基因工程-5章 目的基因的制备
基因工程思考题
《基因工程》思考题第一章绪论1. 简述基因操作、基因重组和基因工程的关系。
2. 为什么说基因工程是生物学和遗传学发展的必然产物？3. 简述基因的结构组成对基因操作的影响。
4. 谈谈你对gene的认识，并简要说说gene概念的演变过程.5. 如何理解gene及其产物的共线性和非共线性？6. 试从理论和技术两个方面谈Gene Engineering诞生的基础.第二章基因工程的基本原理与支撑技术1. 试比较原核基因组与真核基因组的结构和功能特点2. 试比较原核基因和真核基因表达调控的主要方式和特点3. 分析比较琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的异同点？4. 琼脂糖凝胶电泳中，简述影响DNA在凝胶中迁移速率的因素.5. 小量制备质粒DNA，用质粒中特定的酶切发现切割不动，试分析可能原因及克服方法？6. 在基因操作实践中有哪些检测核酸和蛋白质分子量的常规方法？7. 印迹分子杂交有哪些种类，并说明在什么情况下需要使用这些方法。
8. 核酸分子的标记有哪些方法，各有何特点？9. 由mRNA反转录成cDNA和DNA的PCR扩增是两个完全不同的酶催化反应过程，如何将两个过程联系在一起，实现由mRNA起始扩增出DNA？10. Primer是PCR反应体系的四大要素之一，PCR的许多应用都是通过primer设计来实现的，请问primer设计的一般原则是什么？11. 在PCR反应的后期，或者循环次数过多时，反应体系中就会出现一种所谓的平台效应（Plateau effect），请问什么叫Plateau effect？产生Plateau effect的原因有哪些？12. 在对PCR产物进行电泳检测时，有时会出现拖带或非特异性扩增条带，请分析其原因？如果检测结果是看不到DNA带或DNA带很弱，那又是为什么？13. 通过双向蛋白质电泳发现某蛋白质与某植物的一种表型密切相关，若要利用编码该蛋白质的基因来转基因植物，试问如何分离得到该基因？14. 现有一序列已知的DNA片段和一序列未知的DNA片段，你分别如何设计测序策略？15. 设想一下在什么情况下你希望知道一个基因或一段DNA的序列？16. 什么叫有性PCR？有性PCR导致DNA重组的分子机制跟体内重组有何异同？17. Explain the PCR. List the steps in carrying it out; include all the components and special conditions, explaining why each one is used. Illustrate the process with appropriate labels. Use the correct scientific terminology in your explanation.第三章基因工程操作的基本条件1. 试指出影响限制性内切核酸酶（Restriction endonuclease）切割效率的因素.2. 在酶切缓冲液中，一般需加入BSA，请问加入BSA的作用是什么？并简述其原理？3. 何谓Star activity？简述Star activity的影响因素及克服方法.4. 某DNA序列中存在DpnI酶切位点，以此DNA为模板，在体外合成DNA序列，当用该酶进行酶切时，发现切割不动，试分析可能原因？5. 天然的质粒载体（plasmid vectors）通常需经改造后才能应用，包括去除不必要的片段，引入多克隆位点等。
何水林版基因工程第五章基因的转移与重组体的筛选和鉴定
带酶切位点的PCR产物 5’- GCAGAATTC
PCR产物 PCR产物
GGATCCGCG CCTAGGCGC BamH I位点
-3’
-5’
3’- CGTCTTAAG
EcoR I位点
EcoR I BamH I 5’AATTC 3’- G PCR产物 PCR产物 G -3’ CCTAG -5’
两头各有一个粘性末端！
4. DEAE-葡萄糖转染法 二乙氨乙基（DEAE）葡聚糖为多聚阳离子试剂，能 促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。
葡聚糖
++ ++++++ ++ + + + 二乙氨乙基 + + （DEAE） ++ ++ ++++
++ ++++++ ++ + + + 二乙氨乙基 + + （DEAE） ++ ++ ++++ - - - -- - DNA - - --- -
4、在培养基中生长数小时之后，球形细胞复原并增殖。
操作步骤： 10ng 载体DNA 100L 感受态细胞 10-100L转化液 涂Amp＋平板
（p140）
吸附DNA 冰浴30min
摄入DNA 42℃ 1~2min
37℃ 振荡培养1h
加入1mL LB培养基 （Amp-）
转化率：106-108/g DNA
（一）转化率的计算：
转化率 ＝ 产生菌落的总数 / DNA的加入量
5目的基因
提供全套遗传信息, 即完整的基因组DNA。
可以研究基因组中5’端控制基因转录的调控序列；
内含子的分布和作用；
重复序列的数量、分布及大小。
（3）
构 建 基 因 组 文A：提取哺乳动物细胞染色体DNA 2）制备全部基因组的DNA片断 ①机械断裂法：用超声波或高速搅拌DNA溶液，断裂片段两 端没有与克隆载体匹配的粘末端, 插入载体之前还需要进行修 饰加工，少用。 ②限制酶降解（鸟枪法）：过去用EcoRⅠ,现用Sau3A。断裂 片段两端有与克隆载体匹配的粘末端，可直接与处理过的载 体连接。
②基因组DNA +λ噬菌体→重组DNA →包装成噬菌体→感 染细菌→噬菌斑
③基因组DNA +YAC →重组DNA →转化酵母→菌落 1个克隆含有基因组的某个片段，整个克隆群体就包含基 因组割。这种方法可以制备大片段的DNA（用噬 菌体λ作载体约20kb，以cosmid作载体约45kb ），从而 克服上述的两处缺点。但是这种方法的不是之处是：所 制备的片段的末端顺序是随机的，还必须经过末端修复， 人工制造接头等， 因为它们的容量比较大，可克隆大片段的DNA。虽然 cosmid 载 体 比 λ 载 体 的 容 量 大 ， 但 由 于 文 库 的 保 存 （cosmid载体在E.coli中， λ载体在噬菌体中） λ比 cosmid容易，因此λ载体用的更多些。
结构基因的组成
转录启动区、核糖体识别区、编码区(起译码ATG、ORF、休止码TAG或 TAA或TGA)、终止转录区
（1）原核生物基因的组成
基因区：操纵子。基因之间有间隔序列
启动区：RNA聚合酶识别、结合和开始转录的片段 SD区：起译码ATG上游约10bp处的富含嘌呤的保守区，其转录物：
基因工程疫苗的制备.
基因工程疫苗的制备.基因工程疫苗的制备1. 制备基因工程苗用酶和载体酶是进行基因工程不可缺少的试剂。
用于基因工程的工具酶主要是限制性核酸内切酶和DNA修饰酶(连接酶)，限制性核酸内切酶简称限制酶，是一类水解DNA的磷酸二酯酶，用于基因工程的限制酶，主要是能专一的识别4～6个核苷酸序列，并有专一的断裂位置或切点的酶，如EcoRI、HindⅢ、PstI、BamHI等。
DNA修饰酶是将目的基因的DNA片段与载体DNA分子在体外连接起来，构成重组体DNA分子，这类酶主要有T4DNA连接酶(从T4噬菌体感染的大肠杆菌中分离出来的)等。
基因的载体，可以携带外源DNA片段，进入宿主细胞进行增殖和表达，作为基因的载体，应具有以下的特征：能在宿主细胞中自我复制，即使有外源DNA片段与其共价连接也不影响其复制；应具有合适的限制酶识别位点，以便与外源DNA片段连接；应具有某些遗传标记，以便于重组体的选择。
常用的载体有质粒(如大肠杆菌质粒pBR322、pSC101、Co1EI)、噬菌体(λ噬菌体和M13噬菌体)、粘性质粒(由质粒DNA和λ噬菌体的COS区域构建而成，它不但具有以上两种载体的优点，而且能与大片段的外源DNA连接构成重组体DNA分子)及病毒(如牛痘苗病毒、禽痘病毒、腺病毒、乳多空病毒等)。
2.基本程序大致包括以下五个步骤：第一步是分离目的基因，获得目的DNA片段的方法主要有两种，一是直接从细胞基因组中分离，二是人工合成。
第二步是将DNA片段和载体在体外连接重组，成为重组DNA分子，多采用连接酶的方法连接。
第三步是基因克隆，即将重组体DNA分子，引进合适的宿主细胞(大肠杆菌、酵母)中增殖。
根据所用载体的不同，可选用转化(以质粒作载体时，重组体DNA分子以此种方式进入感受态的宿主细胞，以获得转化子菌落)、转染(λ噬菌体作载体时，构成的重组体DNA 分子，以此种方式进入宿主细胞，可转染得到噬菌斑)、转导(λ噬菌体DNA与外源DNA组成的重组体DNA分子，与噬菌体蛋白组装成具有感染力的噬菌体颗粒，即人工包装的噬菌体颗粒，引入宿主细胞)的方法，往宿主细胞引入重组体DNA分子。
基因工程复习资料
基因工程复习资料第一章核酸的制备1.主要步骤：分、切、接、转、筛、表2.基因工程的概念：基因工程又称基因堆叠技术和dna重组技术，就是以分子遗传学为理论基为础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种dna分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。
第二章基因工程工具酶1.生物催化剂：核酶、抗体酶、模拟酶。
2.限制性内切核酸酶：定义：限制性内乌核酸酶就是一类能够辨识双链dna中特定核苷酸序列（辨识序列），并在识别序列上使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。
命名：限制性内乌核酸酶通常就是以第一次抽取至这类酶的生物的种名的第一个字母和种名的第一、第二个字母命名的，有的在后面还加菌株（型）代号中的一个字母。
如果从同一种生物中先后提取到多种限制性内切核酸酶，则依次用罗马数字ⅰ、ⅱ、ⅲ表示。
并且名称的前三个字母须用斜体，第一个字母用大写。
3.dna连接酶：定义：dna连接酶也称dna黏合酶，在分子生物学中扮演一个既特殊又关键的角色，那就是连接dna链3‘-oh末端和，另一dna链的5’-p末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的dna链连成完整的链的一种酶。
种类：大肠杆菌dna连接酶、t4dna连接酶、tscdna连接酶、真核生物细胞辨认出的连接酶，例如酶ⅰ、酶ⅱ、酶ⅲ等多种类型。
4.dna片段的相连接方法：①具互补黏性末端dna片段之间的连接：可用e?colidna连接酶，也可用t4dna连接酶。
②尼奥罗末端dna片段之间的相连接：就可以用t4dna连接酶，并且必须减少酶的用量。
③dna片段末端修饰后进行连接：dna片段末端同聚物加尾后进行连接，可按互补粘性末端片段之间的连接方法进行连接；粘性末端修饰成平末端后进行连接；dna片段5′端脱磷酸化后进行连接；dna片段加连杆或衔接头后连接。
5.dna聚合酶：①定义：dna聚合酶就是指用dna单链为模板，以4种脱氧核苷酸为底物，催化剂制备一条与模板链序列优势互补的dna新链的酶。
第5章基因工程基本流程-筛选与鉴定
1. 蛋白质功能检测 原理：
外源基因编码具有特殊功能的酶或活性蛋白，根 据抗原抗体反应原理，针对该表达产物设计相应 的检测方案
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固相支 持滤膜
一抗
待测基因 产物蛋白
125I标记的二抗
固相支 持滤膜
一抗
待测基因 产物蛋白
二抗
125I 标记的二 抗结合蛋白
固相支 持滤膜
待测基因 产物蛋白
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缺点：需要电镜
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5. Northern blotting 原理：
从宿主细胞中提取RNA， 再用探针杂交。 主要检测插入片断是否 被转录。检测表达载体。
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选择过程 Northern blot流程
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6. 直接电泳检测 原理：
有插入片段的重组载体分子量比野生型载体分子量大
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选择过程
从转化后的 菌体克隆中 分离质粒， 电泳、比较 其分子量。
对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位 溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。
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②酶联免疫吸附测定（ELISA） 原理： 一抗（primary antibody）：与目标分子的特异结合。 二抗（secondary antibody）： 与一抗的特异性结合。 酶连（enzyme-linked）二抗： 携带能催化无色底物转变为有色物质（或发光）的酶， 再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推 测目标分子的含量。
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待测基因 产物蛋白
一抗
待测基因 产物蛋白
一抗 二抗
酶
二抗
酶
无色的底物
有色的产物
比色观察
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方法： 固定样品 一抗结合 二抗结合 显色/发光反应 比色
基因工程-第5章-聚合酶链式反应
5.2 聚合酶链式反应的最适条件
• 1、Taq DNA聚合酶的热稳定性及最适延 伸温度 相对分子量为94的Taq DNA聚合 酶的酶活性较高，大约为200000U/mg，在 合成DNA时有一个较高的最适温度7580℃，在90℃以上仍比较稳定。在PCR反 应中 PCR技术
• 5.5.1 PCR技术的发明 • 1869年瑞士的年轻医生Miescher就开始对核酸进 行研究 • 1930年提出了DNA和RNA的概念 • 1953年提出了DNA双螺旋模型及其半保留复制 • 1971年Khorana等提出了PCR技术的思路 • 1985年K.B.Mullis发明了PCR方法 • 1986年PE-Cetus公司发明并提纯了耐热DNA聚合 酶 • 1987年推出了PCR自动化热循环仪 • 1988年首先获得了基因工程方法生产的耐热 DNA聚合酶
• 以上5种不同类型的基因扩增，后4种是在天然 状态下于细胞内发生的生理生化变化，唯有 PCR技术才是人类自己在试管中模拟发生于细 胞内的DNA复制过程。 • 聚合酶链式反应，即PCR技术，是美国Cetus公 司人类遗传研究室的科学家K.B.Mullis于1985年 发明的一种在体外快速扩增特定基因或DNA序 列的方法，故又称为基因的体外扩增法，也有 人称之为无细胞分子克隆法。
• 5、不对称PCR（Asymmetric PCR）与DNA 序列测定 即两种引物的浓度相差50～ 100倍，其他方面与标准的PCR没有本质 的区别。低浓度的引物叫限制引物，一 般为0.5～1pmol。具体操作过程见下图。
• 6、RT-PCR（ReverseTranscription-PCR）与 RNA分析 • 7、mRNA差异显示技术（mRNA-differential disply technique,mRNA-DD-PCR） • 8、基因的体外诱变与突变的检测 • 9、基因组的比较研究
《基因工程B》复习提纲2020
第一章基因工程概述一、名词解释基因、基因操作、基因工程、重组DNA技术二、思考题1、简述基因工程操作的基本步骤。
2、简述基因工程操作的理论依据。
3、简述基因工程诞生理论上的三大发现和技术上的三大发明。
第二章基因工程的工具酶一、名词解释限制性内切酶、同裂酶、同尾酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、逆转录酶二、思考题1、简述限制性内切酶命名的基本原则。
2、影响限制性内切酶活性的因素主要有哪些？3、影响连接反应效率的因素主要有哪些？4、大肠杆菌DNA聚合酶有哪些活性？分别简要说明其主要用途。
5、简述切口平移法标记DNA的原理。
答：首先，在Mg2+存在下利用低限量的DNase I处理双链DNA，随机产生少量切口；然后，利用大肠杆菌DNA聚合酶I的5'→3'外切酶活性在切口处向3'端平移去除核苷酸，同时，其5'→3'聚合酶活性则将切口作为引物沿5'→3'方向催化DNA合成；随着反应的进行，5'端核苷酸不断去除，3'端核苷酸不断掺入，导致切口沿着DNA合成方向移动，即切口平移。
如果在反应体系中加入标记dNTP，则这些标记dNTP将取代原有的核苷酸残基，产生带标记的DNA分子。
6、简述交换（置换）法标记DNA的原理。
答：反应体系中只有一种标记的dNTP存在时，可利用大肠杆菌DNA聚合酶I或T4/T7 DNA 聚合酶的3’→5’外切酶活性从3’端降解DNA，当露出与该标记dNTP互补的碱基时，上述酶的5'→3'聚合酶活性则催化该位置发生合成反应，用标记的dNTP置换原来的核苷酸残基，产生3’端标记的DNA。
第三章基因工程的载体一、名词解释载体、质粒、噬菌体、噬菌体溶菌周期、噬菌体溶原周期、克隆载体、表达载体、穿梭载体、整合载体、表达标签二、思考题1、简述克隆载体具备的基本条件。
2、以大肠杆菌为例，解释利用α互补筛选重组质粒的原理。
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②补钉延长法：根据目的基因两条互补链全 序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片 段以及20-30碱基长的单链DNA中片段
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大片段酶促法：根据目的基因的全序列，分别合 成40-50碱基长的单链DNA片段。
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⑶DNA化学合成的用途
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㈡直接分离法
⑴限制性核酸内切酶酶切分离法：
①对已知序列的DNA分子，只需用已知识别序列的 限制性核酸内切酶进行一次或几次切割，分离纯化 所需DNA片段，与适当载体重组后转化受体菌后即可 得到目的基因的克隆。
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②对已知定位的目的基因，只要根据目的基因 两侧的已知的限制性核酸内切酶识别位点，用 适当的限制性核酸内切酶切割，一次就可获得 目的基因。
磷酸三酯法、亚磷酰胺法、氢磷酸法；具体
操作过程又有液相合成和固相合成两种形式。
前者操作繁琐，基本上已淘汰；后者反应中 间物的分离程序简便，DNA合成仪就是根据固 相亚磷酰胺法原理设计的。
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⑴化学合成目的基因的前提条件是基因DNA序列已 知 ⑵化学合成的三种策略 ①小片段粘接法：根据目的基因全序列，分别合成 12-15碱基长的单链DNA小片段。
合成天然基因：如生长激素释放抑制素基因、 胰岛素基因、干扰素基因等 合成探针 合成引物 合成连接子和接头 修饰改造基因：如组织型纤溶酶原激活剂基 因、尿激酶原基因等 设计新型基因
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㈣逆转录法
酶促逆转录主要用于合成分子质量较大，转 录产物mRNA易分离的目的基因。这种方法以 目的基因的mRNA为模板，在逆转录酶的作用 下合成互补的DNA，即cDNA，然后在DNA聚合 酶的催化下合成双链cDNA片段，与适当的载 体重组后转入受体菌扩增，获得目的基因的 cDNA克隆。
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本章重点掌握的内容
目的基因的概念及用途 制备目的基因常用的方法 鸟枪法的概念、用鸟枪法制备目的基因的 主要步骤、优点与缺点 DNA化学合成的方法及其用途
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如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱 法筛选，则选择多拷贝克隆载体；如果转化子采用 基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体
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③重组DNA分子导入受体细胞 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性 酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作为受 体细胞；如果转化子采用基因产物功能检 测法筛选，则选择能使目的基因表达的受 体细胞 ④筛选含有目的基因的目的重组子 菌落原位杂交法、基因产物功能检测法 （筛选模型的建立）
第五章 目的基因的制备
一、目的基因的概念 二、获得目的基因的方法
三、目的基因用途
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一、目的基因的概念
外源基因:插入到载体上并导入到宿主细胞内 的特定基因或DNA片段，称为外源基因。 目的基因：通常将那些已被或者准备要被分 离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA片 段，称为目的基因。
物理化学法分离目的基因的方法主要有密度梯度 离心法、单链酶解法和分子杂交法等。
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㈢基因的化学合成
化学合成DNA的实质是按照序列要求将脱氧核
苷酸单体一个个接上去，每接一个单体就是一
个循环反应，包括：基团保护、分离、缩合、
分离、去保护五大操作单元。
201讲，DNA化学合成有磷酸二酯法、
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目的基因主要是编码蛋白质(酶)的结构基因，诸 如抗逆性相关基因、生物药和保健品相关基因、 毒物降解相关基因以及工业用酶相关基因等。随 着生物长期的进化，生物界积累了大量对人类有 用的基因。它是大自然恩赐于人类的宝贵资源， 等待人们去开发利用。
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二、获得目的基因的方法
直接分离法 逆转录法 聚合酶链式反应法(PCRA差异显示法
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㈠鸟枪法
鸟枪法：是将基因组全部打乱,切成碎片,进行随机 测序,测序后再将它们拼接起来，进而获得目的基 因的方法。鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆 分离。
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鸟枪法的优点： 速度快，简单易行，成本较低，并能获得与天然 基因组DNA一亲的有内含子的基因DNA片段。 鸟枪法克隆目的基因的缺点 补平基因缺口困难 排序拼装麻烦，工作量较大 专一性较差 需要了解目的基因的背景知识 不能获得最小长度的目的基因 不能除去真核生物目的基因的内含子结构
③即使含目的基因的DNA分子未定序或无定位， 也只须先通过酶切分析，随后再通过8-9
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⑵基因分离的物理化学法
这是基因工程在发展初期所用的方法，某些生物 的rDNA基因最早都是利用该法分离获得的。 基本原理是DNA分子的两条链存在着G≡C、A=T碱 基配对,其中GC间存在3个氢键，AT间存在2个氢 键。不同基因片段的碱基组成差异较大，其理化 性质，如浮力密度和解链温度等也有明显不同， 采用适当方法可从基因组分离出目的基因。
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鸟枪法制备目的基因的主要步骤
①染色体DNA的切断 超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端
全酶切： 片段长度不均一，粘性末端便于连接，但 有可能使目的基因断开，大小不可控
部分酶切： 片段长度可控，含有粘性末端，目的基 因完整 ②DNA片段与载体连接
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cDNA第一链的合成
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cDNA第二链的合成 ①自身引导法：获得的单链cDNA3’端会形成发夹 结构的能力，以此作为第二链合成的引物。
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cDNA第二链的合成 ②引导合成法：获得的双链cDNA 能保留完整的5’ 端序列
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㈤PCR法扩增目的基因
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三、目的基因用途
①研究该基因的全貌与内涵，如详细分 析其结构、功能及调控。 ②与正常基因对比，寻找异常基因的异 常点，进而探索疾病发生的分子生物学 机理及治疗对策。 ③研究生物种系进化与相关同源性。
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④应用某种基因大量表达，生产所需要的蛋白 质或多肽（如胰岛素、干扰素等药物）。 ⑤在农、林、牧、副、渔业中，改造某些目的 基因，以改良品种，促进经济发展。 ⑥建立基因疗法，选用某种正常基因，引入患 者体内，对某些先天性遗传疾病进行治疗。