膜蛋白的提取与分离
细胞膜蛋白的提取
细胞膜蛋白的提取1. 引言细胞膜蛋白是细胞膜上的蛋白质，它们在细胞的结构和功能中起着重要的作用。
细胞膜蛋白具有多种功能，包括细胞识别、信号转导、运输和通道形成等。
为了研究细胞膜蛋白的结构和功能，科学家需要从细胞中提取这些蛋白质。
本文将介绍细胞膜蛋白的提取方法和步骤。
2. 细胞膜蛋白的提取方法2.1 细胞膜蛋白的提取原理细胞膜蛋白是细胞膜上的蛋白质，与细胞膜紧密结合。
因此，提取细胞膜蛋白需要破坏细胞膜，并保持蛋白质的完整性。
常用的细胞膜蛋白提取方法包括机械破碎法、化学溶解法和超声波法等。
2.2 机械破碎法机械破碎法是一种常用的细胞膜蛋白提取方法。
其步骤如下：1.制备细胞悬浮液：将培养的细胞收集，并用缓冲液洗涤，得到细胞悬浮液。
2.破碎细胞：将细胞悬浮液置于低温条件下，加入适量的缓冲液，然后用高速搅拌器或超声波破碎仪破碎细胞，使细胞膜破裂。
3.离心：将破碎后的细胞悬浮液进行离心，分离出上清液和沉淀。
4.收集上清液：将上清液转移到新的离心管中，这个上清液中含有细胞膜蛋白。
2.3 化学溶解法化学溶解法是另一种常用的细胞膜蛋白提取方法。
其步骤如下：1.制备细胞悬浮液：将培养的细胞收集，并用缓冲液洗涤，得到细胞悬浮液。
2.加入溶解剂：向细胞悬浮液中加入适量的溶解剂，如磷酸盐缓冲液或甘油，使细胞膜破裂。
3.搅拌：将细胞悬浮液与溶解剂充分混合，并用搅拌器搅拌一定时间，使细胞膜蛋白溶解在溶液中。
4.离心：将溶解后的细胞悬浮液进行离心，分离出上清液和沉淀。
5.收集上清液：将上清液转移到新的离心管中，这个上清液中含有细胞膜蛋白。
2.4 超声波法超声波法是一种快速、高效的细胞膜蛋白提取方法。
其步骤如下：1.制备细胞悬浮液：将培养的细胞收集，并用缓冲液洗涤，得到细胞悬浮液。
2.加入超声波溶解剂：向细胞悬浮液中加入适量的超声波溶解剂，如磷酸盐缓冲液，使细胞膜破裂。
3.超声波处理：将细胞悬浮液置于超声波处理器中，进行超声波处理，使细胞膜破裂。
提取膜蛋白的方法
提取膜蛋白的方法提取膜蛋白是一项关键的实验步骤，用于研究膜蛋白的结构和功能。
本文将介绍几种常用的膜蛋白提取方法。
1. 浸泡法浸泡法是一种简单的膜蛋白提取方法。
将细胞或组织样品置于适当的缓冲液中，如磷酸盐缓冲液或生理盐水中，并加入一些溶解剂（如阴离子洗涤剂）以破坏膜结构。
浸泡一段时间后，离心以分离出溶液中的膜蛋白。
2. 磷脂双层溶液法磷脂双层溶液法利用磷脂双层膜的特性来提取膜蛋白。
首先，将细胞或组织样品放入含有磷脂双层的液体中。
磷脂双层膜与细胞膜相似，可吸附并保持膜蛋白的结构和功能。
然后，用洗涤液洗涤磷脂双层，使膜蛋白释放到洗涤液中。
3. 超声法超声法是一种物理方法，通过超声波的能量来提取膜蛋白。
将细胞或组织样品置于含有缓冲液的管中，并使用超声波处理。
超声波的能量可以破坏细胞膜结构，使膜蛋白溶解到缓冲液中。
然后，对溶液进行离心，将膜蛋白分离出来。
4. 酸碱提取法酸碱提取法利用pH的变化来提取膜蛋白。
首先，将细胞或组织样品放入酸性或碱性溶液中，并搅拌。
酸性或碱性环境可以破坏细胞膜结构，使膜蛋白溶解到溶液中。
然后，通过调整pH值，使膜蛋白沉淀，进一步提纯。
5. 亲水基质法亲水基质法是一种通过亲水基质与疏水膜蛋白的选择性结合来提取膜蛋白的方法。
细胞或组织样品与亲水基质接触，亲水基质与细胞膜的亲水区域结合，使膜蛋白释放到溶液中。
然后，通过离心和洗涤步骤来分离和纯化膜蛋白。
这些方法在膜蛋白的研究中应用广泛，但根据具体的实验目的和样品特性，可以选择适合的方法进行膜蛋白提取。
实验中还应注意选择合适的缓冲液、溶液浓度和温度，并结合离心、洗涤等步骤进行蛋白的纯化和分离。
此外，需要根据实验目的选择合适的检测方法，如SDS-PAGE、Western blot等来确定提取的膜蛋白的质量和纯度。
总之，膜蛋白提取是膜生物学研究的重要一环，不同方法适用于不同的样品和实验要求。
正确选择和操作提取方法可以高效地提取膜蛋白，并为后续研究提供可靠的样品。
中药膜蛋白质提取
中药膜蛋白质提取中药是中华文化的重要组成部分，也是我们传统的医学瑰宝。
中药中的有效成分是非常复杂的，其中不乏具有药用价值的蛋白质。
通过提取中药中的蛋白质，可以广泛应用于医学、保健品等多个领域。
中药膜蛋白质提取是提取中药中蛋白质的一种方法，下面我们就来详细介绍一下此方法的步骤。
一、中药材处理中药膜蛋白质提取过程中，中药材的处理非常重要。
首先，选用新鲜的中药材进行提取。
其次，需要对中药材进行研磨，制成适合操作的形态。
最后，将中药材用水或其他溶剂进行浸泡，使药材中的蛋白质在溶液中充分溶解。
二、蛋白质提取将浸泡好的中药材经过过滤、离心、超滤等一系列步骤，得到中药膜蛋白质的提取液。
一般情况下，膜过滤是最重要的步骤之一。
利用分子筛分离出分子较小的蛋白质，大分子多糖、脂质等杂质将无法通过膜孔，从而得到纯净的膜蛋白质提取物。
三、蛋白质分离、纯化通过电泳、色谱等方法对蛋白质进行分离和纯化。
电泳技术可以根据蛋白质的电性和分子大小等特性，将其分离出来；而色谱技术则是利用不同物质在固定相和流动相之间的亲和性和分子大小等特性来进行分离和纯化。
在这些步骤中，选择适当的分离和纯化方法对于提取纯净蛋白质非常重要。
四、蛋白质鉴定、分析对分离纯化得到的蛋白质进行结构、功能鉴定，确定蛋白质的主要作用。
通过质谱、圆二色谱、红外光谱等技术手段，确定蛋白质的分子量、构型、生物活性等参数，为进一步研究和开发提供依据。
综上所述，中药膜蛋白质提取是一个复杂、多步骤的过程。
这个过程需要科学严谨的操作，才能确保提取到纯净、高效的膜蛋白质。
中药膜蛋白质提取为中药材的深度开发和应用提供了强有力的支持，也使我们更好地保护和传承中华传统医药文化。
分离膜蛋白的方法
分离膜蛋白的方法有两种：1先分离膜，然后提取；2用特殊的去污剂选择性的分离。
第二种方法简单，可靠，但有时含有其他蛋白。
原理：4度时所有的蛋白质原则上都溶于TritonX114水溶液，但在37度时，此溶液分为水相和去污相；此时亲水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污剂相中。
方案
1）放射性标记受试细胞
2）将标记的细胞放在冰上
3）去除上清，用pH7。
4的冷磷酸盐缓冲液洗涤单层细胞两次
4）加入1ml2%TritonX溶液冰浴15min
5)刮下单层细胞，4度下10 000g 5min离心
6）溶液37度水浴10min以分离水相和去污剂相，然后37度下2 000g离心5min
7)收集水相留作分析
8）用500ul冰冷的buffer C溶解去污剂相沉淀，冰浴2min后加温，在按步骤6再次离心
9）按步骤8再次抽提去污剂相，用buffer C将洗涤后的去污剂相稀释到初始体积
10）用等量的buffer A分别稀释水相与去污相，并进行免疫沉淀实验
试剂：
1）2%tritonX114:2%TritonX114、50mmol/L Tris HCl（pH7。
5）、蛋白酶抑制剂
2）缓冲液A（含0。
5mol/LNaCl的RIPA buffer)
3)buffer C
10mmol/L Tris HCl(pH7.5)
150mmol/L NaCl
5mmol/L EDTA(PH7.5)。
细胞膜蛋白wb制样
细胞膜蛋白wb制样细胞膜蛋白（WB）是细胞膜上的一类重要蛋白质。
它们在细胞膜的结构和功能中起着关键作用。
本文将介绍细胞膜蛋白WB的制样方法及其在生物学研究中的应用。
一、细胞膜蛋白WB的制样方法细胞膜蛋白WB的制样是指将细胞膜蛋白从细胞中提取出来并进行分离和纯化的过程。
下面将介绍一种常用的细胞膜蛋白WB制样方法：1. 细胞膜蛋白的提取：首先，需要将细胞收集并洗涤，然后用适当的细胞裂解液破坏细胞膜，释放细胞膜蛋白。
常用的细胞裂解液包括RIPA缓冲液、SDS裂解液等。
2. 蛋白的分离：将细胞裂解液进行离心，得到上清液。
上清液中含有细胞膜蛋白和其他细胞组分的混合物。
可以利用一些分离技术，如差速离心、凝胶过滤或离子交换层析等，将细胞膜蛋白与其他蛋白分离开来。
3. 蛋白的纯化：通过进一步的层析技术，如亲和层析、凝胶过滤层析或离子交换层析等，对分离得到的细胞膜蛋白进行纯化。
这些层析技术可以根据细胞膜蛋白的特征选择合适的分离方法。
4. 蛋白的定量：使用蛋白定量试剂盒或其他方法，对纯化得到的细胞膜蛋白进行定量。
这样可以确定细胞膜蛋白的浓度，为后续实验提供准确的蛋白样品。
5. 蛋白的保存：将制备好的细胞膜蛋白样品保存在低温下，避免蛋白的降解和变性。
二、细胞膜蛋白WB在生物学研究中的应用细胞膜蛋白WB作为一种常用的实验技术，广泛应用于生物学研究中。
下面将介绍细胞膜蛋白WB在以下几个方面的应用：1. 蛋白表达与定量：利用细胞膜蛋白WB技术，可以检测和定量特定蛋白在细胞膜上的表达水平。
这对于研究细胞膜蛋白的功能及其与疾病的关联具有重要意义。
2. 蛋白相互作用：细胞膜蛋白WB还可用于检测蛋白与其他蛋白或小分子的相互作用。
例如，可以利用WB技术研究受体与配体之间的相互作用，从而揭示信号转导途径的调控机制。
3. 蛋白翻译后修饰：细胞膜蛋白WB可用于研究蛋白在翻译后的修饰，如磷酸化、甲基化等。
通过WB技术的分析，可以了解这些修饰对细胞膜蛋白功能的影响，进而揭示其在细胞信号传导中的作用。
蛋白质膜分离
蛋白质膜分离是一种实验技术，用于将细胞膜中的蛋白质与其他细胞组分分离开来，以便对其进行进一步的研究和分析。
这种技术常用于生物学和生物化学研究中，特别是在研究细胞膜蛋白的结构、功能和相互作用方面。
常见的蛋白质膜分离方法包括：
1. 亲和纯化：利用蛋白质与某些特定配体（例如抗体、配体分子等）之间的特异性相互作用，将目标蛋白质从混合物中纯化出来。
例如，可以使用标记有特定抗体的磁珠或琼脂糖柱进行亲和纯化。
2. 凝胶电泳：利用凝胶电泳技术，根据蛋白质的大小、电荷等特性将蛋白质从混合物中分离出来。
常用的凝胶电泳包括聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和原位凝胶电泳（Native PAGE）。
3. 离心分离：利用离心技术，将细胞裂解液或组织匀浆在不同离心速度下离心，从而分离出不同密度或大小的细胞组分。
通过不同离心速度的选择，可以将膜蛋白从其他细胞组分中分离出来。
4. 超声波破碎：利用超声波对细胞进行破碎，将细胞膜破碎释放出的膜蛋白与其他细胞组分分离开来。
5. 亲水性与疏水性分离：利用膜蛋白通常具有的疏水性和亲水性特点，采用相应的溶剂或条件将其从其他细胞组分中分离出来。
例如，可以利用疏水性相互作用将膜蛋白从细胞溶液中提取到有机溶剂中。
这些方法通常会根据具体的研究目的和实验条件进行选择和优化，以达到最佳的分离效果。
在实际操作中，常常需要结合多种方法进行蛋白质膜的分离和纯化。
膜蛋白的提取与分离
膜蛋白的提取与分离膜蛋白的分离一、简介：1细胞质膜资料1895年,Overton从研究细胞透性得出"细胞膜由连续的脂类物质组成"。
1925年Gorter&Grendel:用脂单分子膜技术测定细胞膜中脂分子的总面积，提出："细胞膜是由双层脂分子组成"。
1935年Danielli&Davson：从测定膜的表面张力得出细胞膜的"三明治结构模型"，即蛋白质－脂-蛋白质。
1959年Robertson:用电镜观察生物膜提出"单位膜模型"，将膜的分子结构与超微机构统一起来厚度：2(暗)+3.5(亮)+2（暗）=7.5细胞质膜的主要功能概括如下：(1)为细胞的生命活动提供相对稳定的内环境;(2)选择性的物质运输，包括代谢底物的输入与代谢产物的排除，其中伴随着能量的传递；(3)提供细胞识别位点，并完成细胞内外信息跨膜传递；(4)为多种酶提供结合位点，使酶促反应高效而有序地进行；(5)介导细胞与细胞、细胞与基质之间的连接;质膜参与形成具有不同功能的细胞表面特化结构。
2膜蛋白虽动物细胞主要有9种膜脂，而膜蛋白的种类繁多，多数膜蛋白分子数目较少，但却赋予细胞膜非常重要的生物学功能。
根据膜蛋白分离的难易及其与脂分子的结合方式，膜蛋白可分为两大类型：外在膜蛋白、内在膜蛋白。
(1)外在膜蛋白为水溶性蛋白，靠离子键或其它较弱的键与膜表面的蛋白质分子或脂分子结合，因此只要改变溶液的离子强度甚至提高温度就可以从膜上分离下来，膜结构并不被破坏。
(2)内在膜蛋白与膜结合非常紧密，一般讲只有用去垢剂(detergent)使膜解后才可分离出来。
获得大量有生物学活性的质膜蛋白对我们显得非常的重要。
附注：使用分级抽提方法获得的“膜蛋白”中只有很少一部分是具备多跨膜区的整和膜蛋白，膜蛋白，到目前为止，仍然是蛋白组学的一个瓶颈，不管采用２－Ｄ技术也好，ＩＣＡＴ乃至proein microarray都还不能有效解决这一问题。
膜蛋白的提取方法
膜蛋白的提取方法
膜蛋白的提取方法通常包括以下几个步骤：
1. 细胞裂解：将包含膜蛋白的细胞或组织用不同的方式进行裂解，例如超声波处理、酸碱处理、高压处理等。
2. 膜蛋白分离：通过离心、过滤等方法将膜蛋白分离出来。
3. 纯化：采用膜层联萃取、柱层析、电泳等方法对膜蛋白进行纯化。
4. 确认：通过蛋白质定量、SDS-PAGE、Western blot等方法验证膜蛋白的存在和纯度。
常见的膜蛋白提取方法有：
1. 酸性洗涤法：利用低pH值时，膜蛋白和膜脂亲性增强的特性，将细胞裂解物在酸性条件下洗涤获得膜蛋白。
2. 有机溶剂提取法：利用膜蛋白亲性较强的有机溶剂，如丙酮、甲醇等，将膜蛋白从细胞裂解物中提取出来。
3. 离心法：通过离心分离膜细胞，从而获得膜蛋白。
4. 免疫亲和层析法：利用特异性抗体将目标膜蛋白从混合蛋白中分离纯化。
以上方法的选择需根据具体情况来定，不同的细胞类型或膜蛋白性质有着不同的最佳提取方法。
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膜蛋白的提取与分离膜蛋白的分离一、简介：1细胞质膜资料1895年,0verton从研究细胞透性得出"细胞膜由连续的脂类物质组成"。
1925年Gorter&Grendel: 用脂单分子膜技术测定细胞膜中脂分子的总面积，提出："细胞膜是由双层脂分子组成"。
1935年Danielli&Davson ：从测定膜的表面张力得出细胞膜的"三明治结构模型"，即蛋白质－脂-蛋白质。
1959年Robertson: 用电镜观察生物膜提出"单位膜模型"，将膜的分子结构与超微机构统一起来厚度：2(暗)+( 亮)+2 (暗) =细胞质膜的主要功能概括如下：(1) 为细胞的生命活动提供相对稳定的内环境;(2) 选择性的物质运输，包括代谢底物的输入与代谢产物的排除，其中伴随着能量的传递；(3) 提供细胞识别位点，并完成细胞内外信息跨膜传递；(4) 为多种酶提供结合位点，使酶促反应高效而有序地进行；(5) 介导细胞与细胞、细胞与基质之间的连接;质膜参与形成具有不同功能的细胞表面特化结构。
2膜蛋白虽动物细胞主要有9种膜脂，而膜蛋白的种类繁多，多数膜蛋白分子数目较少，但却赋予细胞膜非常重要的生物学功能。
根据膜蛋白分离的难易及其与脂分子的结合方式，膜蛋白可分为两大类型：外在膜蛋白、内在膜蛋白。
(1) 外在膜蛋白为水溶性蛋白，靠离子键或其它较弱的键与膜表面的蛋白质分子或脂分子结合，因此只要改变溶液的离子强度甚至提高温度就可以从膜上分离下来，膜结构并不被破坏。
(2) 内在膜蛋白与膜结合非常紧密，一般讲只有用去垢剂(detergent)使膜解后才可分离出来。
获得大量有生物学活性的质膜蛋白对我们显得非常的重要。
附注：使用分级抽提方法获得的膜蛋白”中只有很少一部分是具备多跨膜区的整和膜蛋白，膜蛋白，到目前为止，仍然是蛋白组学的一个瓶颈，不管采用2—D技术也好，ICAT乃至proein microarray都还不能有效解决这一问题。
二、蛋白抽提三、谈及蛋白分离，我们想到：超速离心，盐析法、超滤法、凝胶过滤法、等电点沉淀法、离子交换层析、亲和层析、吸附层析、逆流分溶、酶解法……有时这些方法常常组合到一起对特定的物质进行分离纯化。
由于蛋白质种类繁多，不同的蛋白质由于结构和组成的差异，其溶解度也各不相同.根据蛋白质的溶解特性，同时可选择不同的溶剂提取，分为水溶液提取和有机溶剂提取.四、但是针对膜蛋白的提取与细胞质蛋白，核蛋白提取不同之处在于它是嵌在膜中的，水溶性不好，基本方法就是用不同的离心速度去掉胞质蛋白等，最后用去污剂把蛋白从膜中释放出来。
膜蛋白分离纯化的重要步骤是选择适当的增溶用表面活性剂，一般常用的有胆酸盐，CHAPS一种离子去污剂），Emulgen和Lubrol等表面活性剂。
五、1、分离膜蛋白的方法（原则性）：六、1）先分离膜，然后提取；如选用冷热交替法、反复冻融法、超声破碎法、玻璃匀浆法、自溶法和酶处理法使得细胞破碎，然后通过剃度离心得到含有膜蛋白的粗组分。
（例如：michael11 液氮研磨组织，加入匀浆缓冲液及蛋白酶抑制剂。
差速离心。
蔗糖密度梯度离心。
收集37% 与41%间的成分，即为质膜部分。
裂解即可收集膜蛋白）七、2）用特殊的去污剂选择性的分离。
从膜上提取蛋白有许多困难在多数情况下，都是采用去垢剂将疏水蛋白从其膜结构中溶解下来，然后将蛋白质稳定.去垢剂的选择通常是依据他对所需要蛋白质的提取效率来确定，但在某些情况下，还要考虑到以后的纯化步骤. 虽然许多膜蛋白必须在去垢剂存在的情况下进行纯化，但最终仍可能需要除去去垢剂.这常常会引起蛋白质失活，但如果蛋白质是用于测序的，他将不是一个问题. 如果不是用于测序的，可考虑使用能够黏附去垢剂的疏水珠.许多文献和生化试剂供应商的产品目录中，都介绍有许多种不同的可用来溶解膜蛋白的去垢剂.然而，他们并不是普遍适用的. 在设计膜蛋白溶解方案时，必须考虑某一去垢剂的特殊性质. 如triton X-100 在280nm处有吸收，如果某蛋白质的测试与280nm处的吸收有关，就应避免使用这类去垢剂.八、将膜制剂与胞质蛋白及细胞核分离后，再进一步从细胞膜制剂中将所需的膜蛋白增溶下来.这种做法的好处是可以用强烈的去垢剂提取细胞骨架的相关蛋白，而无需考虑胞质蛋白、细胞核成分或染色质成分的混入.使用这种方法所获得的膜蛋白，无论在种类上还是数量上，都比酸溶解法所得到的蛋白( <5000Da )要多.一般提取的膜蛋白量往往只占膜蛋白总量的不足% ，所以充分的膜蛋白的提取，无疑对于研究膜蛋白的结构和功能都是非常重要的.第二种方法简单，可靠，但有时含有其他蛋白。
一般的都是利用4度时所有的蛋白质原则上都溶于Trit on X114水溶液，在温度超过20度时，此溶液分为水相和去污相；此时亲水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污剂相中。
利用此性质可提取膜蛋白。
九、 3 ）膜蛋白色谱（Chromatography of MembraneProtei n, CMP）CMP+分离强疏水性蛋白、多肽混合物的层析系统，一般有去垢剂（如SDS）溶解膜蛋白后形成SDS-融膜蛋白，并由羟基磷灰石为固定相的柱子分离纯化。
羟基磷灰石柱具有阴离子磷酸基团（P- 端），又具有阳离子钙（C-端）,与固定相结合主要决定于膜蛋白的大小、SDS结合量有关。
利用原子散射法研究cAMP的分离机制发现，样品与SDS结合后在离子交换柱上存在SDS分子、带电荷氨基酸与固定相中带电离子间的交换，从而达到分级分离的目的。
十、层析柱提取（参步骤）十二、4）顺序抽提法：根据细胞蛋白溶解性的差异，用具有不同溶解能力的蛋白溶解液进行抽提的方法。
用Tris 碱溶液裂解细胞提取高溶解性蛋白；把未溶解的pellet 用标准液溶解提取高疏水性蛋白；最后用含复合表面活性剂的蛋白溶解液，最后可以再次抽提前两次抽提后不能溶解的膜蛋白。
十三、5）centrifugal protein extraction .离心的CellsT HE extractionlOmjn vortex, 40 intervals sonjfieabonIcentrifugeIDiwh 12h OOQg, 25*CI Icytosol pelletIUrea/Th^urea extraction10rnin vortex. 40 intervals sonrficationIcentnfuge10^^,12.0009, 25*Cmembrane fraction pellet原理：高渗的蛋白裂解液让细胞溶涨破裂后，超高速离心评价：尽管分级（胞浆和胞膜）之间有清洗的步骤，但是可溶蛋白组分和膜蛋白组分之间仍然有不少重复的点•该方法相较MOLLOY MP教授在1998年electrophoresis上发表的分级抽提法减去了第一步（用tris抽提水溶性蛋白）和最后一步（极难溶蛋白）,在操作上也作了简化，总而言之是一种不错的方法。
（codegreen）6）detergent- based :提取时先裂解液裂胞膜（选用不同的去污试剂是关键），梯度离心分离细胞器（ER），然后分级抽提方法。
例如，去掉细胞器之后的DEBRIS 就是核膜，再裂解得到核膜蛋白。
而膜蛋白是裂胞膜时不溶的部分。
总的感受：细胞的量要很充足。
之后的定性鉴定常用的方法有双向免疫扩散、免疫电泳及聚丙稀酰胺凝胶电泳等。
纯化蛋白质浓度的定量测定可用双缩脲法、酚试剂法或紫外光吸收法定量鉴定膜蛋白，方便迅速。
到目前为止，提取膜蛋白仍然是蛋白学的一个瓶颈。
2、分离膜蛋白的方法（操作）1）分离细胞膜蛋白的方法：1冰上刮下细胞后将细胞溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液 A 中，于室温与液氮罐中反复冻融2次。
2 5000 转4度离心，驱除核及未裂解的细胞。
3取上清12000转4度离心10分钟取沉淀溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液B 中。
4 12000转4度离心10分钟取沉淀溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液C中提取后测蛋白浓度，SDS-PAGE电泳，分装后-20度保存备用。
buffer A : 1mMkcl,5mMNacl,3mM Mgcl2,50mM Hepes,1mM DTT,ml Leupeptin,20uM pmsf（PH=buffer B : 1mMkcl,5mMNacl,3mM Mgcl2,50mM Hepes,1mM DTT,ml Leupeptin,20uM pmsf（PH= 1mM EGTAbuffer C : ml Leupeptin,20uM pmsf,50mMTris-cl（PH=,2）分离细胞膜蛋白的方法：1、细胞放在冰上，去除上清，用pH7。
4的冷磷酸盐缓冲液洗涤单层细胞两次2、加入1ml2%TritonX 溶液冰浴15min3、刮下单层细胞，4度下10 000g 5min 离心4、溶液37度水浴1 0min 以分离水相和去污剂相，然后37度下2 000g 离心5min5、收集水相留作分析6、用500ul 冰冷的buffer C 溶解去污剂相沉淀，冰浴2min 后加温，在按步骤6再次离心7、按步骤8再次抽提去污剂相，用buffer C 将洗涤后的去污剂相稀释到初始体积8、用等量的buffer A 分别稀释水相与去污相，并进行免疫沉淀实验试剂：1 、2%tritonX114:2%TritonX114 、50mmol/L Tris HCl （pH7。
5）、蛋白酶抑制剂2、缓冲液A （含0。
5mol/LNaCI 的RIPA buffer）3、b uffer C10mmol/L Tris HCl150mmol/L NaCl5mmol/L EDTA3）分离细胞膜蛋白的方法：7M urea2M thiourea4%chaps%sb3-101000000 个细胞，可用此buffer 1ml 。
冰浴匀浆。
冰上置30分钟。
4度高速低温离心30min 。
取上清-20保存。
4) 分离组织膜蛋白的方法：1、取组织，加入10ml Buffer A 于冰上充分匀浆。
2、J6-HC离心机800rpm , 4C离心10min后，所得上清液转入超速离心管。
3、l OOOOOg , 4C离心1hr。
弃去上清，沉淀用适量的Buffer B重悬，冰上孵育2hr后分装至EP管，Eppendorf台式离心机10000rpm，4 °C 离心30min 。
4、收集所得上清液即为膜组份。
Buffer A :蔗糖，5mM Tris-HCl (PH ) , 120mM KCl, 1mM EDTA,1mM EDTA, PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/mlAprotinin 。