第五章 基因工程的工具—载体系统(1)
《基因工程的载体》课件
04
人工染色体载体
人工染色体的概念与特性
人工染色体
指通过基因工程技术构建的染色 体，具有与天然染色体相似的结 构和功能。
特性
具有高容量、可定制、可调控等 特性，能够承载和表达大量的外 源基因，为基因治疗、基因组编 辑等领域提供有力支持。
人工染色体载体的构建
构建方法
通过同源重组、酵母人工染色体技术等方法，将天然染色体或其片段进行改造 和扩增，形成人工染色体载体。
目的基因与质粒载体的连接
将重组质粒导入受体细胞中，通过筛 选和鉴定获得阳性克隆。
质粒载体的选择
根据目的基因的性质和表达要求，选 择合适的质粒载体。
重组质粒的转化
通过限制性内切酶和DNA连接酶将 目的基因插入质粒载体中，形成重组 质粒。
质粒载体的应用
基因克隆与表达
质粒载体是基因克隆和表达的重要工具，可以将目的基因在受体细胞中高效表达。
基因组结构
复制方式
噬菌体的基因组通常较小，易于 操作和改造。
噬菌体通过复制和组装在宿主细 胞内产生子代，能够高效地将外 源基因整合到宿主基因组中。
噬菌体载体的构建
01
02
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基因克隆技术
利用基因克隆技术将外源 基因插入到噬菌体基因组 中，构建成噬菌体载体。
基因敲除或敲入
通过基因敲除或敲入技术 ，对噬菌体基因组进行改 造，以实现外源基因的表 达或调控。
基因功能研究
人工染色体载体可用于构建基因表达谱和基因敲除细胞系 ，有助于深入研究和了解基因的功能和作用机制。
05
基因工程载体的未来发展
基因工程载体的改进方向
提高载体稳定性
通过优化载体结构，降 低载体在细胞内复制过 程中的突变率，提高基
基因工程的基本工具和操作程序
药物研发
利用基因工程技术研发新 的药物，如基因工程疫苗 和基因编辑药物。
基因工程的伦理和法律问题
基因工程涉及对生命和遗传信息的干预，引发了伦理和法律上的许多争议，如个人隐私、基因歧视、知 情同意等。
总结和展望
基因工程是一项能够改变生命的重大技术，可以为农业和医学带来重要的创 新。然而，我们也要警惕其潜在风险，并加强伦理和法律的管理。
组织培养
利用基因工程技术对植物进行 组织培养，实现无性繁殖、快 速繁殖和种质保存。
生物防治
利用基因工程技术培育具有抗 虫能力的昆虫，实现对农作物 害虫的生物防治。
基因工程在医学领域的应用
基因治疗
利用基因工程技术治疗遗 传性疾病，通过修复或替 代异常基因来恢复正常功 能。
基因诊断
利用基因工程技术检测个 体的基因组信可以将两个DNA 片段连接起来，形成一 个完整的DNA分子。
基因工程的操作程序
1
剪切
使用限制酶剪切DNA链，得到需要的DNA片段。
2
连接
使用连接酶将DNA片段连接成新的DNA分子。
3
转化
将新的DNA分子转化到目标细胞中，使其表达所带有的外源基因。
基因工程在农业领域的应用
转基因作物
通过基因工程技术改变作物的 遗传特性，使其具有抗虫、抗 草药、耐旱等特点。
基因工程的基本工具和操 作程序
基因工程的定义和目的
基因工程是一种通过改变生物体的遗传信息来实现对特定性状的控制的技术。 其目的是改善农业产量、提高医学疗效和推动科学进步。
基因工程的基本工具
1 质粒
2 限制酶
3 连接酶
质粒是一种循环的DNA 分子，可用于携带外源 基因进入目标细胞。
基因工程的载体
常用抗生素的作用方式及抗性机理
抗生素名称 氨苄青霉素 （Amp） 氯霉素 （Cm） 卡那霉素 （Kan） 链霉素 （Sm） 四环素 （Tet） 作用方式 抗性机理 一种青霉素的衍生物，通过干扰 bla抗性基因编码的一种周质酶，即β-内 细菌胞壁合成之末端反应，而杀 酰胺酶，可特异的切割amp的β-内酰胺 死生长细胞。 环，从而失去杀菌效力。 一种抑菌剂，通过同核糖体50S 亚基的结合作用，干扰细胞蛋白 质的合成，并阻止肽键的形成。 cat抗性基因编码乙酰转移酶，特异地使 氯霉素乙酰化而失活
λ噬菌体载体
结构特点: ①线性双链DNA分子 ②具非必需区(约1/3长度） ③两端具12个核苷酸单链互补粘性末端 ④可在E.coli中大量繁殖 ⑤可克隆15Kb左右的外源DNA
（2）质粒的基本特性
1) 2) 3) 4) 5) 自主复制性 不相容性 可扩增性 可转移性 携带遗传标记 野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传 标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需 的附加性状，包括：抗生素、抗抗生素、抗重金 属、产生细菌毒素等。对DNA重组分子的筛选具有 重要意义。
（3）质粒DNA的转移
质粒自主转移
导入
+
自主转移
+
无DNA转移
donor
H H
H
+
辅助转移
H
+
质粒的辅助转移
H
H
+
Notransfer
质粒的重组转移
R-重组DNA分子
重组
+
DNA 转移
R
+ R
（4）质粒的命名
人工组建的质粒 第一个字母是质粒的英文名字（Plasmid）的第一 个字符p, 用小写。后面有两个字母是大写，代表质 粒的发现者和实验室名称，再后面是质粒的编号。
基因工程的基本条件载体系统共118页
1、纪律是管理关系的形式。——阿法 纳西耶 夫 2、改革如果不讲纪律，就难以成功。
3、道德行为训练，不是通过语言影响 ，而是 让儿童 练习良 好道德 行为， 克服懒 惰、轻 率、不 守纪律 、颓废 等不良 行为。 4、学校没有纪律便如磨房里没有水。 ——夸 美纽斯
5、教导儿童服从真理、服从集体，养 成儿童 自觉的 纪律性 ，这是 儿童道 德教育 最重要 的部分 生活要有意义，不要越轨。——华盛顿 17、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。——罗素·贝克 18、最大的挑战和突破在于用人，而用人最大的突破在于信任人。——马云 19、自己活着，就是为了使别人过得更美好。——雷锋 20、要掌握书，莫被书掌握；要为生而读，莫为读而生。——布尔沃
基因工程的工具及方法
載體(vector)
一個可在生物體中世代相傳，攜帶外來核酸片段之核 酸個體。 載體DNA的構造應含有的核酸序列： 1.在宿主裡複製(replication) DNA之複製子(replicon)序列。 2.帶有可供篩選重組核酸之標幟序列，如抗生素抗藥性或 產生顏色反應之b-galactosidase等之標幟。 3.帶有多種限制酵素切割之區域(multiple recognition sites)， 以供轉殖不同限制酵素切割之核酸片段。
連接酵素(ligase)
假如限制酵素是可切割特定DNA序列之“剪刀”，則 連接酵素有如“漿糊”，可用來連接不同來源、不同 大小但帶有相同黏合端序列之核酸片段。較常用之連 接酵素有E. coli ligase及T4 ligase。這兩種ligases均可 連接有黏合端子之雙股核酸片段，T4 ligase更可連接 blunt end之核酸片段。通常在基因轉殖之操作裡都使 用可產生相同黏合端序列之限制酵素來切割質體及樣 品DNA。因使用相同之限制酵素切割之DNA片段都有 互補之黏合端序列，故連接酵素就可把質體及樣品 DNA片段結合，製成所謂之重組核酸(recombinant DNA)。
7
各種使用於基因工程之宿主特點比較
8
Expression of human insulin in E. coli
9
Bacterial production of human growth hormone
10
Bacterial production of human growth hormone (b)
6
宿主(host)
包括E. coli, 真核細胞之酵母菌(yeast),昆蟲病毒系統 (baculoviral system)及動物細胞系統(mammalian system). E. coli作為宿主之優點為可在很短時間以最便宜之培 養基來大量表現基因、製造蛋白，其製造成本最低， 其缺點為E. coli缺乏glycosylation等與蛋白活性相關之 功能，並且在E. coli內大量產生之蛋白常形成內涵體 (inclusion body)之固體存在，缺乏生理活性，但以E. coli製造出來之製劑亦有：human insulin, a-interferon, IL-2.等 以yeast製造成功之例子有：HBsAg vaccine, G-CSF等 以動物細胞表現成功例子有：EPO, tPA, Factor VIII, Factor VII等
基因工程(基因工程的基本条件-载体系统)
(二)质粒载体(Plasmid)
1. 质粒的一般生物学特征
质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而 自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子；
质粒常见于原核细菌和真菌中； 绝大多数的质粒是DNA型的； 绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分
子结构，即cccDNA； 质粒DNA的分子量范围：1-300 kb。
D-DNA ocDNA cccDNA
但变性的线性染色体DNA分子复性时不准确，也不迅 速，因此彼此聚集形成网状结构,通过离心分离便与变 性的蛋白质及RNA一起沉淀下来，而仍滞留在上清液中 的质粒DNA则可用酒精等沉淀收集。
沸水浴法 用含有EDTA和TritonX-100的缓冲液悬浮菌体； 加溶菌酶裂解细菌细胞壁； 沸水浴40秒钟； 离心，用无菌牙签挑去沉淀物； 乙醇或异丙醇沉淀质粒DNA；
λ噬菌体生物学特性：溶原状态
➢λ噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也 可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上， 并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态； ➢整合主要由λ-DNA上的cI和int两基因的产物所激 活，而这两个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞 本身的性质； ➢人们可以根据需要改变λ-DNA或宿主细胞的性质， 使噬菌体或处于溶原状态，或处于溶菌状态；
4363 bp
ROI
➢用于基因克隆
ROP Origin of Replication Hind II
Sal I Bal I
pUC18/19：
EcoRI SstI KpnI SmaI BamHI XbaI SalI PstI SphI HindIII
➢分子量2686bp； GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT
《基因工程的工具——酶与载体》 知识清单
《基因工程的工具——酶与载体》知识清单基因工程作为现代生物技术的核心领域之一，为人类带来了前所未有的机遇和挑战。
而在基因工程中，酶和载体是至关重要的工具，它们就像是工匠手中的精巧工具，帮助我们实现对基因的精确操作和转移。
一、基因工程中的酶1、限制性内切酶限制性内切酶，也被称为“分子剪刀”，是基因工程中最重要的工具酶之一。
它能够识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点将 DNA 分子切断。
这种特性使得我们能够从复杂的 DNA 分子中切取特定的基因片段。
不同的限制性内切酶识别的序列不同，这为基因工程的操作提供了丰富的选择。
限制性内切酶的作用就像是一把精准的剪刀，能够在 DNA 这个长长的“绳子”上剪出我们需要的特定片段。
比如，EcoRI 能识别GAATTC 序列，并在 G 和 A 之间切断 DNA 双链。
2、 DNA 连接酶当我们用限制性内切酶切下所需的基因片段后，需要将它们与其他DNA 片段连接起来，这时候就轮到 DNA 连接酶发挥作用了。
DNA 连接酶能够将两个具有相同黏性末端或平末端的 DNA 片段连接在一起，形成一个完整的 DNA 分子。
想象一下，DNA 连接酶就像是一个“胶水”，把被剪开的 DNA 片段重新粘在一起，使它们成为一个连续的整体。
3、 DNA 聚合酶在基因工程中，DNA 聚合酶常用于 DNA 的复制和扩增。
例如，PCR（聚合酶链式反应）技术就依赖于耐高温的 Taq DNA 聚合酶。
通过 PCR 技术，我们可以在体外大量扩增特定的 DNA 片段，为后续的实验和应用提供足够的材料。
4、反转录酶反转录酶能够以 RNA 为模板合成互补的 DNA（cDNA）。
这在获取真核生物的基因时非常有用，因为真核生物的基因中含有内含子，而通过反转录得到的 cDNA 不含内含子，更便于在原核生物中表达。
二、基因工程中的载体1、质粒质粒是一种存在于细菌细胞质中的小型环状 DNA 分子。
它具有自主复制能力，可以在细菌细胞内独立存在和复制。
《基因工程的工具——酶与载体》 知识清单
《基因工程的工具——酶与载体》知识清单一、基因工程简介基因工程，又称为重组 DNA 技术，是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外 DNA 重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
它是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，而实现这一技术的关键就在于一系列特殊的工具，其中酶和载体起着至关重要的作用。
二、基因工程中的酶1、限制性核酸内切酶（限制酶）限制酶是能够识别双链 DNA 分子的某种特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开的酶。
限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割 DNA 分子。
例如，EcoRⅠ限制酶只能识别GAATTC 序列，并在 G 和 A 之间切断磷酸二酯键。
限制酶切割DNA 分子产生的末端有两种类型：黏性末端和平末端。
黏性末端是指被限制酶切开的 DNA 双链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对；平末端则是指切口平整，不带有伸出的核苷酸。
2、 DNA 连接酶DNA 连接酶的作用是将两个具有相同末端（如黏性末端或平末端）的 DNA 片段连接起来，形成一个完整的 DNA 分子。
DNA 连接酶与限制酶的作用相反，它通过催化磷酸二酯键的形成，将断开的 DNA 片段重新连接起来。
3、 DNA 聚合酶在基因工程中，DNA 聚合酶常用于 DNA 片段的扩增，如 PCR 技术（聚合酶链式反应）。
PCR 技术中使用的热稳定 DNA 聚合酶（Taq 酶）能够在高温环境下保持活性，不断地将脱氧核苷酸加到引物的 3'端，使 DNA 链得以延伸。
4、反转录酶反转录酶能够以 RNA 为模板合成互补的 DNA 链，即 cDNA。
这在获取目的基因时非常有用，例如从真核生物细胞中提取出mRNA，然后通过反转录酶合成 cDNA，再进行后续的基因操作。
三、基因工程中的载体1、载体的作用载体在基因工程中主要起到运输目的基因的作用，它能够将目的基因导入到受体细胞中，并使其在受体细胞中稳定存在和表达。
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Vector
extrachromosomal state, most of which exist as
Forms of Plasmid DNA •Supercoiled, native form,
c ovalently c lose
d c ircles
超螺旋型，即共价闭合环
质粒的构型－电镜照片
Electrophoresis of plasmid DNA in agarose gels
1.
as
confer on their host cells
天然质粒
Zhu, et al, AAC,
2009,
A large plasmid isolated from Klebsiella pneumoniae
Chloramphenicol
抗生素抗性
¾
1.The ColE1 origin of replication is
Regulation of replication of
-445 -555
on the Rop protein
Low and High Copy Number
Replication of ColE1 also depends
stability of plasmids
离和分析－
PLASMID 56(2006):167-178
什么是军团菌？
z革兰氏阴性杆菌
z条件致病菌，可通过气溶胶传播，引致非典型肺炎——军团病。
z广泛存在于水体、土壤和寄生于自由生活的单细胞原生动物中，
z可在原生动物体内存活并繁殖，在淡水环境下有很强的抗逆能力。
如何研究军团菌与原生动物的关系
ColE1质
粒
复
制
起
始
的
控
制。