第五章目的基因的获取

ln (1-p)
N= ln (1-f)
ln (1-99%)
= ln (1-f)
G
N=
4.61×
f
G = 4.61×
f
G：Genome大小；f：fragment大小
例如：人的基因组是 3×109 bp，插入DNA片断的平均长度如果是1.7×104 bp
N= 4.61×
G = 4.61× f
3×109 1.7×104
5’ 5’ 5’
Klenow片段 T4DNA连接酶
3’ 引物
3’
3’
三、 寡聚核苷酸化学合成的优点 1. 直接合成基因 （1）mRNA的含量很低，很难作cDNA （2）有些基因比较短，化学合成费用较低 2. 合成引物（20mer左右） 3. 合成探针序列 4. 定点突变合成 合成带有定点突变的基因片断。
cosmid载体： 容量为 50 kb
YAC：
容量为 1 Mb
BAC:
容量为 300 kb
3. 基因文库构建的一般步骤 （1）染色体DNA大片段的制备 断点完全随机，片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法。
① 物理切割法： 超声波（300bp）或机械搅拌（8kb）。
② 酶切法： 内切酶Sau3A进行局部消化。可得到10-30kb的随机片断。
（2）载体与基因组DNA大片段的连接 直接连接、人工接头或同聚物加尾。
① 粘性末端直接连接 载体与外源DNA大片段的两个末端都有相同的粘性末端。
如：Sau3A与BamHI的酶切末端。
②人工接头法（adapter） 人工合成的限制性内切酶粘性末端片断。
各种酶的接头可以向公司定做或购买。
接上人工接头 ③ 同聚物加尾
理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。
2. 构建基因文库的载体选用 载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。
（1）对载体的要求 载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。
（2）目前常用的载体
载体系列： 容量为 24 kp
第五章目的基因的获取
第四章 目的基因的获取
目的基因： 准备要分离、改造、扩增或表达的基因。
第一节 基因组DNA片断化 一、限制性内切酶法
用限制性内切酶把基因组DNA切成不同大小的片断。
酶切
1. 优点 由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。
2. 缺点 目的基因内部也可能有该内切酶的切点。目的基因也被切成碎片！
末端转移酶
粘性末端
CCC 粘性末端
CCC
4. 基因组文库的大小 一个文库要包含99%的基因组DNA时所需要的克隆数目。
ln (1-p) N=
ln (1-f)
p: 文库包含了整个基因组DNA的概率（99%） f: 插入载体的DNA片断的平均长度占整个基因
组DNA的百分数
N：所需的重组载体数（克隆数）
1976年H.G. Khorana提出了用化学方法合成基因的设想，并于1979年在science上发表 了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因的论文。
一、目前常用的方法 磷酸二酯法、 亚磷酸三酯法、 自动化合成法。
磷酸三酯法、 固相合成法
1. 磷酸二酯法 （1）原理 ① 保护dNTP的5’端P 或3’端-OH 保证合成反应的定向进行。 ② 带保护的单核苷酸连接 带5’保护的单核苷酸与带3’保护的另一个单核苷酸以磷酸二酯键连接起来。
2）6bp的内切酶 平均每46（4096）bp一个切点。
② 内切酶粘性末端 能与常用克隆位点相连。 （Sau3A—BamH I）
2. 机械切割法 （1）超声波 超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp的随机片断。
（2）高速搅拌 1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb的随机片断。
第二节 化学合成目的基因
③ 用酸或碱的脱保护
（2）合成过程 下一个5’端保护的单核苷酸又可以同3’端保护的二核苷酸聚合。
2. 磷酸三酯法
原理与磷酸二酯法一样。只是参加反应的单核苷酸都是在3’端磷酸和5’-OH上都先连接了 一个保护基团。
合成的二核苷酸连接处有三个酯键！
固相磷酸三酯合成法 将第一个核苷酸的3’-OH端固定在固相支持物上。
BamH I
BamH I
BamH I
gene
二、随机片断化 1. 限制性内切酶局部消化法 控制内切酶的用量和消化时间，使基因组中的酶切位点只有一部分被随机切开。
（1）限制性内切酶的选用原则 ① 内切酶识别位点的碱基数 影响所切出的产物的长度和随机程度。
Biblioteka Baidu
1）4bp的内切酶 平均每44（256）bp一个切点。 随机程度高。如HaeⅢ、AluI、Sau3A。
（2）5’端磷酸化 用T4多核苷酸激酶使各个片段的5’端带上磷酸。 （合成的DNA单链的5’端是-OH）
（3）连接酶连成完整双链
T4多核苷酸激酶
使5’-OH磷酸化
T4 DNA连接酶 完整的DNA双链
2. 互补延伸连接法
预先设计的片断之间有局部互补区，可以相互作为另一个片断延长的引物，用DNA聚合酶 延伸成完整的双链。
5. 合成人工接头或衔接物 含有各种酶切位点人工接头（Adaptor）或衔接物（Linker）序列。
EcoRI
Adaptor
EcoRI
Linker
DNA合成仪
第三节 目的基因的保存和扩增
一、基因文库的构建
1. 基因文库（gene library）
将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当 的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。
= 8.1×105
二、 cDNA文库的构建
1. cDNA 以mRNA为模板逆转录出的DNA称cDNA。
3’
mRNA
5’
5’ 引物
cDNA
反转录酶 3’
2. cDNA library
利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存 和扩增，称cDNA文库。
是目前通用的合成方法。 15
固相磷酸三酯合成过程 C
固相支持物
固相 支持物
固相 支持物
结果是全保护的DNA：5’ DMT, 3’固相支持物, 核苷酸之间对氯苯。最后脱保护
二、 化学合成DNA片断的组装 化学合成的DNA片断一般在200bp以内。
1. 互补连接法 （1）互补配对 预先设计合成的片断之间都有互补区域，不同片断之间的互补区域能形成有 断点的完整双链。