰酶的抗原性变化
酶
胰蛋白酶 过氧化氢酶 Arg 酶
酶分子的化学修饰
酶分子化学修饰就是在分子水平上 对酶进行改造，以达到改构和改性的目 的。在体外将酶分子通过人工的方法与 一些化学物质，特别是一些有生物相容 性的物质进行共价连接，从而改变酶的 结构和性质。这些化学物质称为修饰试 剂，酶化学修饰主要用于基础酶学的研 究和疾病治疗。
酶化学修饰的应用领域
例如用聚乙二醇共价修饰超氧化物歧化 酶（SOD），不仅可以降低或消除酶的抗 原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延 长了半衰期，从而提高了药效。
PEG是线性大分子，具有良好的生物相容 性和水溶性，在体内无毒性、无残留、 无免疫原性，并可消除酶分子的抗原性， 被广泛用于酶的修饰。
PEG末端活化后可以与酶产生交联，使酶 分子被覆盖上一层疏松的亲水外壳，导 致动力学发生改变，从而产生许多有用 的性质，如可以在广泛的pH范围内溶解、 不被离子交换剂吸附，电泳迁移率下降 等。
加酶液
E E E
S
P
图：反相胶团的结构和酶的分布
二、酶分子的内部修饰 （一）非催化活性基团的修饰：通过对 非催化残基的修饰可以改变酶的动力学 性质，改变酶对特殊底物的亲和力；
（二）酶蛋白主链的修饰：主要是靠酶 法进行修饰，用蛋白酶对主联进行部分 水解，可以改变酶的催化特性。
（三）催化活性基团的修饰：通过选择 性修饰催化活性氨基酸的侧链来实现氨 基酸残基的取代，使一种氨基酸侧链转 化为另一种氨基酸侧链，这种方法又称 为化学突变法。
46
40 20 50 0
64
90 99 95 80
二、抗原性：修饰酶的抗原性与修饰剂 有关，目前比较公认的是PEP和人血清白 蛋白在消除酶分子抗原性方面效果较好。
修饰酶的抗原性变化
酶
胰蛋白酶 过氧化氢酶 Arg 酶
酶分子修饰
Mg2+，Mn2+，Zn2+，Co2+，Cu2+，Fe2+等。金属离子置
换修饰只适用于本来在结构中含金属离子的酶。
6
一、金属离子置换修饰的方法
1、酶的分离纯化：将需修饰的酶进行分离纯化，获
得具有一定纯度的酶液。
2、除去原有的金属离子：在纯化的酶液中加入一定
量的金属螯合剂，与酶分子中的金属离子形成螯合物，
乙醛等进行分子内交联修饰；还可以利用水溶性大分子
与酶的侧链基团共价结合进行大分子结合修饰。
22
2）核酸类酶的侧连基团：指组成RNA的核苷酸残基
上的功能团。主要是核糖2’-位置上的羟基和嘌呤、嘧啶
碱基上的氨基和羟基。
通过侧连基团的修饰，提高R酶的稳定性，扩展其催
化功能，提高酶的催化效率。
23
一、氨基修饰
第五章 酶分子修饰
定义：通过各种方法使酶分子结构发生某些改变，
从而改变酶的某些特性和功能的过程。
天然酶在应用中的限制因素：
1）酶的活性、作用专一性和作用最适条件常不能
适应生产工艺的要求；
2）酶是蛋白质，容易变性失效，一般经不起高温、
强酸、强碱、有机溶剂以及时间等的考验；
3）注入人体内，作为异体蛋白，有难于吸收、易
17
❖
聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无
毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活
化后可以与酶产生交联，因而，它被广泛用于酶的修饰。
酶
半衰期
相对稳定性
天然SOD
6
min
1
右旋糖酐-SOD
7
h
70
Ficoll(低分子量)–SOD
换修饰只适用于本来在结构中含金属离子的酶。
6
一、金属离子置换修饰的方法
1、酶的分离纯化：将需修饰的酶进行分离纯化，获
得具有一定纯度的酶液。
2、除去原有的金属离子：在纯化的酶液中加入一定
量的金属螯合剂，与酶分子中的金属离子形成螯合物，
乙醛等进行分子内交联修饰；还可以利用水溶性大分子
与酶的侧链基团共价结合进行大分子结合修饰。
22
2）核酸类酶的侧连基团：指组成RNA的核苷酸残基
上的功能团。主要是核糖2’-位置上的羟基和嘌呤、嘧啶
碱基上的氨基和羟基。
通过侧连基团的修饰，提高R酶的稳定性，扩展其催
化功能，提高酶的催化效率。
23
一、氨基修饰
第五章 酶分子修饰
定义：通过各种方法使酶分子结构发生某些改变，
从而改变酶的某些特性和功能的过程。
天然酶在应用中的限制因素：
1）酶的活性、作用专一性和作用最适条件常不能
适应生产工艺的要求；
2）酶是蛋白质，容易变性失效，一般经不起高温、
强酸、强碱、有机溶剂以及时间等的考验；
3）注入人体内，作为异体蛋白，有难于吸收、易
17
❖
聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无
毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活
化后可以与酶产生交联，因而，它被广泛用于酶的修饰。
酶
半衰期
相对稳定性
天然SOD
6
min
1
右旋糖酐-SOD
7
h
70
Ficoll(低分子量)–SOD
《酶分子的修饰》课件
糖基化修饰通常发生在酶的特定氨基酸残基上，形成N-连 接或O-连接的糖链。糖基化修饰在多种生物学过程中发挥 重要作用，如蛋白质分选和分泌。
酶的甲基化修饰
甲基化修饰是指将甲基基团加到酶分子上的过程，通常由甲基转移酶催化。甲基 化修饰可以改变酶的活性、稳定性、定位和与其他分子的相互作用。
甲基化修饰常见于DNA、RNA和蛋白质中。在蛋白质甲基化过程中，甲基转移 酶将甲基基团加到蛋白质特定氨基酸残基上，影响蛋白质功能和稳定性。
酶分子修饰与疾病发生发展
酶分子修饰与多种疾病的发生 和发展密切相关，如肿瘤、神 经退行性疾病、心血管疾病等
。
酶分子修饰可以影响细胞代 谢、细胞周期、细胞凋亡等 生物学过程，从而影响疾病
的发展进程。
深入了解酶分子修饰在疾病发 生发展中的作用，有助于发现 新的治疗靶点，为疾病治疗提
供新的策略和方法。
酶分子修饰与药物研发
酶分子修饰是药物研发的重要靶点之一，通过调节酶的活性可以设计出具有特定治 疗作用的药物。
酶分子修饰在药物研发中具有广阔的应用前景，如开发新药、优化现有药物的治疗 效果等。
药物研发过程中需要深入研究酶分子修饰的机制和作用，以确保药物的安全性和有 效性。
04 酶分子修饰的研究方法
蛋白质组学技术
蛋白质谱分析
肿瘤治疗
利用酶分子修饰技术，可 以设计出针对肿瘤细胞特 异性的治疗策略，实现肿 瘤的精准治疗。
免疫调节
酶分子修饰可以用于调节 免疫细胞的活性，为免疫 相关疾病的治疗提供新的 思路。
酶分子修饰在农业生产中的应用
抗虫抗病
通过酶分子修饰技术，可以培育 出具有抗虫抗病性能的农作物新 品种，提高农作物的产量和品质 。
《酶分子的修饰》 PPT课件
酶的甲基化修饰
甲基化修饰是指将甲基基团加到酶分子上的过程，通常由甲基转移酶催化。甲基 化修饰可以改变酶的活性、稳定性、定位和与其他分子的相互作用。
甲基化修饰常见于DNA、RNA和蛋白质中。在蛋白质甲基化过程中，甲基转移 酶将甲基基团加到蛋白质特定氨基酸残基上，影响蛋白质功能和稳定性。
酶分子修饰与疾病发生发展
酶分子修饰与多种疾病的发生 和发展密切相关，如肿瘤、神 经退行性疾病、心血管疾病等
。
酶分子修饰可以影响细胞代 谢、细胞周期、细胞凋亡等 生物学过程，从而影响疾病
的发展进程。
深入了解酶分子修饰在疾病发 生发展中的作用，有助于发现 新的治疗靶点，为疾病治疗提
供新的策略和方法。
酶分子修饰与药物研发
酶分子修饰是药物研发的重要靶点之一，通过调节酶的活性可以设计出具有特定治 疗作用的药物。
酶分子修饰在药物研发中具有广阔的应用前景，如开发新药、优化现有药物的治疗 效果等。
药物研发过程中需要深入研究酶分子修饰的机制和作用，以确保药物的安全性和有 效性。
04 酶分子修饰的研究方法
蛋白质组学技术
蛋白质谱分析
肿瘤治疗
利用酶分子修饰技术，可 以设计出针对肿瘤细胞特 异性的治疗策略，实现肿 瘤的精准治疗。
免疫调节
酶分子修饰可以用于调节 免疫细胞的活性，为免疫 相关疾病的治疗提供新的 思路。
酶分子修饰在农业生产中的应用
抗虫抗病
通过酶分子修饰技术，可以培育 出具有抗虫抗病性能的农作物新 品种，提高农作物的产量和品质 。
《酶分子的修饰》 PPT课件
2012级名词解释酶工程
名词解释：每章的关键词（英文），就是表达本章中心内容的有实质意义的词汇。
各章重点第一章绪论一、酶工程的概念、分类及其研究内容。
生物酶工程的内容、什么是核酶二、简述酶活力测定方法的原理；酶活力单位；比活力等第二章酶的生物合成与发酵生产一、克隆酶：利用DNA重组技术而大量生产的酶。
二、什么是抗体酶？抗体酶：抗体酶是一类免疫系统产生的、具有催化活性的抗体。
三、酶生物合成的模式四、一些概念的区别：操纵子与操纵基因、诱导酶与组成酶、胞内酶与胞外酶、产酶动力学五、原核酶合成调节的类型有哪些？六、在酶制剂工业生产中为什么以微生物发酵生产为主？七、如何提高酶的产量？1选育优良的产酶细胞株系（生产组成型酶突变株的筛选，抗分解代谢阻遏突变株的选育，抗反馈阻抑突变株的筛选）2添加诱导物3控制阻遏物浓度4添加表面活性剂5添加产酶促进剂第三章酶的提取与分离纯化一、细胞破碎的目的、方法及原理。
二、酶抽提的目的及方法。
三、常用沉淀法的种类及原理。
四、常用沉淀法的种类及原理。
盐析法分离蛋白质的原理。
五、简述酶分离纯化方法及工艺程序的选择策略。
先选用非特异的、低分辨的技术，去除主要的杂质并使酶溶液浓缩；如沉淀、超滤和吸附等。
随后采用高效分离的手段；如离子交换层析、亲和层析。
将最昂贵、最费时的分离单元放在最后阶段。
如凝胶过滤层析。
六、简述影响酶提取的主要因素及影响规律。
抽提溶质的性质（酸性酶宜用碱性溶剂抽提，碱性酶宜用酸性溶液抽提，极性大的酶宜用极性溶剂抽提，含有较多非极性基团的酶宜用有机溶剂抽提。
）。
抽提溶剂的用量（增加用量可以提高酶的提取率。
但是过量的抽提溶剂，会使酶的浓度降低，对酶的进一步分离纯化不利。
用量一般为原料体积的3~5倍，最好分次抽提）温度（提取时温度对酶的提前效果有明显影响。
一般来说，适当提高温度，可以提高酶的溶解度，增大酶分子的扩散速度。
但温度过高易引起酶变性失活，所以提取温度不宜过高。
要根据被抽提酶的酶学性质选择适宜温度）pH 对酶的溶解度和稳定性有显著影响。
酶分子修饰
3. 巯基（—SH）修饰 巯基在酶蛋白中的来源是 Cys 的残基侧链，巯基的亲核性强， 往往是酶分子中最容易反应的侧链基团之一，在维持蛋白亚基之间 的相互作用和酶催化过程中起重要作用。 巯基容易被氧化成 —S—S—
常用的巯基修饰剂： 烷基化试剂；马来酰亚胺；有机汞试剂； 5-5’-二硫代-双（2-硝基苯甲酸）（DTNB，Ellman试剂）
三氯均三嗪 法
第三节
侧链基团修饰的作用
Hale Waihona Puke 侧链基团修饰采用一定的（化学）方法，使酶蛋白侧链基团发生改变，从而 改变酶催化特性的修饰方法。
用于研究各种基团在酶分子中的作用及其对酶的结构、特性和 功能的影响。 1. 荧光试剂修饰侧链，了解酶在水溶液中的构象； 2. 各基团对酶结构和活性的影响，研究必需基团的组成； 3. 对非催化基团修饰可改变酶的动力学性质，改变酶对特殊底 物的束缚能力； 4. 利用侧链修饰测定某种基团在酶分子中的数量； 5. 改变酶的结构和催化性能。
侧链基团修饰
1. 氨基（—NH2）修饰
氨基修饰剂作用于侧链上的氨基，产生脱氨基作用或与氨基共价结 合，将氨基屏蔽。
氨基修饰剂：2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）、2,4-二硝基氟苯 （DNFB）、丹磺酰氯（DNS） 1.1氨基的烷基化
2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）
准确测定酶蛋白中赖氨酸的数量
1.修饰剂的选择 根据酶的分子结构和修饰剂的特性，选择水溶性大分子。 生物相容性好、抗原性弱、无毒。 右旋糖酐、聚乙二醇（PEG）、肝素、蔗糖聚合物等 2.修饰剂的活化 使大分子中所含的基团在用前需活化后，活化后的基团才能在一 定条件下与酶分子某侧链基团反应。
3.修饰 将带有活化基团的大分子修饰剂与经过分离纯化的酶液，以 一定的比例混合，在一定的温度、pH值等条件下反应一段时间， 使修饰剂的活化基团与酶分子的某侧链基团以共价键结合，对酶 分子进行修饰。 4.分离 不不同酶分子的修饰效果往往不同，需要通过凝胶层析等方 法进行分离，将具有不同修饰度的酶分子分开，从中获得具有较 好修饰效果的修饰酶。
酶的分子修饰
DENATURATION 93°C - 95°C
EXTENSION 72°C
酶的分子修饰
优点： ✓抗体制备简单
任何一种酶都有它相对应的抗体，制备亦较简 单、迅速。所以，用抗体稳定酶的方法较普遍。
酶的分子修饰
缺点： ✓制备抗体花费较多，解决的办法是用微生物来生产。最 近报告表明，已经成功地由大肠杆菌生产具有完整功能 的重组抗体片段，而且用同一种微生物既能生产目的蛋 白又生产其抗体的可能性。 ✓在医学上要解决酶—抗体复合物在体内的抗原性。目前 采用降低抗体分子的大小制造嵌合抗体
酶的分子修饰
2.1.酶辅因子的置换修饰 通过改变酶分子中的辅因子，使酶的特性和功能
发生改变，主要是金属离子的置换，因此该方法又称 为离子置换法。
主要是二价离子的置换修饰
酶的分子修饰
置换修饰过程 酶液中加入Eபைடு நூலகம்TA
置换修饰酶
透析或超滤 加入金属离子
酶的分子修饰
置换修饰的要点 等价同荷置换
酶的分子修饰
酶的分子修饰
生物体中存在的酶分子修饰
❖酶原激活 ❖共价修饰
酶的分子修饰
酶原激活
Proteolytic Zymogen Activation.
酶的分子修饰
共价修饰
酶分子中的某些基团在其他酶的催化下，可共价结合或脱去， 引起酶分子构象改变而调节其活性，此类酶称为共价修饰调 节酶。
酶的分子修饰
酶的共价修饰方式
能与酶非共价地相互作用而有效地保护酶，既能通 过氢键固定在酶分子表面，也能通氢键有效地与外 部水相连，通过调节酶的微环境，保护酶的活力。 有些来自嗜热菌的酶具有较高稳定性，其原因正是 由于保护性大分子(如肽和聚胺)发挥作用的结果。
酶分子的修饰与应用
添加标题
意义：提高酶的活力；增强酶的稳定性；降低或消除酶的抗原性。
第一节 酶分子的主链修饰
肽链是蛋白酶的主链；核苷酸链是核酸类酶的主链。 利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法，称为酶分子的主链修饰。 意义：提高酶的活力；增强酶的稳定性；降低或消除酶的抗原性；并可以知道酶活性中心在主链上的位置，从而了解主链的不同位置对酶的催化功能的贡献等。
可以与酶分子结合的大分子有水溶性和水不溶性两类。采用不溶于水的大分子与酶结合制成固定化酶后，其稳定性显著提高(参看本书第五章)。采用水溶性的大分子与酶共价结合进行酶分子修饰，可以在酶分子外围形成保护层，起到保护酶的空间构象的作用，从而增加酶的稳定性。
现以SOD为例说明如下。 SOD（）催化超氧负离子（O2-）进行氧化还原反应，生成氧和过氧化氢。具有抗氧化、抗辐射、抗衰老的功效，但是其在血浆中的半衰期仅为6～30min，经过大分子修饰，其稳定性显著提高，半衰期延长70～350倍，见下表。
蛋白类酶主要由蛋白质组成，酶蛋白的侧链基团是指组成蛋白质的氨基酸残基上的功能团，主要包括氨基、羧基、巯基、胍基、酚基、咪唑基、吲哚基等。这些基团可以形成各种副键，对酶蛋白空间结构的形成和稳定有重要作用。侧链基团一旦改变将引起酶蛋白空间构象的改变，从而改变酶的特性和功能。
酶蛋白侧链基团修饰可以采用各种小分子修饰剂，例如，氨基修饰剂、羧基修饰剂、巯基修饰剂、胍基修饰剂、酚基修饰剂、咪唑基修饰剂、吲哚基修饰剂等；也可以采用具有双功能团的化合物，如戊二醛、己二胺等进行分子内交联修饰；还可以采用各种大分子与酶分子的侧链基团形成共价键而进行大分子结合修饰。其中酶分子的侧链基团与水不溶性的大分子结合的，属于酶的结合固定化方法，将在本书第五章阐述。本章主要介绍各种小分子化合物、双功能团化合物和水溶性大分子与酶分子的侧链基团相互作用的修饰方法。
酶分子修饰PPT课件
方案。
进行修饰实验
根据修饰方案进行实验 操作，实现酶分子的修
饰。
性能评估
对修饰后的酶进行性能 评估，包括稳定性、选 择性、催化效率等方面
的评估。
03
酶分子修饰的应用
酶分子修饰在医药领域的应用
药物设计和改造
疾病诊断和治疗
通过酶分子修饰技术，对药物分子进 行化学结构的改造和优化，提高药物 的疗效、稳定性和选择性。
为了克服现有酶分子修饰技术的局限性，需要不断探索新的修饰方法和策略，提高修饰效 果和特异性。
深入研究酶分子结构和功能关系
深入了解酶分子结构和功能关系，有助于更好地选择修饰位点和设计修饰方案，以实现酶 性能的优化。
开发酶分子修饰的应用实例
加强酶分子修饰在解决实际问题中的应用研究，例如在生物医药、环保、能源等领域的应 用实例开发。
分子，用于解决一些重要的生物学和工业问题。
提高酶的稳定性和催化效率
02
通过酶分子修饰，可以改善酶的稳定性和催化效率，使其在极
端条件下的应用更加广泛。
扩展酶的应用领域
03
随着酶分子修饰技术的发展，酶的应用领域也在不断扩展，例
如在生物医药、环保、能源等领域的应用。
酶分子修饰的未来研究方向
探索新的修饰方法和策略
酶分子修饰的类型
化学修饰
利用化学试剂对酶分子进行修饰 ，改变酶的活性、稳定性等性质 。常见的化学修饰方法包括磷酸 化、糖基化、甲基化等。
生物修饰
利用生物酶对酶分子进行修饰， 改变酶的性质。常见的生物修饰 方法包括蛋白质工程、基因敲除 和突变等。
酶分子修饰的重要性
提高酶的稳定性
通过酶分子修饰可以增加酶的稳 定性，使其在极端环境条件下仍 能保持活性，拓宽了酶的应用范
进行修饰实验
根据修饰方案进行实验 操作，实现酶分子的修
饰。
性能评估
对修饰后的酶进行性能 评估，包括稳定性、选 择性、催化效率等方面
的评估。
03
酶分子修饰的应用
酶分子修饰在医药领域的应用
药物设计和改造
疾病诊断和治疗
通过酶分子修饰技术，对药物分子进 行化学结构的改造和优化，提高药物 的疗效、稳定性和选择性。
为了克服现有酶分子修饰技术的局限性，需要不断探索新的修饰方法和策略，提高修饰效 果和特异性。
深入研究酶分子结构和功能关系
深入了解酶分子结构和功能关系，有助于更好地选择修饰位点和设计修饰方案，以实现酶 性能的优化。
开发酶分子修饰的应用实例
加强酶分子修饰在解决实际问题中的应用研究，例如在生物医药、环保、能源等领域的应 用实例开发。
分子，用于解决一些重要的生物学和工业问题。
提高酶的稳定性和催化效率
02
通过酶分子修饰，可以改善酶的稳定性和催化效率，使其在极
端条件下的应用更加广泛。
扩展酶的应用领域
03
随着酶分子修饰技术的发展，酶的应用领域也在不断扩展，例
如在生物医药、环保、能源等领域的应用。
酶分子修饰的未来研究方向
探索新的修饰方法和策略
酶分子修饰的类型
化学修饰
利用化学试剂对酶分子进行修饰 ，改变酶的活性、稳定性等性质 。常见的化学修饰方法包括磷酸 化、糖基化、甲基化等。
生物修饰
利用生物酶对酶分子进行修饰， 改变酶的性质。常见的生物修饰 方法包括蛋白质工程、基因敲除 和突变等。
酶分子修饰的重要性
提高酶的稳定性
通过酶分子修饰可以增加酶的稳 定性，使其在极端环境条件下仍 能保持活性，拓宽了酶的应用范
第六章_酶分子修饰
（1）提高酶活力（空间构象改变）
一分子RNA酶 + 6.5分子右旋糖苷——酶活提高为 原来的2.25倍。
一分子胰凝乳蛋白酶 + 11分子右旋糖苷——酶活 提高原来的 5.1倍。
一分子胰蛋白酶 + 11分子右旋糖苷——酶活提高 0.30倍
（2）增加酶的稳定性
酶的保存或使用一段时间后，由于各种因素影响，原 来完整的空间结构受到破坏，酶活力降低，甚至完全 丧失催化能力。
聚乙二醇琥珀酰亚胺衍生物：
是MPEG的羟基与琥珀酰亚胺类物质反应。在pH7-10时， 对酶的氨基进行修饰。
聚乙二醇胺类衍生物：
是MPEG的羟基与胺类化合物反应生成的。可以对酶的羰 基进行修饰。
聚乙二醇马来酸酐衍生物：
MPEG的羟基与马来酸酐反应生成共聚物（PM），其中 马来酸酐通过酰胺键对酶分子的氨基进行修饰。
3）修饰：
活化后的大分子修饰剂与经分离纯化的酶液，以一 定的比例混合，在一定的温度、pH值等条件下反 应，使两者以共价键结合。 4）分离：
通过凝胶层析等方法进行分离，将具有不同修饰度 的酶分子分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰 酶。
右旋糖苷————（高碘酸HIO4）活化右旋糖苷
三、大分子修饰的作用
酶对人体是一种外源蛋白，当经注射进入人体后 会成为抗原，刺激体内产生抗体。当这种酶再次进 入体内，抗体就会与作为抗原的酶特异结合，而使 酶失去催化能力。
抗体与抗原间特异结合是由于它们之间特定分子结构引 起的。用酶分子修饰法使酶的结构产生改变，抗体、抗 原就不再特异结合，可能降低或消除其抗原性。
利用水溶性大分子对酶进行修饰可降低或消除酶的抗原 性。
2－羟基－5－硝基苄溴（HNBB）和4－硝基苯硫 绿可以比较专一地对吲哚基进行修饰，但也可以 与巯基反应。
一分子RNA酶 + 6.5分子右旋糖苷——酶活提高为 原来的2.25倍。
一分子胰凝乳蛋白酶 + 11分子右旋糖苷——酶活 提高原来的 5.1倍。
一分子胰蛋白酶 + 11分子右旋糖苷——酶活提高 0.30倍
（2）增加酶的稳定性
酶的保存或使用一段时间后，由于各种因素影响，原 来完整的空间结构受到破坏，酶活力降低，甚至完全 丧失催化能力。
聚乙二醇琥珀酰亚胺衍生物：
是MPEG的羟基与琥珀酰亚胺类物质反应。在pH7-10时， 对酶的氨基进行修饰。
聚乙二醇胺类衍生物：
是MPEG的羟基与胺类化合物反应生成的。可以对酶的羰 基进行修饰。
聚乙二醇马来酸酐衍生物：
MPEG的羟基与马来酸酐反应生成共聚物（PM），其中 马来酸酐通过酰胺键对酶分子的氨基进行修饰。
3）修饰：
活化后的大分子修饰剂与经分离纯化的酶液，以一 定的比例混合，在一定的温度、pH值等条件下反 应，使两者以共价键结合。 4）分离：
通过凝胶层析等方法进行分离，将具有不同修饰度 的酶分子分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰 酶。
右旋糖苷————（高碘酸HIO4）活化右旋糖苷
三、大分子修饰的作用
酶对人体是一种外源蛋白，当经注射进入人体后 会成为抗原，刺激体内产生抗体。当这种酶再次进 入体内，抗体就会与作为抗原的酶特异结合，而使 酶失去催化能力。
抗体与抗原间特异结合是由于它们之间特定分子结构引 起的。用酶分子修饰法使酶的结构产生改变，抗体、抗 原就不再特异结合，可能降低或消除其抗原性。
利用水溶性大分子对酶进行修饰可降低或消除酶的抗原 性。
2－羟基－5－硝基苄溴（HNBB）和4－硝基苯硫 绿可以比较专一地对吲哚基进行修饰，但也可以 与巯基反应。
《酶的分子修饰》课件
酶的分子修饰
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单击输入目录标题 酶的分子修饰概述 酶的磷酸化修饰 酶的乙酰化修饰 酶的糖基化修饰 酶的甲基化修饰
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酶的分子修饰概述
酶的分子修饰的定义
酶的分子修饰是指酶在生物体内通过化学修饰改变其结构和功能
常见的酶分子修饰包括磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化等
酶分子修饰可以调节酶的活性、稳定性和定位 酶分子修饰在生物体内具有重要的生理功能，如信号传导、细胞周期调 控等
酶的分子修饰的类型
磷酸化修饰：通过磷酸化酶催化，使酶分子上增加或去除磷酸基团 乙酰化修饰：通过乙酰化酶催化，使酶分子上增加或去除乙酰基团 甲基化修饰：通过甲基化酶催化，使酶分子上增加或去除甲基基团 泛素化修饰：通过泛素化酶催化，使酶分子上增加泛素分子
酶的分子修饰的意义
调节酶的活性：通过修饰改变酶的活性，以适应生理和病理条件下的变 化 参与信号传导：酶的修饰可以参与信号传导，影响细胞功能
影响代谢途径：酶的修饰可以影响代谢途径，影响细胞代谢和功能
参与疾病发生：酶的修饰异常可能导致疾病发生，如癌症、糖尿病等
酶的磷酸化修饰
磷酸化修饰的种类
磷酸化修饰的种类：磷酸化修饰可以分为磷酸化、去磷酸化和磷酸化修饰 磷酸化修饰的种类：磷酸化修饰可以分为磷酸化、去磷酸化和磷酸化修饰 磷酸化修饰的种类：磷酸化修饰可以分为磷酸化、去磷酸化和磷酸化修饰 磷酸化修饰的种类：磷酸化修饰可以分为磷酸化、去磷酸化和磷酸化修饰
磷酸化修饰的酶
磷酸化酶：催化磷酸化反应的酶 磷酸酶：催化去磷酸化反应的酶 磷酸化修饰的酶：在酶分子上引入或去除磷酸基团的酶 磷酸化修饰的作用：调节酶的活性、定位和稳定性
磷酸化修饰的作用
调节酶的活性：磷 酸化修饰可以改变 酶的活性，从而影 响生物体的代谢过 程
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酶的分子修饰概述
酶的分子修饰的定义
酶的分子修饰是指酶在生物体内通过化学修饰改变其结构和功能
常见的酶分子修饰包括磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化等
酶分子修饰可以调节酶的活性、稳定性和定位 酶分子修饰在生物体内具有重要的生理功能，如信号传导、细胞周期调 控等
酶的分子修饰的类型
磷酸化修饰：通过磷酸化酶催化，使酶分子上增加或去除磷酸基团 乙酰化修饰：通过乙酰化酶催化，使酶分子上增加或去除乙酰基团 甲基化修饰：通过甲基化酶催化，使酶分子上增加或去除甲基基团 泛素化修饰：通过泛素化酶催化，使酶分子上增加泛素分子
酶的分子修饰的意义
调节酶的活性：通过修饰改变酶的活性，以适应生理和病理条件下的变 化 参与信号传导：酶的修饰可以参与信号传导，影响细胞功能
影响代谢途径：酶的修饰可以影响代谢途径，影响细胞代谢和功能
参与疾病发生：酶的修饰异常可能导致疾病发生，如癌症、糖尿病等
酶的磷酸化修饰
磷酸化修饰的种类
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磷酸化修饰的酶
磷酸化酶：催化磷酸化反应的酶 磷酸酶：催化去磷酸化反应的酶 磷酸化修饰的酶：在酶分子上引入或去除磷酸基团的酶 磷酸化修饰的作用：调节酶的活性、定位和稳定性
磷酸化修饰的作用
调节酶的活性：磷 酸化修饰可以改变 酶的活性，从而影 响生物体的代谢过 程
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催化活性/非催化活性基团的修饰
对非催化基团修饰可改变酶的动力学性质，改变酶对 特殊底物的束缚能力。 (改变对底物亲和能力) 对催化活性基团可以通过选择性修饰侧链成分来实现 氨基酸的取代。(改变催化性质) 经常被修饰的残基是： 亲核的Ser、Cys、Met、Thr、Lys、His 亲电的Tyr、Trp
共价修饰
用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通 过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层。 例如：用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶 ，不仅可以降低 或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延长 了酶在体内的半衰期从而提高了酶药效。 每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖酐结合，可以使 酶活力提高到原有酶活力的2.25倍；
1.某种修饰剂对某一氨基酸侧链的化学修饰专一性是相对的， 很少有对某一氨基酸侧链绝对专一的化学修饰剂。 2.酶的化学修饰只能在具有极性的氨基酸残基侧链上进行，目 前还不能用化学修饰的方法研究非极性氨基酸残基在酶结 构与功能关系中的作用。 3.酶化学修饰的结果对于研究酶结构与功能的关系能提供一些 信息，如某一氨基酸残基被修饰后，酶活力完全丧失，说 明该残基是酶活性所“必需”的，为什么是必需的，还得 用X射线和其他方法来确定。因此化学修饰法研究酶结构 与功能关系尚缺乏准确性和系统性。
二 修饰专一性分类
1)非专一性化学修饰 用非专一性的修饰试剂与氨基酸侧链基团作用。
若某基团被修饰后： 酶活性不变——该基团可能不是酶的必需基团 酶活性降低或丧失——该基团可能是酶的必需基 团
2)专一性化学修饰（基团专一性修饰）
用专一性化学修饰剂修饰酶活性中心的某一氨基酸 残基的侧链基团。 3)亲和标记（位点专一性修饰） 采用的修饰试剂是根据底物的化学结构设计合成的含 有活泼反应基团的底物类似物。 利用酶对底物的特殊亲和力将酶加以修饰标记。
各种氨基酸侧链的修饰剂
氨基酸 Lys Asp、Glu Arg Cys 侧链基团 氨基 羧基 胍基 巯基 二硫键 His Tyr Trp 咪唑基 酚羟基 吲哚基 修饰剂 三硝基苯磺酸，2，4－二硝基氟苯、碘乙酸、 碘乙酰胺、丹磺酰氯、亚硝酸 水溶性碳化二亚胺 苯乙二醛，1,2－环己二酮、丁二酮 碘乙酸、碘乙酰胺、N-乙基马来酰亚胺 巯基乙醇、DTT 焦碳酸二乙酯、碘乙酸 碘、四硝基甲烷 N-溴代琥珀酰亚胺
酶蛋白的肽链被水解后，可能出现以下三种情况
中的一种： 1 引起酶活性中心的破坏，酶失去催化功能。 2 仍维持活性中心的完整构象，保持酶活力。
3 有利于活性中心与底物结合并形成准确的催化部位，
酶活力提高。
(5) 氨基酸置换修饰
氨基酸或核苷酸的臵换修饰可以采用化学修饰方法，例如， Bender等成功地利用化学修饰法将枯草杆菌蛋白酶活性中心的 丝氨酸转换为半胱氨酸，修饰后，该酶失去对蛋白质和多肽的 水解能力，却出现了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但是化 学修饰法难度大，成本高，专一性差，而且要对酶分子逐个进 行修饰，操作复杂，难以工业化生产。(保护位点多,可修饰位点 多;蛋白容易失去活力) 现在常用的氨基酸臵换修饰的方法是定点突变技术。定点突变 （site directed mutagenesis）是20世纪80年代发展起来的一种基 因操作技术。是指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的 改变从而获得突变基因的操作技术。是蛋白质工程（Protein Engineering）和酶分子组成单位臵换修饰中常用的技术。定点 突变技术，为氨基酸或核苷酸的臵换修饰提供了先进、可靠、 行之有效的手段。
(Cu2+,Zn2+)
若从酶分子中除去其所含的金属离子，酶往往会丧失其催化活 性。如果重新加入原有的金属离子，酶的催化活性可以恢复或
者部分恢复。若用另一种金属离子进行臵换，则可使酶呈现出
不同的特性。有的可以使酶的活性降低甚至丧失，有的却可以 使酶的活力提高或者增加酶的稳定性。
金属离子置换修饰的过程
3)消除抗原性
酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成了
共价键。
破坏了抗原决定簇——抗原性降低乃至消除
“遮盖”了抗原决定簇——阻碍抗原、抗体结合
4) 其它 大分子修饰剂本身是多聚电荷体，能在酶 分子表面形成“缓冲外壳”，抵御外界环 境的极性变化，维持酶活性部位微环境相 对稳定
酶蛋白化学修饰的局限性
c. 加入臵换离子：于去离子的酶液中加入一定量的另一种金
属离子，酶蛋白与新加入的金属离子结合，除去多余的臵换离 子，就可以得到经过金属离子臵换后的酶。
金属离子臵换修饰只适用于那些在分子结构中本来含有金属离子的酶。
用于金属离子臵换修饰的金属离子，一般都是二价金属离子。
(2) 酶的大分子修饰
(3)活性中心位于酶分子表面的疏水性裂缝中。
(4)活性中心构象不是固定不变的（诱导契合）。 (5)酶与底物通过盐键、氢键、范德华力和疏水作 用等次级键结合。
活性中心的重要化学基团
7种氨基酸出现的频率最高 Lys Asp Glu Cys His Tyr Ser （兰天果拌猪肉丝） 某些功能基团,如（氨基、羧基、巯基、羟基 和咪唑基）是酶的必需基团。 赖氨酸的氨基 天冬氨酸和谷氨酸的羧基 半胱氨酸的巯基 组氨酸的咪唑基 酪氨酸和丝氨酸的羟基
3）消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能力）。
4）产生新的催化能力。
1）提高酶的生物活性（酶活力）
蛋白一级结构通过内部氨基酸侧链基团的相 互作用,按热力学最稳定方式形成了特有的 高级结构.(即一级结构的氨基酸顺序决定了 高级结构),而高级结构决定了功能.
一级结构修饰后发生改变很多情况下会引起 高级结构发生改变,从而改变蛋白功能(包括 酶活力)
14 h
24 h 35 h
140
240 350
(3) 酶分子的侧链基团修饰
采用一定的方法（一般为化学法）使 酶蛋白的侧链基团发生改变，从而改 变酶分子的特性和功能的修饰方法。 可以用于研究各种基团在酶分子中的 作用及其对酶的结构、特性和功能的 影响。在研究酶的活性中心中的必需 基团时经常采用。 酶蛋白的侧链基团是指组成蛋白质的 氨基酸残基上的功能团。主要包括氨 基、羧基、巯基、胍基、酚基等。这 些基团可以形成各种副键，对酶蛋白 空间结构的形成和稳定有重要作用。 侧链基团一旦改变将引起酶蛋白空间 构象的改变，从而改变酶的特性和功 能。(一级结构是基础)
a. 酶的分离纯化：首先将欲进行修饰的酶经过分离纯化，除
去杂质，获得具有一定纯度的酶液。
b. 除去原有的金属离子：在经过纯化的酶液中加入一定量的
金属螯合剂，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金属 离子与EDTA等形成螯合物。通过透析、超滤、分子筛层析等方 法，将EDTA-金属螯合物从酶液中除去。此时，酶往往成为无活 性状态。
第一节 为什么要进行酶修饰
限制酶大规模应用的原因：
1)细胞外稳定性差； 2)酶活性不够高； 3)具有抗原性。
酶化学修饰的意义
(1). 研究酶的结构与功能的关系。（50年代末） (2). 人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用 范围。（70年代末之后）
1）提高酶的生物活性（酶活力）。
2）增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）。
2）增强酶的稳定性
热稳定性 修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶内部基团形成多 点交联。使酶的天然构象产生“刚性”结构。 对抑制剂稳定性 大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍或静电斥力 阻挡抑制剂，“遮盖”了酶的活性部位。 对水解酶的稳定性 A 大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶接近酶分子。 “遮盖”酶分子上敏感键免遭破坏。 B 酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少了受蛋白 水解酶破坏的可能性。
聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和水溶性， 在体内无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶的 抗原性，使其末端活化后可以与酶产生交联，因而， 它被广泛用于酶的修饰。
酶 天然SOD 右旋糖酐-SOD 半衰期 6 min 7 h 相对稳定性 1 70
Ficoll(低分子量)–SOD
Ficoll(高分子量)–子修饰部位及专一性分类
酶蛋白结构部位分类 修饰专一性分类
一 酶蛋白结构部位分类
非必需基团
酶 分 子
必需基团
非活性中心 活性中心外 必需基团
结合基团
活性中心 必需基团
催化基团
活 性 中 心
活性中心的共性
(1)活性部位只占酶分子很小的一部分（1-2%）。
(2)活性部位是一个三维实体。
a、胃蛋白酶原的激活
胃蛋白酶原
HCl pH1.5～2
（从N端失去44个氨基酸残基） 胃蛋白酶
自身激活
b、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活
c、胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）的激活
有限水解意味着水解酶量和时间相对少
同时由于水解部位氨基酸”埋”在蛋白位臵 差异,氨基酸周围肽段引起的氨基酸pK值和 电性变化,使同样氨基酸部位水解程度也可能 不同
常见基团的化学修饰反应：羧基
常见基团的化学修饰反应：氨基
常见基团的化学修饰反应：巯基
常见基团的化学修饰反应：咪唑基
常见基团的化学修饰反应：酚羟基
常见基团的化学修饰反应：胍基
常见基团的化学修饰反应：色氨酸吲哚基
(4) 酶蛋白主链修饰(肽链有限水解修饰)
利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结构 发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。 酶蛋白主链修饰主要是靠酶切/酶原激活法。
Chapter 5 Modification of Enzyme Molecule
第五章 酶的分子修饰
Contents of chapter 5
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为什么要进行酶分子修饰 酶分子修饰部位及专一性分类 酶分子修饰种类 酶修饰后的性质变化 酶的定向进化