基因工程 第五章目的基因的获取
获取目的基因的四个途径
获取目的基因的四个途径获取目的基因的四个途径引言：目的基因是指在人类或动物体内具有特定功能或特征的基因。
获取目的基因的研究对于科学研究、医学治疗和农业改良有着重要的意义。
本文将介绍获取目的基因的四个途径，包括突变、基因转移、基因编辑和基因合成，以帮助读者更全面地了解这一领域的研究进展和应用前景。
一、突变突变是指基因组发生突变或突变体产生的过程。
通过突变，可以获得新的目的基因或改良现有基因的功能。
突变的方式包括自然发生的自发突变和人工诱导的突变。
自发突变通常是由于DNA复制过程中的错误或外界环境的影响，而人工诱导的突变则是通过化学物质或辐射来诱导基因的改变。
突变的技术有助于研究基因的功能和相互关系，以及生成新的基因型来满足特定需求。
二、基因转移基因转移是通过将目的基因从一个生物体转移到另一个生物体来实现的。
这可以通过不同的方法进行，包括基因工程技术、转座子和病毒介导的转移。
基因工程技术是一种将特定基因加入目标生物体的方法，通常通过DNA重组技术和酶切酶技术来实现。
转座子是一种能够自主移动到基因组中不同位置的DNA序列，通过转座子可以将目的基因插入到特定基因组位置，实现目的基因的转移。
病毒介导的基因转移则是通过利用病毒的感染机制将目的基因传递到宿主生物体中。
三、基因编辑基因编辑是一种修改特定基因的方法，通过这种方法可以实现指定基因的特定改变。
目前最常用的基因编辑技术是CRISPR-Cas9系统，它利用一种特定的酶可以精确剪切DNA，并对基因进行修改。
通过CRISPR-Cas9系统，可以实现基因的插入、缺失、替代和修复等功能。
这种基因编辑技术在基因疾病治疗、农业改良和基因组研究方面具有广阔的应用前景。
四、基因合成基因合成是指通过合成DNA序列来获得目的基因。
这种方法可以通过化学或酶切酶技术将目的基因的DNA序列合成，并将其插入到目标生物体中。
基因合成技术的发展使得科学家可以根据需要设计合成基因，从而实现特定功能的基因表达和产物合成。
何水林版基因工程第五章基因的转移与重组体的筛选和鉴定
带酶切位点的PCR产物 5’- GCAGAATTC
PCR产物 PCR产物
GGATCCGCG CCTAGGCGC BamH I位点
-3’
-5’
3’- CGTCTTAAG
EcoR I位点
EcoR I BamH I 5’AATTC 3’- G PCR产物 PCR产物 G -3’ CCTAG -5’
两头各有一个粘性末端！
4. DEAE-葡萄糖转染法 二乙氨乙基（DEAE）葡聚糖为多聚阳离子试剂，能 促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。
葡聚糖
++ ++++++ ++ + + + 二乙氨乙基 + + （DEAE） ++ ++ ++++
++ ++++++ ++ + + + 二乙氨乙基 + + （DEAE） ++ ++ ++++ - - - -- - DNA - - --- -
4、在培养基中生长数小时之后，球形细胞复原并增殖。
操作步骤： 10ng 载体DNA 100L 感受态细胞 10-100L转化液 涂Amp＋平板
（p140）
吸附DNA 冰浴30min
摄入DNA 42℃ 1~2min
37℃ 振荡培养1h
加入1mL LB培养基 （Amp-）
转化率：106-108/g DNA
（一）转化率的计算：
转化率 ＝ 产生菌落的总数 / DNA的加入量
目的基因的获取
目的基因的获取基因工程的主要目的是使优良性状相关的基因聚集在同一生物体中，创造出具有高度应用价值的新物种。
为此必须从现有生物群中，根据需要分离出用于克隆的此类基因。
这类基因称之为目的基因，即准备要分离、改造、扩增或表达的基因。
目前目的基因的获取方法主要有以下2类：（1）已知基因的获得：PCR分离法和化学合成法等（2）未知基因的获得：直接分离法和基因文库分离法等第一节直接分离法1、限制性内切酶法用限制性内切酶把基因组DNA切成不同大小的片断。
应用对象：适合于从简单的基因组中分离目的基因,如质粒或病毒的大小只有几千碱基,大的也超不过几十万碱基,编码基因比较少，获得也比较简单。
（1）对已定序列的DNA分子，只需要用已知识别序列的限制性内切酶进行一次或几次切割，分离纯化所需要的DNA片断，与适当载体连接。
（2）对已知定位的目的基因，只要根据目的基因两侧的已知的酶切识别位点，一次就可以获得。
（3）即使含目的基因的DNA分子未定序或定位，也只须通过酶切分析，随后再通过部分酶切，构建一个简单的基因文库，从钩出目的基因。
2. 随机片断化2.1. 限制性内切酶局部消化法控制内切酶的用量和消化时间，使基因组中的酶切位点只有一部分被随机切开。
2.2 机械切割法（1）超声波超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp的随机片断。
（2）高速搅拌1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb的随机片断。
3. 物理化学法基本原理：DNA分子的两条链存在着G≡C、A＝T碱基配对，其中GC间存在3个氢键、A T间存在2个氢键，如果不同基因片段的碱基组成差异较大，其理化性质，如浮力密度和解链温度等也明显不同，采用相应的方法即可达到从生物基因组中分离目的基因的目的。
3.1密度梯度离心法由于富含碱基GC的双链DNA片段浮力密度较大，利用精密的密度梯度超速离心技术可使切割成适当片段的不同DNA按密度大小分离开来。
然后通过与某种放射性的mRNA杂交来检验，分离相应的基因。
目的基因的获取方法
目的基因的获取方法目的基因的获取方法是基因工程研究中的重要一环，它涉及到基因的定位、克隆、转染等一系列操作。
在进行目的基因获取时，科学家们需要遵循一定的步骤和技术，以确保目的基因的准确获取和稳定表达。
下面将介绍一些常用的目的基因获取方法。
首先，基因定位是获取目的基因的第一步。
通过PCR、Southern blotting等技术，科学家们可以准确地定位到目的基因在细胞或生物体中的位置，为后续的克隆和转染奠定基础。
其次，基因克隆是目的基因获取的关键步骤。
科学家们可以利用质粒、原核生物或酵母等载体系统，将目的基因从细胞或生物体中克隆出来。
这一过程需要利用限制性内切酶、连接酶等酶切和连接技术，以确保目的基因的完整性和准确性。
接着，目的基因的转染是获取目的基因的另一重要步骤。
科学家们可以利用质粒转染、病毒载体转染等技术，将目的基因导入到细胞或生物体中，实现其稳定表达和功能研究。
此外，目的基因的获取还可以通过基因编辑技术实现。
CRISPR/Cas9、TALEN、ZFN等基因编辑技术可以精准地编辑基因组，实现目的基因的定点修饰和获取。
最后，为了确保目的基因的稳定性和可控性，科学家们还需要进行基因的筛选和鉴定。
通过PCR、Western blotting、荧光染色等技术，科学家们可以对目的基因进行筛选和鉴定，确保其在细胞或生物体中的准确表达和功能发挥。
总之，目的基因的获取是基因工程研究中的重要一环，它涉及到基因定位、克隆、转染、编辑、筛选和鉴定等一系列技术和步骤。
科学家们需要结合实际研究需求和具体操作，选择合适的方法和技术，以确保目的基因的准确获取和稳定表达。
希望本文介绍的方法能够对相关研究工作提供一定的参考和帮助。
基因克隆技术
第五章基因克隆技术基因克隆技术是分子生物学的核心技术，其目的是获得某一基因或DNA片段的大量拷贝，用于深入分析基因的结构与功能，并可达到人为改造细胞以及物种遗传性状的目的。
基因克隆的一项关键技术是DNA重组技术，它利用酶学方法将不同来源的DNA分子进行体外特异性切割，重新拼接组装成一个新的杂合DNA分子。
在此基础上将杂合DNA分子转入一定宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子，此过程称基因克隆。
有目的地通过基因克隆技术，人为操作改造基因，改变生物遗传性状的系列过程总称为基因工程。
基因克隆的一般程序为：一、获取目的基因目的基因就是需要研究的特定基因或DNA片段。
获取目的基因的主要方法：1、用限制性内切酶酶解染色体DNA，构建基因组文库，再从基因组文库中筛选目的基因。
该法的优点是获得的目的基因的组织结构与天然基因完全相同，在结构基因中也含有内含子序列，但是也正因为这一点构成了该法最大缺点，即含有内含子的基因在原核细胞中不能表达。
原因是原核细胞不能识别并剪切插入顺序(内含子)，因而也不能表达出正确的基因产物。
2、分离纯化细胞中的mRNA，以mRNA为模板，在反转录酶作用下生成cDNA第一链，再以cDNA第一链为模板在DNA聚合酶作用下生成双链cDNA,构建cDNA文库，从中筛选所需的目的基因。
此法仅用于筛选为蛋白质编码的结构基因。
因成熟的mRNA分子中已经切除了内含子序列，具有完整的阅读框架，可在原核细胞中正确表达。
3、人工体外合成基因：由于当前人工体外合成DNA的长度有限，此法仅用于制备小分子生物活性多肽基因和小分子量蛋白基因。
在基因较大情况下，常需先合成多个DNA片段，然后拼接成完整的基因，此法还要求目的基因的全部碱基顺序已被阐明。
4、PCR法扩增基因：PCR(聚合酶链式反应)技术的出现和发展，为目的基因的寻找提供了有力技术工具。
用PCR法可选择性扩增基因组中所要研究的个别基因或DNA片段，或用反向PCR技术，先将特定mRNA反转录为cDNA第一链，然后再进行扩增。
《基因工程的基本操作程序》 知识清单
《基因工程的基本操作程序》知识清单基因工程，这个听起来充满科技感的词汇，其实已经在我们的生活中发挥着越来越重要的作用。
从农业领域的转基因作物，到医疗领域的基因治疗，基因工程正在悄然改变着我们的世界。
那么，基因工程到底是如何实现的呢？下面让我们来详细了解一下基因工程的基本操作程序。
一、目的基因的获取目的基因是我们希望导入受体细胞并使其表达的特定基因。
获取目的基因的方法主要有以下几种：1、从基因文库中获取基因文库就像是一个基因的“图书馆”，里面存储着各种生物的基因。
我们可以根据目的基因的有关信息，如基因的核苷酸序列、基因的功能、在染色体上的位置等，从基因文库中筛选出我们需要的目的基因。
2、利用 PCR 技术扩增目的基因PCR 技术，全称为聚合酶链式反应，就像是一个基因的“复印机”。
如果我们已经知道了目的基因的核苷酸序列，就可以通过设计引物，利用 PCR 技术在体外大量扩增目的基因。
3、人工合成当目的基因较小，而且核苷酸序列已知时，我们可以通过化学方法直接人工合成目的基因。
二、基因表达载体的构建获取了目的基因后，接下来要构建基因表达载体。
这就像是给目的基因打造一个“交通工具”，让它能够顺利地进入受体细胞并发挥作用。
基因表达载体通常由目的基因、启动子、终止子、标记基因等部分组成。
启动子是一段特殊的 DNA 序列，它就像是基因表达的“开关”，能够启动基因的转录。
终止子则是基因转录的“停止信号”，告诉 RNA 聚合酶在这里停止转录。
标记基因的作用是便于筛选和鉴定含有目的基因的受体细胞。
常见的标记基因有抗生素抗性基因等。
构建基因表达载体时，需要用相同的限制性内切酶分别切割目的基因和载体，然后用DNA 连接酶将它们连接起来，形成重组DNA 分子。
三、将目的基因导入受体细胞将构建好的基因表达载体导入受体细胞，这是基因工程的关键步骤之一。
不同的受体细胞需要采用不同的导入方法。
1、植物细胞（1）农杆菌转化法：农杆菌中的 Ti 质粒上的 TDNA 可以转移并整合到植物细胞的染色体 DNA 上。
目的基因的4种获取方法
目的基因的4种获取方法目的基因的4种获取方法目的基因是指科学家们在研究某种生物学现象时，所需要的特定基因。
获取目的基因是进行分子生物学研究和基因工程实验的前提条件之一。
本文将介绍四种常见的获取目的基因的方法。
一、PCR扩增法PCR扩增法是一种常见且简便的获取目的基因方法。
其原理是利用DNA聚合酶在模板DNA上进行反复扩增，从而获得大量目标序列。
PCR扩增法适用于已知序列或有已知序列片段可供引物设计的情况下。
具体步骤如下：1. 设计引物：根据目标序列设计出适当长度、互补性良好、不含二级结构和非特异性引物。
2. 提取模板DNA：从样品中提取出含有目标序列DNA片段的模板。
3. PCR反应：将引物与模板DNA加入PCR反应体系，通过多轮温度循环反复扩增出目标序列。
4. 纯化PCR产物：通过凝胶电泳等手段纯化出PCR产物。
二、限制性内切酶消化法限制性内切酶消化法是一种利用限制性内切酶切割DNA，从而获得目标序列的方法。
其原理是在DNA双链中寻找特定的核苷酸序列，并将其切割成特定长度的DNA片段。
具体步骤如下：1. 设计引物：根据目标序列设计出适当长度、互补性良好、不含二级结构和非特异性引物。
2. 提取模板DNA：从样品中提取出含有目标序列DNA片段的模板。
3. 选择限制性内切酶：根据目标序列中存在的限制性内切酶位点，选择合适的限制性内切酶。
4. 消化反应：将模板DNA与选择好的限制性内切酶加入反应体系，进行消化反应。
5. 纯化产物：通过凝胶电泳等手段纯化出所需长度的DNA片段。
三、基因克隆法基因克隆法是一种将外源基因插入到载体中并进行繁殖复制的方法。
其原理是通过PCR扩增或限制性内切酶消化等手段获取目标基因，并将其插入到载体中，再通过细胞培养等手段进行繁殖复制。
具体步骤如下：1. 设计引物：根据目标序列设计出适当长度、互补性良好、不含二级结构和非特异性引物。
2. 提取模板DNA：从样品中提取出含有目标序列DNA片段的模板。
目的基因的获取方法
目的基因的获取方法获取目的基因的方法。
目的基因的获取是基因工程研究的重要环节，它对于生物学研究和生物技术的发展具有重要意义。
在进行目的基因的获取过程中，需要注意一些关键步骤和技术，以确保目的基因的准确获取和稳定表达。
本文将介绍目的基因的获取方法，希望能够对相关领域的研究者和学习者有所帮助。
首先，目的基因的获取可以通过基因克隆技术实现。
基因克隆是指将感兴趣的DNA片段插入到载体DNA中，形成重组DNA分子的过程。
常用的基因克隆方法包括限制性内切酶切割、DNA连接、转化等步骤。
通过这些步骤，可以将目的基因从原始DNA中分离出来，并插入到载体DNA中，实现目的基因的获取。
其次，目的基因的获取还可以通过PCR扩增技术实现。
PCR扩增是一种体外合成DNA的方法，通过DNA聚合酶酶的作用，可以在体外将目的基因扩增成大量的复制产物。
通过PCR扩增技术，可以从极少量的DNA样品中扩增出目的基因，为后续的分析和研究提供充足的材料。
另外，目的基因的获取还可以通过基因合成技术实现。
基因合成是指利用化学合成的方法，将目的基因的核苷酸序列按照设计要求进行合成，得到人工合成的目的基因。
基因合成技术可以克服目的基因长度过长、重复序列等问题，为基因工程研究提供了更多的可能性。
除了以上提到的方法，还有一些其他的方法可以用于目的基因的获取，如基因文库筛选、原核表达系统、真核表达系统等。
这些方法各有特点，可以根据具体的研究需求和实验条件选择合适的方法进行目的基因的获取。
总的来说，目的基因的获取是基因工程研究的重要环节，它涉及到多种技术和方法。
在进行目的基因的获取时，需要根据实际情况选择合适的方法，并严格按照操作步骤进行实验操作，以确保目的基因的准确获取和稳定表达。
希望本文介绍的方法对相关领域的研究者和学习者有所帮助，促进基因工程研究的发展和进步。
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利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性，加入1220个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段，由反转录酶 合成cDNA的第一链。
3’AAAAAAA mRNA 5’ TTTTTTT cDNA 反转录酶 Oligo dT引物
5’
随机引物引导的cDNA合成法 (randomly primed cDNA synthesis) ：
1）4bp的内切酶 平均每44（256）bp一个切点。
随机程度高。如HaeⅢ、AluI、Sau3A。
2）6bp的内切酶 平均每46（4096）bp一个切点。 ② 内切酶粘性末端 能与常用克隆位点相连。
（Sau3A—BamH I）
2. 机械切割法 （1）超声波
超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp 的随机片断。
同 一 限 制 酶 切 位 点 连 接
GGATCC CCTAGG G CCTAG 目的基因用 Bam HⅠ切割
G CCTAG G CCTAG
Bam HⅠ切割反应
GATCC G 载体DNA用Bam HⅠ切割
+
GATCC G GATCC G
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
1. 优点 由于带有粘性末端，产物可以直接与载 体连接。 2. 缺点 目的基因内部也可能有该内切酶的切点。 目的基因也被切成碎片！
BamH I
BamH I
BamH I
gene
二、随机片断化 1. 限制性内切酶局部消化法 控制内切酶的用量和消化时间，使基 因组中的酶切位点只有一部分被随机 切开。 （1）限制性内切酶的选用原则 ① 内切酶识别位点的碱基数 影响所切出的产物的长度和随机程度。
* 化学合成法获取目的基因
由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列
一、目前常用的方法 磷酸二酯法、 亚磷酸三酯法、 自动化合成法。
磷酸三酯法、 固相合成法
1. 磷酸二酯法 （1）原理 ① 保护dNTP的5’端P 或3’端-OH 保证合成反应的定向进行。 ② 带保护的单核苷酸连接 带5’保护的单核苷酸与带3’保护的另一 个单核苷酸以磷酸二酯键连接起来。 ③ 用酸或碱的脱保护
（2）高速搅拌
1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb的随机片断。
（3）DNA溶液小孔喷射
注射器法可将100kb以上的DNA剪切成10 kb左右 的片段。
第二节 化学合成目的基因
1976年H.G. Khorana提出了用化学方法 合成基因的设想，并于1979年在science 上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨 酸tRNA基因的论文。 要求：1、已知目的基因的核苷酸序列 或其产物的氨基酸序列 。 2、分子量较小的目的基因的制备
二、 化学合成DNA片断的组装 化学合成的DNA片断一般在200bp以内。
1. 互补连接法
（1）互补配对 预先设计合成的片断之间都有互补区 域，不同片断之间的互补区域能形成有断 点的完整双链。 （2）5’端磷酸化 用T4多核苷酸激酶使各个片段的5’端带 上磷酸。 （合成的DNA单链的5’端是-OH）
组织或细胞染色体DNA 限制性内切酶 基因片断 克隆载体
* 从基因组DN带的所有基 因组DNA的集合
重组DNA分子 受体菌
求 载体容量越大，所要求的DNA片断数目 越少，所需的重组子越少。 （2）目前常用的载体 载体系列： 容量为 24 kp cosmid载体： 容量为 50 kb YAC： 容量为 1 Mb BAC:的制备
断点完全随机，片断长度合适于载体连接。 不能用一般的限制性内切酶消化法。 ① 物理切割法： 超声波（300bp）或机械搅拌（8kb）。 ② 酶切法： 内切酶Sau3A进行局部消化。可得到 10-30kb的随机片断。
（2）载体与基因组DNA大片段的连接 直接连接、人工接头或同聚物加尾。 ① 粘性末端直接连接 同一限制酶切位点连接 不同限制酶切位点连接 ② 平端连接 ③同聚物加尾连接 ④人工接头法（adapter）
b.置换合成法：
获得的双链cDNA 5’端也会有几对碱基缺失
原 理： 以第一链合成产物cDNA：mRNA杂交体作为
切口平移的模板，RNA酶H在杂交体的mRNA链上
造成切口和缺口，产生一系列RNA引物，在大肠杆
菌DNA聚合酶I 的作用下合成cDNA的第二链。
（2）合成过程
下一个5’端保护的单核苷酸又可以同3’端保护的 二核苷酸聚合。
2.亚磷酸三酯法
原理是将所要合成的寡聚核苷酸链的3′-末端先以3′OH与一个不溶性载体，如多孔玻璃珠（CPG）连 接，然后依次从3′-5′的方向将核苷酸单体加上去， 所使用的核苷酸单体的活性官能团都是经过保护的， 具体的合成和延伸过程如图。
ln (1-pf: 插入载体的DNA片断的平均长度占整个基因组DNA的百分数 N：所需的重组载体数（克隆数）
例如：从人——————————————— = 9.2×106 ln （1－1.5×103／3×109）
3. 合成探针序列 4. 定点突变合成
合成带有定点突变的基因片断。
5. 合成人工接头或衔接物 含有各种酶切位点人工接头（Adaptor）或 衔接物（Linker）序列。
EcoRI
Adaptor
EcoRI
Linker
DNA合成仪
第三节 PCR扩增获得目的基因
以前讲过关于PCR相关的知识，在这里不在 累述。
根据许多可能的序列，合成出6-10个核苷酸长的寡核 苷酸短片段（混合物），作为合成第一链cDNA的引物。在 应用这种混合引物的情况下，cDNA的合成可以从mRNA模 板的许多位点同时发生，而不仅仅从3’-末端的oligo(dT)引物 一处开始。
② 降解mRNA模板 用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA 杂交分子中的mRNA。 3’ 5’ 引物 3’ 5’ 引物 mRNA cDNA 反转录酶 3’ mRNA cDNA第一链 碱 或RNaseH 5’ 引物 cDNA第一链 3’ 5’ 5’ 3’
2.cDNA (complementary DNA，互补DNA)
是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞 内的mRNA经体外反转录后以在细菌中直接表达。 （3）包含库的一般步骤 （1）总RNA（total RNA）提取 提取总RNA有商业化的试剂盒（kit）。
聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) PCR 基因放大连琐反应
染色体
PCR 可以把 指定的细胞的整个基因组DNA切割 成大小合适的片断，并将所有这些片断都与 适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保 存和扩增。理论上讲，这些重组载体上带有 了4 DNA连接酶 15º C
载体自连
重组体
目的基因自连
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接
Eco RⅠ切割位点
GAATTC CTTAAG
Bg lⅡ切割位点
AGATCT TCTAGA
GAATTC CTTAAG AGATCT TCTAGA
EcoRⅠ+ 载量
转 染 率
λ噬菌体 9～22kb 105～106转化子／μgDNA 粘性质粒(Cosmid) 30～45kb 104～106转化子／μgDNA 酵母人工染色体(YAC) 100～1000kb ～500y 利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将 这些cDNA与载体连接，转
AATTC G GATCT A
Eco RⅠ+ Bg lⅡ 双酶切
+
AATTC G
A TCTAG
T4 DNA连接酶 15º C
GAATTC CTTAAG AGATCT TCTAGA
重组体
配伍末端的 连接情况和同一 限制酶切位点连 接相似。
目的基因
载体
限制性内切酶
限制性内切酶
若用质粒（pBR322）克隆目的基因（1.5kb）需要有9×106 克隆才能汇集人基因组全部DNA序列;若 用λ噬菌体载体可少到9×105, 而要用柯斯质粒将 40kb目的基因片断所需要重组体克隆数可降到3.5×105左右, 均可满足建库要求。
T4 DNA连接酶 15º C
重组体
载体自连
目的基因 自连
目的基因
5´ 3´ 5´ 限制酶或机械剪切 3´ 5´ λ-核酸外切酶 5´ 末端转移酶 + dATP A(A)nA 3´ 5´ 3´ 5´ 3´ 5´
载体DNA
限制酶 3´ 5´ λ-核酸外切酶 5´ 末端转移酶 + dTTP T(T)nT 3´ 5´ 3´
③ cDNA第二链合成
a.自身引导合成法：
剩下的cDNA单链的3’末端一般形成一个弯回来的 双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条 cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA。
5’
cDNA第一链 DNA聚合酶 cDNA第二链合成 cDNA第一链 cDNA第二链
5’ 3’
去掉发卡结构
用核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会 导致cDNA中有用的序列被切掉！）。 5’ 3’ cDNA第一链 cDNA第二链 核酸酶S1 5’ 3’ cDNA第一链 cDNA第二链 3’ 5’
（3）连接酶连成完整双链
T4多核苷酸激酶
使5’-OH磷酸化
T4 DNA连接酶
完整的DNA双链
2. 互补延伸连接法
5’
预先设计的片断之间有局部互补区，可以 相互作为另一个片断延长的引物，用DNA 聚合酶延伸成完整的双链。 3’
Klenow片段
引物
3’
5’
T4DNA连接酶
5’
3’
三、 寡聚核苷酸化学合成的优点 1. 直接合成基因 （1）mRNA的含量很低，很难作cDNA （2）有些基因比较短，化学合成费用较低 2. 合成引物（20mer左右）